Zstandaryzowany protokół oceny toksyczności kadmu w ludzkich organoidach jelita grubego za pomocą testu żywotności opartego na luciferase

Podsumowanie

Protokół ma na celu utworzenie ludzkich organoidalnych jelit grubych i ocenę opartego na luciferase testu bioluminescencji ATP do wykrywania toksyczności indukowanej kadmem. Ocenia wykonalność i wrażliwość testu poprzez ilościową ocenę zmian w żywotności organoidalnej zależnych od dawki i czasu.

Streszczenie

Kadmi (Cd) jest klasyfikowany jako czynnik rakotwórczy grupy 1 i stanowi poważny globalny problem środowiskowy. Niniejsze badanie miało na celu stworzenie ludzkiego modelu organoidów jelita grubego oraz ocenę wykonalności i wrażliwości testu bioluminescencji ATP opartej na luciferase w wykrywaniu toksycznych reakcji organoidów jelita grubego (CO) na ekspozycję na Cd. Komórki macierzyste zostały izolowane z ludzkiego tkanki jelita grubego i hodowane w trójwymiarowym macierzy bazalnej membrany w celu wygenerowania CO. Organoidy były traktowane szeregiem stopniowanych stężeń Cd przez różne czasy ekspozycji. Świetlisty reagent do oceny żywotności dodawano w równych proporcjach objętościowych, delikatnie mieszano poprzez kołysanie w temperaturze pokojowej, aby promować lizę i penetrację reagentu, a następnie inkubowano, aby umożliwić przebieg reakcji bioluminescencyjnej. Świetlistość rejestrowano w trybie luminecencji na multi-mode czytniku płytek. Pasowanie krzywej dawkowo-odpowiedzi zostało użyte do obliczenia stężenia hamującego o połowie efektu oraz do oceny zmian w żywotności lub względnej żywotności. Pierwotne komórki macierzyste zostały pomyślnie izolowane z ludzkiego tkanki jelita grubego i wykorzystane do wygenerowania CO. Ekspozycja na Cd prowadziła do zależnych od dawki i czasu zmniejszeń aktywności metabolicznej organoidów; analiza dawkowo-odpowiedzi dała krzywe przeżywalności i wartości IC50 dla organoidów. Niniejsze badanie dostarcza wskazówek metodologicznych i praktycznych w zakresie wykorzystywania ludzkich CO w badaniach toksykologii metali ciężkich w środowisku.

Wprowadzenie

Cd jest naturalnym metalem ciężkim klasyfikowanym jako czynnik rakotwórczy grupy 1 i stał się globalnym problemem środowiskowym¹. Ekspozycja ludzka na Cd zachodzi głównie przez wdychanie i przyjmowanie z pokarmem. Chociaż przewlekła ekspozycja na niskie dawki wiąże się z szeregiem niekorzystnych skutków zdrowotnych, znaczne ograniczenie jego użycia i uwalniania do środowiska pozostaje wyzwaniem^2,3. Tradycyjne dwuwymiarowe kultury rosną na płaskich podłożach i nie posiadają architektonicznego ułożenia tkanki, polaryzacji komórkowej ani mikrośrodowiska nowotworu. W konsekwencji posiadają ograniczoną zdolność do odzwierciedlenia heterogeniczności in vivo oraz autentycznych reakcji toksykologicznych na ekspozycję na kadm⁴. Takie systemy nie mogą adekwatnie modelować interakcji komórka-komórka, wzrostu zależnego od matrycy, ani procesów biologicznych leżących u podstaw rozwoju oporności na leki⁵. Trójwymiarowe systemy organoidalne pochodzące z tkanek pacjentów oferują bardziej fizjologicznie odpowiedni model w porównaniu z konwencjonalnymi dwuwymiarowymi liniami komórkowymi⁶. Organoidy zachowują cechy genomowe, organizację histologiczną i stany funkcjonalne tkanki pierwotnej. Umożliwia to dokładniejsze modelowanie wzrostu nowotworu, ewolucji i wrażliwości na toksyczność kadmu, zapewniając wyraźne zalety dla modeli chorobowych i badań toksykologicznych⁷. CO posiadają złożoną trójwymiarową architekturę, heterogeniczność komórkową i wrodzone zdolności samoodnawania i samoorganizacji^8,9. Przeszczepienie CO do mysich odbiorców może promować samoodnawanie komórek macierzystych jelit i modulować mikrośrodowisko odpornościowe gospodarza, wywierając działanie ochronne⁴. W 2009 roku Sato i wsp. jako pierwsi wykazali, że pojedyncza komórka macierzysta jelit dorosłych Lgr5⁺ może spontanicznie samoorganizować się i różnicować, tworząc struktury krypt-włosowatych, które obejmują wszystkie linie komórek jelit¹⁰.

Nabłonek jelitowy stanowi pierwszą linię obrony przed toksycznością Cd po spożyciu. W rzeczywistości, biodostępność ustna Cd wynosi zazwyczaj poniżej 5%. Toksyczność jelitowa wywołana przez Cd charakteryzuje się rozpadem połączeń międzykomórkowych, zwiększoną przepuszczalnością parakomórkową i wywołaniem reakcji zapalnych. Ponadto, Cd zakłóca funkcję odporności jelit i zmienia skład oraz homeostazę mikroflory jelitowej¹¹. W zależności od dawki i czasu ekspozycji, Cd może powodować dysregulację cyklu komórkowego, sprzyjając fenotypom onkogennym w niektórych kontekstach, podczas gdy w innych indukuje apoptozę. Cd może pośrednio stymulować produkcję ROS (reaktywnych form tlenu), wywołując stres oksydacyjny i nierównowagę redoks. Funkcjonowanie receptorów, kinaz, fosfataz, proteaz, cząstek adhezyjnych i czynników transkrypcyjnych może być modulowane poprzez sygnalizację redoks. Cd również zakłóca kaskady sygnałowe, zmieniając status aktywacji ERK1/2, JNK (c-Jun N-końcowa kinaza) i p38 MAPK (p38 mitogen-aktywowany białkowy kinaz) w wielu typach komórek¹². Aktywując ERK1/2 w kaskadzie MAPK, Cd może promować proliferację i przetrwanie komórek, hamować zaprogramowaną śmierć komórkową i przyczyniać się do nieprawidłowej nadmiernej proliferacji¹³. Cd może bezpośrednio lub pośrednio regulować ekspresję i aktywność kluczowych białek efektorowych. Na przykład, hamuje on supresor tumorowy p53 i wzmaga anty-apoptotyczne białka takie jak Bcl-2 i Bcl-xL, ostatecznie zakłócając apoptozę i homeostazę cyklu komórkowego¹⁴.

W modelach CO stosowanych do oceny cytotoksycznych efektów Cd, pomiar zawartości ATP jest szeroko stosowany do oceny żywotności organoidalnej. ATP, centralna cząsteczka metabolizmu energetycznego, bezpośrednio odzwierciedla ogólny stan metaboliczny i żywotność organoidalną. Po ekspozycji na kadm w CO, Cd przede wszystkim powoduje dysfunkcję mitochondriów, nasila stres oksydacyjny i zakłóca homeostazę energetyczną organoidalną. Te zdarzenia łącznie pogarszają produkcję ATP i ostatecznie zmniejszają żywotność organoidalną. Dlatego zmiany w poziomach ATP służą jako wyraźny funkcjonalny wskaźnik cytotoksyczności wywołanej przez kadm. Konwencjonalne testy cytotoksyczności obejmują kolorymetryczne testy MTT/CCK-8, barwienie Live/Dead oraz analizy oparte na cytometrii przepływowej. W porównaniu z tymi metodami, testy oparte na ATP oferują wyraźne zalety w trójwymiarowym systemie organoidalnym. Ze względu na złożoność strukturalną i wyraźną przestrzenną heterogeniczność organoidalną, tradycyjne podejścia do barwienia i obrazowania są często ograniczone przez nieodpowiednie przenikanie tkankowe i zmniejszoną dokładność ilościową. W przeciwieństwie do tego, testy ATP opierają się na reakcji bioluminescencyjnej katalizowanej przez lucyferazę świetlnicy, umożliwiając bezpośrednie ilościowe pomiary bez zakł

Protokół

Eksperyment został zatwierdzony przez Komitet Etyczny Suzhou Vocational Health College (Numer zgody SWYXLL202516) i został przeprowadzony zgodnie ze standardami etycznymi medycyny. Wszystkie osoby biorące udział w badaniach wyraziły pisemną zgodę na uczestnictwo po zapoznaniu się z treścią.

1. Izolacja ludzkiego tkankowego komórkowego kolorektalnego i utworzenie COs

1. Transport i przechowywanie próbek tkankowych
   1. Przed eksperymentem, powoli rozmrażać matrycę błony podstawnej w 4 °C, i zrównoważać wymagany medium kultury do temperatury pokojowej.
   2. Natychmiast umieścić ludzką tkankę kolorektalną uzyskaną z procedur klinicznych do wstępnie schłodzonego roztworu do przechowywania tkanek (2–8 °C).
      UWAGA: Upewnić się, że tkanka pozostaje w całości zanurzona podczas transportu. Przenieść próbki do laboratorium.
2. Pod biobezpieczną szafą, umieścić tkankę w 6 cm naczyniu hodowlanym do oceny. Ostrożnie usunąć widoczną tkankę tłuszczową i warstwy mięśniowe za pomocą skalpela i kleszczy, zachowując elementy nabłonkowe.
3. Przeniesienie tkanki do 6 cm naczynia zawierającego 3 mL buforowanego fosforanem fosforanowego (PBS) uzupełnionego o 300 µL antybiotyków. Pokroić tkankę na fragmenty o wymiarach 2 mm × 5 mm.
4. Przeniesienie fragmentów tkanki do 50 mL probówki do wirówki.
5. Dodać 10 mL wstępnie schłodzonego PBS i 200 µL 0,5 M EDTA (stężenie końcowe ~10 mM) do probówki.
6. Umieścić probówkę na wstrząsaczu w temperaturze pokojowej i delikatnie agitować ją z siłą 0,072 g przez 15 min.
7. Użyć kleszczy do przeniesienia tkanki do naczynia hodowlanym i zbadać ją pod mikroskopem. Przejść do następnego kroku, gdy struktury krypt staną się widoczne lub zaczną się odczepiać.
   UWAGA: Kiedy struktury krypt staną się widoczne pod mikroskopowym obserwacją po leczeniu EDTA, trawienie osiągnęło ogólnie wystarczający poziom dla izolacji krypt, a krypty zaczynają się odczepiać od rozluźnionych fragmentów nabłonka tkankowego. Całostliwe krypty zazwyczaj zachowują dobrze zdefiniowaną morfologię gruczołową lub rurkowaną z wyraźnym światłem centralnym, podczas gdy nadmierne trawienie powoduje dużą liczbę rozdzielonych pojedynczych komórek i martwego szczątku.
8. Zakończyć trawienie, gdy wiele całostliwych krypt stanie się widoczne, a fragmenty tkanki staną się luźne i przezroczyste, umożliwiając delikatne pipetowanie, aby łatwo uwolnić krypty.
   UWAGA: Przedłużone inkubacja EDTA niszczy integralność krypt, zwiększa akumulację osadów komórkowych i zmniejsza żywotność komórek macierzystych jelit, zmniejszając tym samym wydajność formowania organoidów w dalszej kolejności.
9. Dodać 15 mL antybiotycznie uzupełnionego PBS, aby zatrzymać trawienie EDTA. Delikatnie wymieszać.
10. Wirować próbkę przy 300 × g przez 3 min w 4 °C.
11. Usunąć nadstan.
12. Dodać 1 mL pełnego medium komórkowego i przenieść zawiesinę do 1,5 mL mikroprobówki.
13. Wirować zawiesinę przy 300 × g przez 3 min i wyrzucić nadstan.
14. Dodać 500 µL matrycy błony podstawnej do 1,5 mL mikroprobówki i dokładnie wymieszać.
15. Minimalizować ekspozycję na temperaturze pokojowej podczas mieszania i trzymać matrycę błony podstawnej na lodzie, aby zapobiec przedwczesnemu stwardnieniu.
16. Dodać 25 µL mieszanki kroplą do każdej komórki 24-dołkowego płytki, aby utworzyć kroplę.
17. Odwrócić 24-dołkową płytkę i inkubować ją w 37 °C z 5% CO₂ przez 20 min.
18. Dodać 600 µL medium kultury CO do każdej komórki.
19. Uzyskać medium kultury organoidów kolorektalnych i reagenty dysocjacji z komercyjnych źródeł i używać ich w ścisłym zgodności z instrukcjami producenta.
20. Aby przygotować pełne medium do hodowli komórek, uzupełnić 500 mL podstawowego medium DMEM o 50 mL surowicy wołowej płodowej (FBS) i 5 mL penicyliny-streptomycyny. Delikatnie wymieszać roztwór przez inwersję.

2. Ocena wrażliwości COs narażonych na Cd

1. Hodowla i kultura COs w 96-dołkowych płytkach
   1. Wyrzucić medium kulturowe z każdej komórki i dodać 500 µL roztworu do dysocjacji organoidów. Delikatnie pipetować w górę i w dół, aby rozproszyć matrycę błony podstawnej.
   2. Umieścić traktowane płytki do inkubatora 37 °C, 5% CO₂ do trawienia, z początkowym czasem trawienia 10 min.
   3. Zebrać roztwór trawienia z każdej komórki 24-dołkowej płytki do 15 mL prob

Wyniki

Utworzenie ludzkich organoidów jelita grubego
Z powodzeniem wyizolowano struktury krypt jelita grubego z próbek tkanek, a typową morfologię krypt wyraźnie zaobserwowano zarówno w mikroskopii przy małym, jak i dużym powiększeniu. Podczas hodowli in vitro wyizolowane krypty stopniowo powiększały się i wykazywały uporządkowany proces dojrzewania morfologicznego (Rysunek 1A,B). W 3. i 6. dniu hodowli utworzyły się strukturalnie nienaruszone organoidy jelita ...

Dyskusja

Niniejsze badanie ustanawia ustandaryzowany protokół ekspozycji na kadm oraz testów żywotności ATP z wykorzystaniem CO w celu oceny wpływu kadmu na żywotność organoidów. Protokół ten optymalizuje w szczególności etapy dysocjacji organoidów i wysiewania do płytek 96-dołkowych, aby zwiększyć powtarzalność eksperymentalną oraz stabilność późniejszych odczytów testu ATP. Chociaż obecny protokół eksperymentalny koncentruje się przede wszystkim na stworzeniu 3D modelu organoidów raka jelita grubego do oceny toksyczności Cd, sz...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
100 μm cell strainer	BIOLOGIX	15-1100
15 mL centrifuge tubes	BIOFIL	CFT011150
1mL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808633
200 μL pipette tips	Zhejiang Baidi Biotechnology Co., LTD	H808214
24-well plates	Corning Incorporated	3524
50 mL centrifuge tubes	CLUXCELL	321050
96-well plates	Corning Incorporated	220400
BioTek Cytation 5	BioTek Co., LTD	16280004	Oprogramowanie operacyjne dla specyficznego czytnika mikroplatek.
Cadmium chloride,10g	Sigma	202908-10G
Cell Counting-Lite 3D Luminescent Cell Viability Assay	Vazyme	DD1102-01/02/03	Środek luminescencyjny do badania żywotności komórek w proporcji objętości 1:1.
Human Colonic organoid Kit Plus(Expansion)	Mogenel Biotechnology	MA-0817HOO1HLP
Dulbecco’s Modified Eagle Medium	thermo fisher	6125552
Forceps	Beyotime	FS019
Ice box	Beyotime	FBX078
Low-temperature high-speed centrifuge	Anhui Zhongke Zhongjia Scientific Instrument Co., LTD	KDC-40
Matrigel	Mogenel Biotechnology	82755	Matryca błony podstawnej
Organoid Dissociation Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L01L	Roztwór do dysocjacji organoidów
Penicillin-Streptomycin	Beyotime	C0222
Phosphate-buffered saline (1XPBS)	Fdbio Science Biotech Co.,Ltd	FD7032
Pipettes	RUINING	Pipet-Lite XLS
GraphPad Prism 8.0	GraphPad Software		Oprogramowanie operacyjne dla specyficznego czytnika mikroplatek.
Scissors	Beyotime	FS001
Tissue Digestion Solution	Mogenel Biotechnology	MB-0818L06L/MB-0818L06S