Platforma elektroporacji cyfrowej mikrofluidycznej do edycji genomu CRISPR z niskim wejściem i transfekcji mRNA w zawiesinach limfocytów T oraz modelach komórkowych 3D

Podsumowanie

Ten protokół opisuje zminiaturyzowaną edycję genomu CRISPR–Cas9 receptora TCRα/β w pierwotnych ludzkich komórkach T za pomocą ‘DMF-ekcji’, platformy elektroporacji cyfrowych mikrofluidów (DMF). Metoda umożliwia równoległą edycję genów z małym zapotrzebowaniem na wysoką żywotność i jest ponadto przystosowana do dostarczania mRNA do wielowarstwowymi 3D kulistości.

Streszczenie

Cyfrowa mikrofluidyka (DMF) umożliwia precyzyjne, małoobjętościowe manipulowanie genetyczne komórek ssaczych, minimalizując jednocześnie wpływ komórkowy do 100x i zachowując żywotność. Niniejsze badanie przedstawia przepływowy proces transfekcji oparty na DMF do CRISPR-pośredniczonego nokautowania locus TRAC w pierwotnych ludzkich komórkach T zawiesinowych oraz do transfekcji mRNA trzech wymiarowych sferoidów HEK293T. Wykorzystując przestrzennie zdeponowane krysprorny RNA przewodnik i montaż rybonukleoproteiny (RNP) na wkładce, uzyskano efektywne uszkodzenie locus TRAC zarówno w populacjach komórek CD4⁺ jak i CD8⁺, używając tylko 10 000 komórek na warunek, przy czym żywotność po edycji przekraczała 85%. Charakterystyka biofizyczna za pomocą analiz indukowanych przepływem i dyfuzji Taylora wykazała, że dodatki polimerowe stabilizują kompleksy Cas9-sgRNA w warunkach buforu elektroporacyjnego, co wspiera reproduktywalne edycje w objętościach poniżej mikrolitara. Proces został również zaadaptowany do zastosowań 3D poprzez dostarczenie mRNA EGFP do nienaruszonych sferoidów HEK293T, co skutkowało mocną i przestrzennie jednolitą fluorescencja bez upośledzenia wzrostu czy morfologii sferoidów. Razem wyniki te pokazują, że elektroporacja DMF umożliwia efektywne edycje genomu i dostarczanie mRNA zarówno dla komórek odpornościowych w zawiesinie, jak i dla wielocząsteczkowych sferoidów. Ta platforma zapewnia skalowalne i nisko-inputowe rozwiązanie dla zastosowań w terapii CAR-T, funkcjonalnej genomice oraz zaawansowanych 3D modelach komórkowych.

Wprowadzenie

Edycja genów w komórkach pierwotnych człowieka staje się coraz bardziej centralna zarówno w rozwoju terapii, jak i w badaniach podstawowych, w tym w zastosowaniach inżynierii immunologicznej, modelowaniu rzadkich chorób i genomice funkcjonalnej¹. Chociaż elektroporacja umożliwia bardzo wydajne edycję genomu, konwencjonalne systemy oparte na cuwetach zazwyczaj wymagają do milionów komórek na warunek, co ogranicza ich zastosowanie do próbek pochodzących od pacjentów i rzadkich populacji immunologicznych². Ponadto systemy te są słabo przystosowane do przesiewowych badań na dużą skalę ze względu na ograniczenia dotyczące przepustowości, automatyzacji i zużycia reagentów³.

Mikrofluidyczna elektroporacja stała się obiecującym podejściem do edycji genomu z małymi zasobami⁴. Jednak większość istniejących platform opiera się na architekturach o ciągłym przepływie, które wymagają złożonego przetwarzania płynów, ograniczonej elastyczności w mieszaniu reagentów i stosunkowo wysokich wymagań dotyczących liczby komórek na warunek. W przeciwieństwie do tego, mikrofluidyka cyfrowa (DMF) umożliwia aktywne sterowanie dyskretnymi kroplami o objętości nanolitrów na płaskiej tablicy elektrod, pozwalając na precyzyjną kontrolę nad składem reakcji, czasem i lokalizacją przestrzenną. Ten format oparty na kroplkach typu plug-and-play jest dobrze przystosowany do nisko-wolumenowych, wysoko-przepustowościowych przepływów pracy, w których konserwacja pierwotnych komórek i reagentów jest istotna⁵.

Ostatnie prace wykazały wykonalność dostarczania wewnątrzkomórkowego opartego na DMF za pomocą architektur elektroporacji trójkropkowej, które generują zlokalizowany, niskoprądowy elektroporacji generujący pola elektryczne dla efektywnego dostarczania RNP i mRNA, minimalizując stres termiczny i elektrochemiczny^6,7,8. Budując na tej podstawie, stworzona została platforma elektroporacji DMF nowej generacji, zwana ‘DMF-ection’, która obejmuje 48 niezależnie adresowalnych miejsc reakcji, pełną kompatybilność z automatyzacją oraz skalowalną produkcję kaset⁹ (Rysunek 1). Kasetka DMF składa się z dolnej płyty PCB i plastikowej górnej płyty oddzielonych uszczelką, złożonych za pomocą uchwytów mocujących w pojedynczej poprawnej orientacji (Rysunek 1A). Układ 48-pozycyjny jest zorganizowany w ośmiu identycznych rodzinach (Rysunek 1A-H), z których każda zawiera sześć niezależnie adresowalnych miejsc elektroporacji, obsługujących do 48 warunków edycji równolegle na kasetce (Rysunek 1B). Biblioteki RNA przewodników są zdeponowywane na powierzchni podłoża za pomocą akustycznego dozownika przed złożeniem kasetki. Dokładność pozycyjna depozycji została potwierdzona dla wszystkich 48 miejsc, z pozycjami kropli skupiającymi się w odstępstwie poniżej milimetra od środka elektrod (Rysunek 1C), co wspiera niezawodne gromadzenie RNP na kasetce. Po załadowaniu komórki i krople elektrod płynowych są aktywne na kasetce, tworząc geometrię elektroporacji trójkropek (Rysunek 1D). Po elektroporacji komórki są rozładowywane do płytek hodowlanianych w celu regeneracji i analizy poniżej, w tym cytometrii przepływowej, sekwencjonowania i mikroskopii (Rysunek 1E). System ten umożliwia wydajną edycję genomu przy użyciu do 100-krotnie mniejszej liczby komórek niż standardowe metody oparte na cuwetach, znacznie poszerzając dostęp do inżynierii genomu w aplikacjach o niskiej liczbie komórek i wysokiej przepustowości.

Niniejsze badanie ocenia wydajność platformy poprzez dostarczanie wielu ładunków biomolekularnych, w tym kompleksów mRNA i kryspr-Cas9 rybonukleoproteinowych (RNP), osiągając efektywną transfekcję i zakłócenie genów. Oprócz pierwotnych komórek T, DMF-ection zapewnia ogólną ramę dostarczania kwasów nukleinowych do złożonych wielokomórkowych struktur. Trójwymiarowe (3D) sferoidy i modele organoidowe stanowią znaczne bariery dla przenikania reagentów ze względu na ich architekturę i delikatność, a konwencjonalne podejścia elektroporacji często zakłócają morfologię lub generują heterogeniczne dostarczanie. Aby ocenić, czy te same zasady miniaturyzacji elektroporacji stosowanej do edycji komórek T działają w tkankach strukturalnych, przepływ DMF został zastosowany do 3D sferoidów HEK293T. Te eksperymenty wykazały, że elektrozwilżanie oparte na DMF może delikatnie ustawić całe sferoidy w geometriach trójkropek i wspierać jednolite dostarczanie mRNA, zachowując strukturę i wzrost. Chociaż wyniki te wykraczają poza opisany tutaj protokół dotyczący komórek T, ilustrują szersze zastosowanie programowalnej elektroporacji DMF dla nowych 3D systemów komórkowych istotnych dla odkrywania leków i modelowania chorób.

Protokół

Pierwotne ludzkie komórki T użyte w tym protokole zostały uzyskane od komercyjnych dostawców na podstawie pisemnej zgody odbiorców i zgodnie z obowiązującymi wytycznymi instytucjonalnymi, etycznymi i regulacyjnymi. Wszelkie obchodzenie się z materiałami biologicznymi pochodzenia ludzkiego było prowadzone zgodnie z instytucjonalnymi protokołami bezpieczeństwa biologicznego. Badacze stosujący ten protokół są odpowiedzialni za zapewnienie, że ich użycie pierwotnych ludzkich komórek jest zgodne z wymaganiami lokalnej rady recenzji instytucjonalnej (IRB) lub komitetu etycznego, obowiązującymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego oraz wszelkimi odpowiednimi przepisami krajowymi lub regionalnymi regulującymi użycie ludzkiego materiału biologicznego. Żadne informacje identyfikujące pacjenta nie były związane z materiałem komórkowym użytym w tym badaniu.

1. Przygotowanie i aktywowanie pierwotnych ludzkich komórek T

1. Szybko odmrażać krioprzechowywane pierwotne ludzkie CD3⁺ komórki T w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Przenieść komórki do wstępnie podgrzanego podstawowego pożywka dla komórek T i wyśrodkować przez 10 min. przy 180 × g. Odrzucić nadstan i ponownie zawiesić osadut w świeżym pożywce.
2. Wyznaczyć stężenie komórek i ich żywotność za pomocą automatycznego licznika komórek.
3. Zawiesić komórki w stężeniu 1 × 10⁶ komórek/mL w pożywce do hodowli komórek T uzupełnionej rozpuszczalnym tetramerycznym przeciwciałem CD3/CD28 T-cell activator stimulus (zgodnie z instrukcjami dostawcy) i 200 IU/mL IL-2. Wyhodować komórki przez 72 h w 37 °C, 5% CO₂.
   UWAGA: Utrzymać stężenie komórek w zakresie 0,5–2 × 10⁶ komórek/mL podczas aktywacji. Przeprowadzić aktywację w 96-dołkowych płytkach z dnem w kształcie U w celu optymalizacji kontaktu komórek z aktywatorem i efektywności aktywacji.

2. Przygotowanie plamek RNA przewodnikowego na podłożu DMF (nakręcanie przez akustyczny dozownik)

1. Odtwarzać liofilizowano RNA przewodnikowe w wodzie wolnej od nukleaz do stężenia stockowego 100 µM. W osobnej probówce przygotować stockową 100 mg/mL kwasu poli-L-glutaminowego (PGA, sól sodowa, masa cząsteczkowa 15 000–50 000 Da) w wodzie wolnej od nukleaz. Połączyć RNA przewodnikowe i stock PGA w proporcji objętości 5:4 (RNA przewodnikowe: PGA), co daje ostateczne stężenie RNA przewodnikowego 55,6 pmol/µL i ostateczne stężenie PGA 44,4 mg/mL w wodzie wolnej od nukleaz. Skręcić krótko i wyśrodkować przez 30 s przy 1 000 × g i rozdzielić na jednorazowe objętości oraz przechowywać niezużyte alikwoty w temperaturze -80 °C przez maksymalnie 6 miesięcy.
   UWAGA: Unikać wielokrotnych cykli zamrażania i rozmrażania.
2. Dodać mieszankę przewodnika-PGA do płyty źródła akustycznego o małej objętości śmierci w dołkach odpowiadających pożądanemu układowi miejsc reakcji.
3. Przenieść 40 nL (równoważne 2,2 pmol RNA przewodnikowego) mieszanki przewodnika-PGA do każdego regionu docelowego plamki na podłożu DMF za pomocą skalibrowanego akustycznego dozownika.
   UWAGA: Przy 55,6 pmol/µL, 40 nL dostarcza 2,2 pmol RNA przewodnikowego na miejsce (55,6 × 0,040 = 2,22 pmol). Wysuszone przewodniki są odtwarzane podczas łączenia kropli na karcie; pełne zawieszenie jest potwierdzane przez jednolitą efektywność edycji w całym miejscu.
4. W szafce bezpieczeństwa biologicznego pozostawić plamki, aby całkowicie osuszyły się na powietrzu w temperaturze pokojowej, aż nie pozostanie widoczny płyn (około 5 min).
   UWAGA: Nie należy używać wymuszonego przepływu powietrza ani ciepła, ponieważ może to spowodować oderwanie lub degradację RNA przewodnikowego.
5. Złożyć kartridż DMF.
   1. W szafce bezpieczeństwa biologicznego wyrównać górną płytę nad nakrytym podłożem, dopasowując asymetryczne plastikowe elementy do pasowania od górnej płyty do wycięć na dolnej płycie. Nałożyć równomierną, jednoczesną nacisk wzdłuż krótkich krawędzi, aż poczuje się wyraźne mechaniczne zaciśnięcie, co potwierdza pełne zaangażowanie elementów zamykających.
      UWAGA: Kartridż jest zaprojektowany z jednym poprawnym ułożeniem; niewłaściwa montaż nie wytworzy zaciśnięcia. Zawsze trzymać podłoża za krawędzie, aby uniknąć skażenia lub uszkodzenia funkcjonalnych powierzchni i unikać przesuwania podłoży nawzajem, ponieważ może to zarysować powłoki powierzchniowe.
   2. Punkt kontrolny: Potwierdzić poprawne złożenie za pomocą mechanicznego zaciśnięcia.
      UWAGA: Nie ma wskaźnika elektrycznego poprzedzającego uruchomienie kontroli integralności powłoki; wszelkie awarie funkcjonalne wynikające z niewłaściwej montażu są automatycznie wykrywane i zgłaszane w raporcie QC po uruchomieniu.
      Punkt przerwy: Przechowywać

Wyniki

Oczekiwane wyniki
Elektroporacja 10 000 aktywowanych limfocytów T na warunek zazwyczaj skutkuje wydajnością knockoutu TRAC na poziomie >85% przy żywotności >95% 72 h po transfekcji. Cytometria przepływowa wykazuje wyraźną utratę barwienia TCRα/β w warunku celującym w TRAC w stosunku do kontroli z niecelującym sgRNA (NTC) oraz kontroli niewystawionych na działanie pól elektrycznych. O ile nie zaznaczono inaczej, n oznacza niezależne serie DMF-ection przeprowadzone w różne dni. Powtórzen...

Dyskusja

Ten protokół opisuje zminiaturyzowany przepływ mikrofluidycznej elektroporacji, który umożliwia wydajne dostarczanie substancji do komórek T pierwotnych u ludzi za pomocą kropli w skali nanolitrowej. Główną zaletą tej metody jest możliwość wykonywania edycji genomu CRISPR–Cas9 przy użyciu zaledwie 10 000 komórek na reakcję, co znacznie zmniejsza wymagania materiałowe w porównaniu z konwencjonalną elektroporacją. Oparta na kroplach architektura wspiera automatyzację, zapewniając powtarzalne obchodzenie się z reagentami i ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
12 Channel VOYAGER Adjustable Tip Spacing Pipette	Integra	4732	Instrumentation
1x PBS	Gibco		Flow Buffer
96 Well Plate, Sphera Low-Attachment Surface	Thermo Fisher	174927	Spheroid protocol
96-well conical-bottom plate	Sarstedt	82.1583.001	Spheroid protocol
Alexa Fluor 647 anti-human CD4 Antibody	Biolegend	357421	1 in 200, Clone A161A1
Attune Flow Cytometer	ThermoFisher		Instrumentation
DMEM Media	Gibco	10564011	Media Supplement- Spheroid culture
DMF compatible buffer	DropGenie		Transfection
DropGenie Transfection System	DropGenie		Instrumentation
Echo Acoustic Dispenser 650 Series	Beckman Coulter Life Scienes
Echo Qualified 384-well Low Dead Volume	Beckman Coulter Life Scienes
EDTA	Invitrogen		Flow Buffer
EGFP mRNA	Trilink	L-7201
EVOS Fluorescent Microscope	ThermoFisher		Instrumentation
Fetal Bovine Serum	Gibco	16000044	Media Supplement- Spheroid culture
Fida 1 instrument and Fida Neo 480 nm detector	Fida Biosystems ApS		Instrumentation
Ghost Dye Violet 510	Cytek Biosciences	13-0870
HEK293T Cells	ATCC		Spheroid protocol
Human IL-2 Recombinant Protein,	Peprotech	200-02 50ug	T cell media supplement
Human Primary Pan CD3+ T Cells	All Cells		Peripheral Blood, Cryopreserved, pan CD3+ Helper T Cells, Negatively Selected
Immunocult CD3/CD28 Activator	StemCell Technologies	10970	T Cell Activation media
Immunocult Expansion Media	StemCell Technologies	10981	T Cell Activation media
Incucyte Live Cell Analysis System	Sartorius		Instrumentation
INTEGRA ASSIST PLUS pipetting robot	Integra	4505, 4-Position Portrait Deck (PN 4521),	Instrumentation
non targeting synthetic guide RNA	Synthego		5’ GCACTACCAGAGCTAACTCA 3'
NucleoCounter NC-202	Chemometec
PE anti-human TCR α/β Recombinant Antibody	Biolegend	380805	1 in 200, Clone QA20B12
PE-Cy 7 Anti-Human CD8	BD Pharmingen	557750	1 in 200, Clone RPA-T8
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)	Gibco	15140122	Media Supplement- Spheroid culture
Poly-L-glutamic Acid (PGA)	Sigma Aldrich	P4761-100MG	Use a at 100mg/ml
Prism version 8.0.0	GraphPad Software, Inc.		Software
sNLS-SpCas9-sNLS Nuclease	IDT	10017687
Spheroid Microplate	Corning	3830	Spheroid protocol
Surfactant F	DropGenie		Transfection- use at 1:20 in DMF compatible buffer to make compete Transfection buffer
TRAC synthetic guide RNA	Synthego		5’ AGAGTCTCTCAGCTGGTACA 3'
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25-300-062	Spheroid protocol