Artykuł metodologiczny

Równoległe in vivo badanie wyłączania i aktywacji genów w gruczołach piersiowych myszy

DOI:

10.3791/71115

⸱

24 lipca 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Molecular and Systems Biology, Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital, 2Department of Molecular Genetics, University of Toronto, 3Donnelly Centre for Cellular and Biomolecular Research, University of Toronto

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ten protokół opisuje skalowalne podejście do wewnątrzkanalikowego przesiewania CRISPR, umożliwiające równoległe in vivo badania nad wyłączeniem genów i aktywacją w gruczołach piersiowych myszy.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ekrany genetyki przesunięte są rutynowo stosowane do zakłócania tysięcy elementów genetycznych w sposób zgrupowany w celu stworzenia dużych map związku genotyp-fenotyp. Chociaż często przeprowadzane są w systemach kultury komórkowej, rosnące dowody potwierdzają, że ekrany in vivo mają moc ujawnienia nowej biologii, której nie można odtworzyć in vitro. Jednak szerokie zastosowanie tego podejścia było ograniczone przez dwa główne wyzwania: dominujący skutek na zakłóceniach utraty funkcji zamiast aktywacji genów oraz znaczne trudności techniczne z dostarczeniem złożonych bibliotek genetycznych do określonych tkanek in vivo. Aby przezwyciężyć te wyzwania, opisujemy prostą i wszechstronną strategię iniekcji do przewodów, która umożliwia wydajne i szybkie przesiewowe badania genomowe w gruczołach piersiowych myszy poprzez generowanie dziesiątek tysięcy osobnych klonów nabłonkowych. Ponadto dostarczamy wszystkich szczegółów niezbędnych do generowania bibliotek, iniekcji do przewodów, rozwikływania ekranów i analizy bibliotek CRISPR-Knockout i Aktywacji dla kompleksowych ekranów in vivo. Korzystając z tych narzędzi, które nazwano CRISPR-KOALA (Test Związany z Knockoutem i Aktywacją), zidentyfikowaliśmy nowe supresory nowotworowe i onkogeny w genomie kodującym i niekodującym w zgrupowanych bibliotekach wahających się od 46 lokacji do piątej części genomu. Co ważne, to podejście i analiza mogą być zastosowane do innych narządów w celu badania funkcji biologicznych dowolnego genu podczas homeostazy lub choroby.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badania funkcjonalnej genomiki zapewniają potężną ramę do badania funkcji genów w skali1. Rozwój technologii edytacji genów CRISPR-Cas umożliwił systematyczne zakłócanie setek do tysięcy genów równolegle, a przesiewowe badania oparte na CRISPR w liniach komórek ssaków stały się filarem współczesnych badań nad biologią nowotworów2. Te in vitro podejścia zidentyfikowały geny niezbędne3, supresory nowotworowe4 oraz interakcje syntetycznie śmiertelne5 w różnorodnych kontekstach nowotworów. Jednak jednym z głównych ograniczeń jest niemożność uchwycenia złożonych biologicznych cech guzów in vivo, w tym interakcji z układem odpornościowym i stromą, gradientów składników odżywczych oraz struktury tkankowej w mikrośrodowisku2. Zgodnie z tym ograniczeniem, ostatnie badania wykazały, że wiele bona fide genów sterujących nowotworami nie wywiera mierzalnych efektów in vitro, zwłaszcza jeśli ich funkcja zależy od bodźców mikrośrodowiskowych, których brakuje w hodowli komórkowej6,7,8,9,10.

Grucz ssaków dostarcza unikalnie korzystnego kontekstu tkankowego do przesiewów funkcjonalnej genomiki in vivo. Komórki nabłonkowe gruczołu mlekowego są wysoce regeneracyjne, przechodzą kolejne rundy klonalnej ekspansji podczas cyklu estrusowego i są zorganizowane w rozgałęzioną sieć przewodów, która może być łatwo uzyskany i genetycznie manipulowany11,12,13. Te cechy wspierają dziesięciolecia mozaikowych analiz genetycznych i eksperymentów śledzenia linii i ustanawiają gruczoł mlekowy jako użyteczny system do badania funkcji genów intrinsycznych dla komórek i zależnych od mikrośrodowiska podczas homeostazy tkankowej i choroby14,15,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33. Co ważne, zakłócenia genetyczne mogą być ograniczone do nabłonkowego przedziału, umożliwiając bezpośrednie badanie nabłonkowych czynników transformacji, konkurencji komórkowej, wierności linii i progresji nowotworów w całym tkankowym kontekście.

Mimo że opracowano kilka strategii dostarczania zakłóceń genetycznych bezpośrednio do dorosłego gruczołu mlekowego in situ, pozostają znaczne trudności techniczne dla zastosowań wysokowydajnych. Dostarczanie adenowirusem rekombinazy Cre było szeroko stosowane do indukcji somatycznej rekombinacji warunkowych alleli w dorosłym gruczole mlecznym34,35,36,37, oferując wydajny sposób manipulacji funkcją genów bez złożonego hodowlano-genetycznego hodowania wymaganego dla tradycyjnych genetycznie zmodyfikowanych modeli myszy (GEMM). Podczas gdy adenowirus wysokiej titry może również dostarczyć komponenty CRISPR-Cas9 do komórek tkankowych, te wektory nie integrują się z genomem gospodarza38,39,40,41,42,43,44,45,46,47,48,49. To poważnie ogranicza skalę przesiewów do ~10–55 genów, ponieważ każde miejsce docelowe gRNA musi być sekwencjonowane indywidualnie za pomocą sond inwersji molekularnej38,39,40,41,42,43,44,45,46,47. Co więcej, obecnie stosowane metody dostarczania dokanałowego umożliwiają bezpośredni dostęp do dokanałowego układu gruczołu mlekowego, ale wymagają albo inwazyjnej ekspozycji chirurgicznej gruczołu mlekowego5

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z wytycznymi kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Centrum Fenogenomiki (protokół 26-0272H).

1. Klonyzacja bibliotek CRISPR

UWAGA: Ta sekcja opisuje skupione klonowanie bibliotek CRISPR knockout i CRISPR activation z oligonukleotydów syntetyzowanych w macierzy do wirusów lentycznych. Rutynowo generujemy biblioteki zawierające do 4000 gRNA, które mogą być badane z pokryciem 400x-1000x w 8-20 myszy. Liczbę gRNA i pokrycie można dostosować według potrzeb, co wpłynie na liczbę myszy wymaganą do utrzymania mocy statystycznej. Zalecamy utrzymanie minimalnego pokrycia 400x, które może być wystarczające dla silnych fenotypów zysk funkcji.

  1. Projektowanie bibliotek Guide RNA
    1. Skompiluj listę wszystkich genów myszy do przebadania w ramach pojedynczego eksperymentu do dalszego projektowania bibliotek CRISPR, utrzymując osobne listy celów dla bibliotek CRISPR knockout (CRISPR-KO) i CRISPR activation (CRISPR-A).
      UWAGA: Biblioteki CRISPR-KO i CRISPR-A są generowane osobno i mogą być łączone na etapie transdukcji wirusowej w celu jednoczesnego badania.
    2. Dla bibliotek CRISPR-KO, wybierz od czterech do pięciu pojedynczych guide RNA (sgRNA) na gen używając algorytmów przewidywania wysokiej oceny takich jak CRISPick62,63, CHOPCHOP64, czy VBC Score65.
      UWAGA: VBC Score zapewnia bardzo wysoką skuteczność i aktywność na docelowych genach66. Niezależnie od narzędzia, preferuj guide z wysoką przewidywaną aktywnością na docelowych genach, minimalnym potencjałem off-target oraz kierowaniem się na egzony kodujące.
    3. Dla bibliotek CRISPR-A, wybierz osiem do dziesięciu guide na gen używając CRISPick62,63 czy CHOPCHOP64. Dla narzędzi, które pozwalają na określenie długości guide przez użytkownika (takich jak CHOPCHOP), ustaw długość guide na 14 bp przed wygenerowaniem guide. Jeśli używasz narzędzia, które generuje tylko guide 20 bp, przekształć te sekwencje na martwe guide RNA (dgRNA) zachowując 14 bp sekwencji bezpośrednio 5’ od motywu protospacer, którego docelowym obszarem są regiony promotorowe genów.
      UWAGA: dgRNA to skrócone sekwencje guide zaprojektowane w celu umożliwienia CRISPR-based aktywacji transkrypcyjnej na około 50-85% skuteczności pełnych długości sgRNA55 bez indukowania kleizenia DNA59,60,61.
    4. Skup wszystkie sgRNA lub dgRNA odpowiadające pojedynczemu eksperymentowi na osobne listy, aby umożliwić jednolite klonowanie, produkcję wirusów i in vivo badanie.
      UWAGA: sgRNA i dgRNA, które mają być badane razem, zostaną skupiony po produkcji wirusowej.
    5. Generuj skupione biblioteki kontroli negatywnej dla skupisk CRISPR-KO i CRISPR-A, włączając nie-docelowe55,67 i nie-genowe sekwencje gRNA68, jak opisano wcześniej, aby kontrolować efekty tła niezależne od zakłócenia lub aktywacji genu.
      ​UWAGA: W razie potrzeby można stworzyć oddzielne biblioteki nie-docelowych i nie-genowych gRNA, aby utworzyć dwie niezależne biblioteki kontroli negatywnej.
  2. Projektowanie puli oligonukleotydów i amplifikacja
    1. Zaprojektuj skupione oligonukleotydy tak, aby każdy gRNA zawierał sekwencję docelującą, zakończenia enzymu restrykcyjnego kompatybilne z docelowym podłożem wirusa lentycznego oraz sekwencje pierwszeństwa specyficzne dla biblioteki, aby umożliwić selektywną amplifikację z kompleksowego skupienia oligonukleotydów (Rysunek 1, Tabela 1).
    2. Przypisz unikalną parę pierwszeństw do każdej biblioteki gRNA, aby pozwolić na niezależną amplifikację poszczególnych bibliotek z wspólnego skupienia oligonukleotydów. Unikalne pary pierwszeństw są wymienione w Tabeli 1.
    3. Zamów skupione biblioteki oligonukleotydów z komercyjnej platformy syntezy matrycowej, upewniając się, że wszystkie gRNA są reprezentowane równocześnie w każdej puli.
    4. Amplifykacja poszczególnych bibliotek gRNA z pokrojonej puli oligonukleotydów za pomocą pierwszeństw specyficznych dla biblioteki w następującym mieszaniu reakcji. Reakcja może być zmodyfikowana, aby odpowiadać zaleceniom składowym określonej polimerazy. Przygotuj trzy reakcje z pokrojoną pulą oligonukleotydów i jedną reakcję kontrolną bez szablonu.
      4 ng Pokrojonego szablonu oligonukleotydów
      2,5 μL 10 μM Pierwszeństwo specyficzne dla pierwszeństwa
      2,5 μL 10 μM Pierwszeństwo specyficzne dla pierwszeństwa odwrotnego
      10 μL 5x

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół pulowanego przesiewania CRISPR in vivo w gruczole mlekowym myszy. Ten schemat postępowania może być wykorzystany w całości do projektowania i amplifikacji pulowanych bibliotek gRNA z macierzy oligonukleotydowych, klonowania bibliotek gRNA do szkieletów lentiwirusowych, produkcji lentiwirusów o wysokim mianie, przeprowadzania wewnątrzprzewodowej dostawy pulowanych bibliotek lentiwirusowych do dorosłego gruczołu mlekowego oraz odzyskiwania gRNA w celu dekonwolucji reprezen...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Kluczową kwestią dla zbiorczych badań CRISPR in vivo jest osiągnięcie wystarczającego pokrycia biblioteki, zachowując jednocześnie rozrzedzone, pojedyncze transdukcje komórek w celu zachowania rozdzielczości klonalnej2. W gruczołach sutkowych myszy kompartyment nabłonkowy szacunkowo składa się z około 3,5 × 105 komórek na gruczoł36. Przy średniej skuteczności transdukcji lentiwirusowej na poziomie 15%, która minimalizuje częstotliwość wielokrotnych infek...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.S. jest konsultantem i założycielem ViVerita Therapeutics, a jego laboratorium sponsorowało umowy badawcze i umowy o świadczenie usług z ViVerita Therapeutics.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dziękujemy wszystkim członkom naszych laboratoriów za pomocne uwagi i dyskusje związane z tą pracą. Dziękujemy również i wyrażamy uznanie Centrum Fenogenomiki za całą pomoc i ekspertyzę związaną z pracą z myszami w Instytucie Badań Lunenfeld-Tanenbaum (LTRI) w Toronto, Kanada. To badanie było wspierane przez grant projektowy z Canadian Institutes of Health Research (PJT462506) i grant Terry Fox Research Institute Program Projects na rzecz D.S. (TFRI Project #1107) dla D.S. oraz przez Nicol Family Foundation. E.R.L. był wspierany przez Canadian Cancer Society Research Training Award i Frank Fletcher Memorial Fund. K.N.A. był wspierany przez H.L. Holmes Postdoctoral Award i granty 1318698 i 26089 od Cancer Research Society. J.N. był wspierany przez stypendium Canadian Institutes of Health Research Canada Graduate Scholarship – Master’s i Nagrodę Doktorską Canadian Institutes of Health Research (#193389). Y.L był wspierany przez stypendium Canadian Institutes of Health Research Research Excellence, Diversity, and Independence (#ED6-190718).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
0.45 micron filterSigmaS2HVU02RE
12k or 92k oligo chipCustomarray Inc. (Genscript)
15 cm cell culture platesCorningCLS353004
293FTInvitrogenR70007
293NTSystems BiosciencesLV900A-1
Alkaline phosphataseNEBM0290L
AmplicillinFisher ScientificBP1760-25
ATPNEB9804S
ATPNEBP0756S
Cutsmart bufferNEBB6004S
Deep sequencing (Next-Seq or Hi-Seq)Illumina
DNAesy Blood and Tissue DNA extraction kitQiagen69506
Dulbecco’s modified Eagle mediumWisent319-015-CL
Endura electrocompetent cellsLucigen60242-1
EpiCult-B Mouse Medium KitStemcell Technologies05610
Esp3INEBR0734L
Fetal Bovine SerumWisent090-150
Gel DNA-cleanup kitZymo ResearchD4008
Gene Pulser/MicroPulser Electroporation CuvettesBioRad1652089
Gentle Collagenase/HyaluronidaseStemcell Technologies7919
H11-Cas9Jackson LabratoriesJAX#028239
High-Speed CentrifugeBeckman CoulterMLS-50
Kim-wipeKimberly-Clark34155
LB AgarWisent Technologies800-011-LG
Micropipette pullerSutter InstrumentP97
Mini-prep plasmid KitFrogga BioPDH300
NEBuffer 3.1 (Buffer for BsmBI)NEBR0580L
Oligo Clean and ConcentratorZymo ResearchD4061
Oligo cleanup kitZymo researchD4060
PAGE purified illumina sequencing primerIDT DNA
PCR MicropipettesDrummond5-000-1001-X10
PEI (polyethyleneimine)Sigma408727-100ML
Penicillin and StreptinomycinWisent450-201-EL
pLKO-CreAddgene158032
pMD2.GAddgene12259
Poly-L-LysineSigmaP2636-100MG
psPAX2Addgene12260
pXPR502-PPH-CreAddgene256776
Q5 Polymerase 2x Master mixNEBM0494L
Qubit Fluorometric QuantificationInvitrogenQ33327
R26-LSL-Cas9-EGFPJackson LabratoriesJAX#024857
R26-LSL-TdTomato miceJackson LabratoriesJAX#007909
SapINEBR0569L
T4 DNA ligaseNEBM0202L
Ultra-centrifuge tubesBeckman Coulter344058
Vacuum Filter UnitsFisher ScientificSCHVU02RE

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Moresco, E. M. Y., Li, X., Beutler, B. Going forward with genetics. Am J Pathol. 182 (5), 1462-1473 (2013).
  2. Santinha, A. J., Strano, A., Platt, R. J. Methods and applications of in vivo CRISPR screening. Nat Rev Genet. 26 (10), 702-718 (2025).
  3. Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nat Biotechnol. 34 (6), 631-633 (2016).
  4. Michels, B. E., et al. Pooled in vitro and in vivo CRISPR-Cas9 screening identifies tumor suppressors in human colon organoids. Cell Stem Cell. 26 (5), 782-792.e7 (2020).
  5. Hart, T., et al. High-resolution CRISPR screens reveal fitness genes and genotype-specific cancer liabilities. Cell. 163 (6), 1515-1526 (2015).
  6. Han, K., et al. CRISPR screens in cancer spheroids identify 3D growth-specific vulnerabilities. Nature. 580 (7801), 136-141 (2020).
  7. Lyu, J., et al. DORGE: discovery of oncogenes and tumor suppressor genes using genetic and epigenetic features. Sci Adv. 6 (46), eaba6784(2020).
  8. Martin, T. D., et al. The adaptive immune system is a major driver of selection for tumor suppressor gene inactivation. Science. 373 (6561), 1327-1335 (2021).
  9. Uijttewaal, E. C. H., et al. CRISPR-StAR enables high-resolution genetic screening in complex in vivo models. Nat Biotechnol. 43, 1848-1860 (2024).
  10. Lowden, C. CRISPR-StAR to transform in vivo functional genomic screening. Nat Rev Cancer. 25 (6), 395-395 (2025).
  11. Brisken, C., Duss, S. Stem cells and the stem cell niche in the breast: an integrated hormonal and developmental perspective. Stem Cell Rev. 3 (2), 147-156 (2007).
  12. Fridriksdottir, A. J. R., Petersen, O. W., Rønnov-Jessen, L. Mammary gland stem cells: current status and future challenges. Int J Dev Biol. 55 (7-9), 719-729 (2011).
  13. Visvader, J. E., Stingl, J. Mammary stem cells and the differentiation hierarchy: current status and perspectives. Genes Dev. 28 (11), 1143-1158 (2014).
  14. Wuidart, A., et al. Quantitative lineage tracing strategies to resolve multipotency in tissue-specific stem cells. Genes Dev. 30 (11), 1261-1277 (2016).
  15. Rios, A. C., Fu, N. Y., Cursons, J., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. The complexities and caveats of lineage tracing in the mammary gland. Breast Cancer Res. 18 (1), 116(2016).
  16. Van Keymeulen, A., et al. Lineage-restricted mammary stem cells sustain the development, homeostasis, and regeneration of the estrogen receptor positive lineage. Cell Rep. 20 (7), 1525-1532 (2017).
  17. Mahendralingam, M. J., et al. Mammary epithelial cells have lineage-rooted metabolic identities. Nat Metab. 3 (5), 665-681 (2021).
  18. Casey, A. E., et al. Mammary molecular portraits reveal lineage-specific features and progenitor cell vulnerabilities. J Cell Biol. 217 (8), 2951-2974 (2018).
  19. Kim, H., et al. Differential DNA damage repair and PARP inhibitor vulnerability of the mammary epithelial lineages. Cell Rep. 42 (10), 113256(2023).
  20. Waas, M., et al. Droplet-based proteomics reveals CD36 as a marker for progenitors in mammary basal epithelium. Cell Rep Methods. 4 (4), 100741(2024).
  21. Dravis, C., et al. Epigenetic and transcriptomic profiling of mammary gland development and tumor models disclose regulators of cell state plasticity. Cancer Cell. 34 (3), 466-482.e6 (2018).
  22. Giraddi, R. R., et al. Single-cell transcriptomes distinguish stem cell state changes and lineage specification programs in early mammary gland development. Cell Rep. 24 (6), 1653-1666.e7 (2018).
  23. Trejo, C. L., Luna, G., Dravis, C., Spike, B. T., Wahl, G. M. Lgr5 is a marker for fetal mammary stem cells, but is not essential for stem cell activity or tumorigenesis. npj Breast Cancer. 3 (1), 16(2017).
  24. Dravis, C., et al. Sox10 regulates stem/progenitor and mesenchymal cell states in mammary epithelial cells. Cell Rep. 12 (12), 2035-2048 (2015).
  25. Boulanger, C. A., Wagner, K. U., Smith, G. H. Parity-induced mouse mammary epithelial cells are pluripotent, self-renewing and sensitive to TGF-β1 expression. Oncogene. 24 (4), 552-560 (2005).
  26. Matulka, L. A., Triplett, A. A., Wagner, K. U. Parity-induced mammary epithelial cells are multipotent and express cell surface markers associated with stem cells. Dev Biol. 303 (1), 29-44 (2007).
  27. Feng, Y., Manka, D., Wagner, K. U., Khan, S. A. Estrogen receptor-α expression in the mammary epithelium is required for ductal and alveolar morphogenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (37), 14718-14723 (2007).
  28. Hanasoge Somasundara, A. V., et al. Parity-induced changes to mammary epithelial cells control NKT cell expansion and mammary oncogenesis. Cell Rep. 37 (10), 110099(2021).
  29. Watson, C. J., Khaled, W. T. Mammary development in the embryo and adult: new insights into the journey of morphogenesis and commitment. Development. 147 (22), dev169862(2020).
  30. Twigger, A. J., Khaled, W. T. Mammary gland development from a single cell ‘omics view. Semin Cell Dev Biol. 114, 171-185 (2021).
  31. Bach, K., et al. Time-resolved single-cell analysis of Brca1 associated mammary tumourigenesis reveals aberrant differentiation of luminal progenitors. Nat Commun. 12 (1), 1502(2021).
  32. Twigger, A. J., et al. Transcriptional changes in the mammary gland during lactation revealed by single cell sequencing of cells from human milk. Nat Commun. 13 (1), 562(2022).
  33. Ciwinska, M., et al. Mechanisms that clear mutations drive field cancerization in mammary tissue. Nature. 633 (8028), 198-206 (2024).
  34. Russell, T. D., et al. Transduction of the mammary epithelium with adenovirus vectors in vivo. J Virol. 77 (10), 5801-5809 (2003).
  35. Tao, L., van Bragt, M. P. A., Laudadio, E., Li, Z. Lineage tracing of mammary epithelial cells using cell-type-specific Cre-expressing adenoviruses. Stem Cell Rep. 2 (6), 770-779 (2014).
  36. Langille, E., et al. Loss of epigenetic regulation disrupts lineage integrity, induces aberrant alveogenesis, and promotes breast cancer. Cancer Discov. 12 (12), 2930-2953 (2022).
  37. Bu, W., et al. Efficient cancer modeling through CRISPR-Cas9/HDR-based somatic precision gene editing in mice. Sci Adv. 9 (19), eade0059(2023).
  38. Li, C., et al. Quantitative in vivo analyses reveal a complex pharmacogenomic landscape in lung adenocarcinoma. Cancer Res. 81 (17), 4570-4580 (2021).
  39. Foggetti, G., et al. Genetic determinants of EGFR-driven lung cancer growth and therapeutic response in vivo. Cancer Discov. 11 (7), 1736-1753 (2021).
  40. Cai, H., et al. A functional taxonomy of tumor suppression in oncogenic KRAS–driven lung cancer. Cancer Discov. 11 (7), 1754-1773 (2021).
  41. Wang, G., et al. CRISPR-GEMM pooled mutagenic screening identifies KMT2D as a major modulator of immune checkpoint blockade. Cancer Discov. 10 (12), 1912-1933 (2020).
  42. Rogers, Z. N., et al. Mapping the in vivo fitness landscape of lung adenocarcinoma tumor suppression in mice. Nat Genet. 50 (4), 483-486 (2018).
  43. Wang, G., et al. Mapping a functional cancer genome atlas of tumor suppressors in mouse liver using AAV-CRISPR–mediated direct in vivo screening. Sci Adv. 4 (2), eaao5508(2018).
  44. Rogers, Z. N., et al. A quantitative and multiplexed approach to uncover the fitness landscape of tumor suppression in vivo. Nat Methods. 14 (7), 737-742 (2017).
  45. Chow, R. D., et al. AAV-mediated direct in vivo CRISPR screen identifies functional suppressors in glioblastoma. Nat Neurosci. 20 (10), 1329-1341 (2017).
  46. Weber, J., et al. CRISPR/Cas9 somatic multiplex-mutagenesis for high-throughput functional cancer genomics in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (45), 13982-13987 (2015).
  47. Platt, R. J., et al. CRISPR-Cas9 knockin mice for genome editing and cancer modeling. Cell. 159 (2), 440-455 (2014).
  48. Wertz, M. H., et al. Genome-wide in vivo CNS screening identifies genes that modify CNS neuronal survival and mHTT toxicity. Neuron. 106 (1), 76-89.e8 (2020).
  49. Xu, C., et al. piggyBac mediates efficient in vivo CRISPR library screening for tumorigenesis in mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 114 (4), 722-727 (2017).
  50. Xiang, D., Tao, L., Li, Z. Modeling breast cancer via an intraductal injection of Cre-expressing adenovirus into the mouse mammary gland. J Vis Exp. (148), e59502(2019).
  51. Krause, S., Brock, A., Ingber, D. E. Intraductal injection for localized drug delivery to the mouse mammary gland. J Vis Exp. (80), e50692(2013).
  52. Wangensteen, K. J., et al. Combinatorial genetics in liver repopulation and carcinogenesis with a in vivo CRISPR activation platform. Hepatology. 68 (2), 663-676 (2018).
  53. Jia, Y., et al. In vivo CRISPR screening identifies BAZ2 chromatin remodelers as druggable regulators of mammalian liver regeneration. Cell Stem Cell. 29 (3), 372-385.e8 (2022).
  54. Borrelli, C., et al. In vivo interaction screening reveals liver-derived constraints to metastasis. Nature. 632 (8024), 411-418 (2024).
  55. Al-Zahrani, K. N., Langille, E. R., Nurtanto, J., et al. Aneuploidy selects for the acquisition of driver genes in breast cancer. Nature. , Available from: https://doi.org/10.1038/s41586-026-10752-9 (2026).
  56. Annunziato, S., et al. Modeling invasive lobular breast carcinoma by CRISPR/Cas9-mediated somatic genome editing of the mammary gland. Genes Dev. 30 (12), 1470-1480 (2016).
  57. Annunziato, S., et al. Comparative oncogenomics identifies combinations of driver genes and drug targets in BRCA1-mutated breast cancer. Nat Commun. 10 (1), 397(2019).
  58. Annunziato, S., et al. In situ CRISPR-Cas9 base editing for the development of genetically engineered mouse models of breast cancer. EMBO J. 39 (5), embj.2019102169(2020).
  59. Dahlman, J. E., et al. Orthogonal gene knockout and activation with a catalytically active Cas9 nuclease. Nat Biotechnol. 33 (11), 1159-1161 (2015).
  60. Kiani, S., et al. Cas9 gRNA engineering for genome editing, activation and repression. Nat Methods. 12 (11), 1051-1054 (2015).
  61. Liao, H. K., et al. In vivo target gene activation via CRISPR/Cas9-mediated trans-epigenetic modulation. Cell. 171 (7), 1495-1507.e15 (2017).
  62. Sanson, K. R., et al. Optimized libraries for CRISPR-Cas9 genetic screens with multiple modalities. Nat Commun. 9 (1), 5416(2018).
  63. Doench, J. G., et al. Optimized sgRNA design to maximize activity and minimize off-target effects of CRISPR-Cas9. Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).
  64. Labun, K., et al. CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing. Nucleic Acids Res. 47 (W1), W171-W174 (2019).
  65. Michlits, G., et al. Multilayered VBC score predicts sgRNAs that efficiently generate loss-of-function alleles. Nat Methods. 17 (7), 708-716 (2020).
  66. Lukasiak, S., et al. A benchmark comparison of CRISPRn guide-RNA design algorithms and generation of small single and dual-targeting libraries to boost screening efficiency. BMC Genomics. 26 (1), 198(2025).
  67. Loganathan, S. K., et al. Rare driver mutations in head and neck squamous cell carcinomas converge on NOTCH signaling. Science. 367 (6483), 1264-1269 (2020).
  68. Morgens, D. W., et al. Genome-scale measurement of off-target activity using Cas9 toxicity in high-throughput screens. Nat Commun. 8 (1), 15178(2017).
  69. Bolger, A. M., Lohse, M., Usadel, B. Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics. 30 (15), 2114-2120 (2014).
  70. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25(2009).
  71. Li, W., et al. MAGeCK enables robust identification of essential genes from genome-scale CRISPR/Cas9 knockout screens. Genome Biol. 15 (12), 554(2014).
  72. Veltmaat, J. M., Ramsdell, A. F., Sterneck, E. Positional variations in mammary gland development and cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 18 (2), 179-188 (2013).
  73. Esmaeili Anvar, N., et al. Efficient gene knockout and genetic interaction screening using the in4mer CRISPR/Cas12a multiplex knockout platform. Nat Commun. 15 (1), 3577(2024).
  74. Griffith, A. L., et al. Optimization of Cas12a for multiplexed genome-scale transcriptional activation. Cell Genomics. 3 (9), 100387(2023).
  75. Sack, L. M., et al. Profound tissue specificity in proliferation control underlies cancer drivers and aneuploidy patterns. Cell. 173 (2), 499-514.e23 (2018).
  76. Yanchus, C., et al. A noncoding single-nucleotide polymorphism at 8q24 drives IDH1-mutant glioma formation. Science. 378 (6615), 68-78 (2022).
  77. Martinez, S., et al. In vivo CRISPR screens reveal SCAF1 and USP15 as drivers of pancreatic cancer. Nat Commun. 15 (1), 5266(2024).
  78. Lü, Y., et al. Genome-wide CRISPR screens identify novel regulators of wildtype and mutant p53 stability. Mol Syst Biol. 20 (6), 719-740 (2024).
  79. Schramek, D., et al. Direct in vivo RNAi screen unveils Myosin IIa as a tumor suppressor of squamous cell carcinomas. Science. 343 (6168), 309-313 (2014).
  80. Bu, W., Li, Y. Advances in immunocompetent mouse and rat models. Cold Spring Harb Perspect Med. 14 (3), a041328(2024).
  81. Ben-Jonathan, N., LaPensee, C. R., LaPensee, E. W. What can we learn from rodents about prolactin in humans? Endocr Rev. 29 (1), 1-41 (2008).
  82. Sánchez-Criado, J. E., et al. Biological role of pituitary estrogen receptors ERα and ERβ on progesterone receptor expression and action and on gonadotropin and prolactin secretion in the rat. Neuroendocrinology. 79 (5), 247-258 (2004).
  83. LaPensee, C. R., et al. The prolactin-deficient mouse has an unaltered metabolic phenotype. Endocrinology. 147 (10), 4638-4645 (2006).
  84. Kinoshita, Y., et al. Similarity of GATA-3 expression between rat and human mammary glands. J Toxicol Pathol. 27 (2), 159-162 (2014).
  85. Nicotra, R., Lutz, C., Messal, H. A., Jonkers, J. Rat models of hormone receptor-positive breast cancer. J Mammary Gland Biol Neoplasia. 29 (1), 12(2024).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

GenetykaNumer 233Numer 233WszystkieNumerWszystkieNumerWarto pustaNumer
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły