Artykuł przeglądowy
Terapia genowa z użyciem wirusa związanego z adenowirusem (AAV) wymaga dobrze scharakteryzowanych materiałów standardu referencyjnego (RSM) w celu zapewnienia dokładnych, powtarzalnych pomiarów analitycznych w laboratoriach oraz między nimi. Niniejsza recenzja bada krytyczną potrzebę RSM, ocenia dostępne komercyjne i farmakopealne standardy oraz przedstawia praktyczne strategie dla rozwoju RSM w zakładzie w celu rozwijania bezpiecznych i skutecznych terapii z użyciem AAV.
Wirus adeno-współistniejący (AAV) stał się wiodącym wektorem terapii genowej in vivo, przy czym obecnie osiem produktów posiada pozwolenie na dopuszczenie do obrotu. W miarę dynamicznego rozwoju tej dziedziny, rośnie potrzeba zaawansowanych metod analitycznych do charakteryzacji krytycznych atrybutów jakości (CQAs)—w tym tytrze kapsydu, tytrze genomu, zawartości kapsydu (stosunek pustych/pełnych), tożsamości i czystości—wciąż rośnie. Referencyjne materiały standardowe (RSMs) odgrywają kluczową rolę, dostarczając dobrze scharakteryzowanych, standaryzowanych partii AAV, które służą jako uniwersalne punkty odniesienia. RSMs ułatwiają walidację nowych technologii analitycznych, zapewniają dokładność i powtarzalność rutynowych testów oraz umożliwiają porównywalność między laboratoriami. Jednak opracowywanie uniwersalnych AAV RSMs jest zasadniczo ograniczone przez złożoną biologię, różnorodność serotypów, genomy wektorów i inżynieryjne warianty kapsydów, co wymaga standardów specyficznych dla każdego serotypu i zastosowania. Ostatnie osiągnięcia, w tym wydanie farmakopealnych standardów referencyjnych AAV8 scharakteryzowanych za pomocą wielu ortogonalnych metod, stanowią znaczący postęp w kierunku harmonizacji pomiarów. Niniejsza recenzja dotyczy krytycznej potrzeby RSMs w terapii genowej AAV, ocenia obecnie dostępne standardy farmakopealne i komercyjne oraz przedstawia praktyczne strategie dotyczące rozwoju RSMs wewnętrznych. Ustanowienie solidnych, specyficznych dla serotypu AAV RSMs i zharmonizowanych standardowych protokołów operacyjnych (SOPs) jest niezbędne dla rozwoju terapii genowej AAV i zapewnienia dokładności, powtarzalności i bezpieczeństwa w badaniach, rozwoju i produkcji klinicznej.
Terapia genowa oferuje transformacyjną strategię leczenia chorób genetycznych i nabytych poprzez wprowadzanie funkcjonalnego materiału genetycznego do komórek pacjenta w celu korekcji lub regulacji ekspresji genów. Wśród nich wirusy adeno-związane (AAV) wyróżniają się na tle zastosowań in vivo ze względu na ich zróżnicowane tropizmy tkankowe w różnych serotypach i utrzymaną episomalną ekspresję transgenu1.
AAV to kompaktowe (~25 nm średnicy) wirusy DNA z rodzaju Dependoparvovirus w rodzinie Parvoviridae. Wirusy te są niepatogenne i defektywne replikacyjnie, wymagające wirusów pomocniczych, takich jak adenowirus czy wirus prostego opryszczki, do replikacji2. Genom AAV ma dwa geny, rep i cap, osadzone pomiędzy dwoma 145-parowymi palindromowymi powtórzeniami znanymi jako inwertowane terminalne powtórzenia (ITR)3. Wektory rekombinowanego AAV (rAAV) są generowane poprzez zastąpienie sekwencjonalnych kodujących wirusów kasetami terapeutycznymi zawierającymi promotor, transgen i elementy regulacyjne osadzone pomiędzy ITR. Podczas produkcji geny rep i cap są dostarczane in trans, ułatwiając replikację i pakowanie kasety terapeutycznej do kapsyd wirusowych, co daje nieintegrujące, replikacyjnie defektywne cząstki, które zachowują mocne zdolności transdukcji, zapobiegając jednocześnie replikacji wirusa typu dzikiego4. Ośmiu produktów terapeutycznych opartych na rAAV otrzymało pozwolenie na dopuszczenie do obrotu od Agencji Leków Europejskiej (EMA) lub amerykańskiej Agencji Żywności i Leków (FDA), a badania kliniczne z wykorzystaniem AAV są w wzroście. Stanowisko z stycznia 2025 roku wykazało, że 343 badania kliniczne z wykorzystaniem AAV były zarejestrowane na całym świecie, co stanowi 34% wzrost w porównaniu z 255 badaniami w połowie 2022 roku5. Ta szybka ekspansja kliniczna zwiększa potrzebę solidnej kontroli jakości, aby zapewnić bezpieczeństwo pacjentów6.
Zapewnić, że produkty rAAV są bezpieczne i skuteczne do stosowania u ludzi wymaga dokładnej charakterystyki krytycznych atrybutów jakości (CQA), w tym ilości, mocy, czystości, tożsamości, bezpieczeństwa i stabilności. Jednakże, charakterystyka AAV nadal jest z natury rzeczy trudnym zadaniem z powodu strukturalnej złożoności tych wektorów. AAV to ikosaedryczne cząstki złożone z trzech białek kapsydu wirionu (VP1, VP2, VP3), złożone w przybliżeniu w proporcji 1:1:10, a zmiany w asembletyce białek mogą wpływać na efektywność transdukcji7. Terapeutyczna ładunku DNA musi być zapakowana do kapsydu z wysoką wiernością; heterogeniczne populacje kapsydu są nieodłącznie generowane podczas produkcji rAAV, składające się z kapsydów zawierających kompletny genom (pełne kapsydy), częściowy genom (częściowo wypełnione kapsydy) lub bez materiału genetycznego (puste kapsydy). Dodając do tej złożoności, różne serotypy AAV wykazują odmienne efektywności pakowania, tropizmy tkankowe i profile immunologiczne, co wymaga opracowania testów dostosowanych do poszczególnych serotypów. Poza tymi biologicznymi wyzwaniami, istnieje krytyczny problem związany z tym, jak są wykonywane pomiary. Różne laboratoria wykorzystują różne testy, protokoły i podejścia do analizy danych do pomiaru tej samej CQA. W rezultacie, zgłaszane wartości dla identycznych próbek mogą różnić się wielokrotnie między różnymi miejscami8. Nawet w jednym laboratorium zmiany w czasie rekagencji, instrumentacji, operatorów lub ustawień analizy mogą prowadzić do zmian w wynikach z tej samej partii9. Kiedy pomiary nie są porównywalne, ustanowienie niezawodnych powiązań między CQA a wynikami przedklinicznymi lub klinicznymi staje się trudne, co komplikuje podejmowanie decyzji regulacyjnych10,11.
Standardyzacja ma na celu rozwiązanie tego problemu poprzez zapewnienie porównywalności pomiarów. W analityce farmaceutycznej standardyzacja obejmuje dwa kluczowe aspekty: używanie wspólnych fizycznych referencyjnych materiałów standardowych (RSM) oraz przestrzeganie zharmonizowanych szczegółowych pisemnych standardowych procedur operacyjnych (SOP), zapewniając, że różne laboratoria mierzą tytuł, tożsamość, jakość, moc i czystość spójnie12. RSM to dobrze scharakteryzowane próbki, które pełnią rolę punktów odniesienia. Walidując testy na tym samym RSM, laboratoria zakotwiczają swoje pomiary do wspólnego punktu odniesienia. To zmniejsza różnicę między laboratoriami i pozwala na niezawodne porównywanie wyników z różnych badań, produktów i miejsc produkcji13. Ponadto, służy również jako kontrola wewnętrzna do monitorowania wydajności testów i monitorowania spójności w czasie14. SOP dalej zapewniają, że metody analityczne są wykonywane spójnie w różnych laboratoriach, minimalizując różnice wynikające z różnic w przetwarzaniu próbek, instrumentacji, strategii kalibracji, przet
1. RSM: definicje i potrzeba
RM są zorganizowane hierarchicznie, z dwoma głównymi typami: podstawowymi i wtórnymi RM. Zgodnie z ISO Guide 30, standard podstawowy jest zdefiniowany jako “standard, który jest wyznaczony lub powszechnie uznany za posiadający najwyższe właściwości metrologiczne i którego wartość jest akceptowana bez odniesienia do innych standardów tej samej wielkości, w określonym kontekście”. Na przykład, RM z United States Pharmacopeia (USP), European Pharmacopeia (Ph. Eur.), British Pharmacopeia (BP) itp., które zostały dokładnie scharakteryzowane poprzez badania wielolaboratoryjne, kwalifikujące się jako podstawowe RM. Poszczególni producenci następnie używają tych podstawowych RM do kalibracji i kwalifikacji własnych materiałów referencyjnych, które służą jako wtórne RM do rutynowych testów kontroli jakości12,15. Stąd, ISO definiuje wtórny RM jako “standard, którego wartość jest przypisywana przez porównanie z podstawowym standardem tej samej wielkości”. Ten hierarchiczny podejście zapewnia śledzenie: pomiary wewnętrzne odnoszą się do standardów podstawowych, które z kolei są charakteryzowane za pomocą najnowocześniejszych metod analitycznych16. Korzystanie z RM zapewnia wspólne punkty odniesienia, które umożliwiają producentom kalibrowanie i walidację ich metod analitycznych do tego samego punktu odniesienia, prowadząc tym samym do bardziej dokładnych pomiarów. Władze regulacyjne dlatego zachęcają do używania podstawowych RM do kalibracji wewnętrznych RM i walidacji metod testowych, poprawiając spójność w całym procesie produkcji AAV17,18. Umożliwia to standaryzację różnych technik analitycznych, prowadząc do lepszego porównania wyników charakteryzacji rAAV w różnych laboratoriach i różnych produktach17,19. Poprawiona porównywalność poprawia zrozumienie ryzyka bezpieczeństwa potencjalnie związanego z wysokimi dawkami lub zanieczyszczeniami związanymi z produktem, takimi jak puste i częściowo wypełnione kapsydy. Ostatecznie, te informacje mogą pomóc w formułowaniu naukowej polityki regulacyjnej, takiej jak minimalny próg pełnych kapsydów, analogiczny do kryterium ≥70% żywych komórek dla terapii komórkowych somatycznych, przyczyniając się tym samym do bezpieczniejszych i bardziej niezawodnych produktów terapii genowej13,20,21.
W przypadku rAAV, kilka CQA wyraźnie ilustruje potrzebę standaryzacji. Tytuł genomu wektora bezpośrednio określa dawkę pacjenta; niedokładne tytuły ryzykują niedodawkowanie lub przedawkowanie. Ilościowa PCR (qPCR) i cyfrowa PCR (dPCR) są szeroko stosowane do pomiaru tytułu, ale wyniki mogą się różnić dla tej samej próbki, jeśli używane są różne kalibratory krzywych standardowych lub protokoły11. Zawartość kapsydu (stosunek pełnych, częściowo wypełnionych i pustych kapsydów) jest kolejnym krytycznym CQA, ponieważ puste i częściowo wypełnione kapsydy mogą przyczyniać się do immunogeniczności lub zmniejszać skuteczność6. Ponad dziesięć różnych technik jest używanych do pomiaru zawartości kapsydu, w tym analityczna ultrawirówka (AUC), chromatografia wykluczania rozmiarowego połączona z rozpraszaniem światła wielokątowego (SEC-MALS), fotometria masowa (MP), spektrometria masowa z wykrywaniem ładunku (CDMS), mikroskopia elektronowa (EM), chromatografia wymiany anionowej (AEX), kapilarna izoelektryczna fokuskacja (cIEF), spektroskopia ultrafioletowowidokowa (UV/Vis) itp. Ponadto, zawartość kapsydu jest często szacowana pośrednio za pomocą stosunku tytułu genomu wektora do tytułu cząsteczki wirusowej, oznaczanego odpowiednio przez qPCR lub dPCR i ELISA (PCR/ELISA)22. Każda technika mierzy różne właściwości fizyczne i może raportować różne wartości zawartości kapsydu dla tych samych próbek. Niedawne badanie międzylaboratoryjne NIST porównujące UV/Vis, AUC, SEC-MALS i PCR/ELISA wykazało znaczną zmienność między metodami i między laboratoriami, przy czym PCR/ELISA wykazywał szczególnie słabą powtarzalność, a AUC wykazywał znaczną różnicę między laboratoriami mimo że jest powszechnie uważany za metodę referencyjną8. Te ustalenia wskazują, że zmniejszenie zmienności w analityce AAV wymaga zarówno wspólnych RM, jak i ujednoliconych przepływów analitycznych, jak omówiono w sekcji 5.
2. Krajobraz RSM rAAV
Wysiłki na rzecz ustanowienia RM dla AAV zaowocowały dwoma źródłami dostarczającymi podstawowe RM AAV. Wśród źródeł farmakopealnych, USP jest obecnie jedynym dostawcą podstawowych RM AAV. Poza USP, podstawowe RM AAV są również dostępne od American Type Culture Collection (ATCC). Wzrasta zakres komercyjnych wtórnych RM dla wielu serotypów, odzwierciedlając trwające wysiłki społeczności na rzecz rozwiązania braku standaryzacji związanej z charakteryzacją AAV. Tabela 1 podsumowuje dostępne obecnie materiały RM AAV i ich klu
Terapia genowa z użyciem rAAV rozwija się szybciej niż zdolność tej dziedziny do spójnej charakterystyki atrybutów jakościowych. Niniejszy przegląd wykazuje, że główną barierą w porównywalnej charakterystyce AAV nie jest brak narzędzi analitycznych, lecz brak wspólnych punktów odniesienia dla pomiarów oraz zharmonizowanych schematów postępowania. RSM-y rozwiązują ten problem, przekształcając pomiary zależne od metody w wartości mierzalne i porównywalne. RSM-y umożliwiają walidację metod, poprawiają powtarzalność między laboratoriami i zapewniają stałą kontrolę w celu wykrywania dryftu testów. Jednakże wytwarzanie wysokiej jakości RSM-ów dla AAV pozostaje wymagające technicznie ze względu na trudności w uzyskaniu czystych populacji kapsydów pustych i pełnych, potrzebę kompleksowej charakterystyki ortogonalnej oraz wymóg długoterminowej stabilności w określonych warunkach przechowywania. Ostatnie postępy w technologiach produkcji i oczyszczania umożliwiły wytwarzanie preparatów zawierających głównie kapsydy puste i pełne, które mogą być wykorzystywane do generowania wewnętrznych RSM-ów, a obecna oferta organów farmakopealnych (USP), konsorcjów współpracujących (ATCC) i dostawców komercyjnych reprezentuje znaczący postęp. Niemniej jednak opracowanie uniwersalnych RSM-ów dla AAV jest zasadniczo ograniczone przez różnorodność serotypów, genomów wektorowych i coraz częściej stosowanych zmodyfikowanych wariantów kapsydów. W przeciwieństwie do przeciwciał monoklonalnych, heterogenność AAV wymaga RSM-ów specyficznych dla danego serotypu i zastosowania. Złożoność ta jest dodatkowo potęgowana przez kapsydy hybrydowe i/lub modyfikowane, co zmusza producentów do utrzymywania zastrzeżonych, wewnętrznych pierwotnych RSM-ów, co prowadzi do fragmentacji obszaru pomiarowego. Ponadto inne atrybuty jakościowe, takie jak modyfikacje potranslacyjne (PTM), zostały wskazane jako potencjalne CQA i brakuje dla nich dobrze scharakteryzowanych RSM-ów, co tworzy krytyczną lukę w zrozumieniu tego atrybutu wektora. Poza dostępnością RSM-ów, równie istotne są zharmonizowane SOP. Dziedzina ta odniosłaby korzyść z wprowadzenia metod kompendialnych — zestandaryzowanych, szczegółowych protokołów publikowanych przez organy farmakopealne — które zapewniłyby, że wszystkie laboratoria przeprowadzają spójne i kontrolowane testy dla CQA AAV. Pisemne dokumenty wytycznych szczegółowo opisujące najlepsze praktyki dla powszechnie stosowanych metod dodatkowo zmniejszyłyby zmienność między laboratoriami i zharmonizowały przepływy analityczne. Poprzez ustanowienie mierzalnych RSM-ów dla AAV i wdrożenie spójnych, dokładnych praktyk charakterystyki, społeczność naukowa może wzmocnić podstawy naukowe łączące CQA z bezpieczeństwem i skutecznością, wesprzeć pewne podejmowanie decyzji regulacyjnych i ostatecznie dostarczyć pacjentom bezpieczniejsze i bardziej niezawodne terapie genowe.
Tabela 1: Obecnie dostępne rAAV RSM oraz ich charakterystyka
Tabela ta podsumowuje dostępne materiały wzorcowe rAAV oraz ich kluczowe charakterystyki. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Tabela 2: Rekomendowany zestaw metod analitycznych do wewnętrznej charakterystyki RSM
Tabela ta podsumowuje metody analityczne zalecane do wewnętrznej charakterystyki RSM. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.
Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów
Ten projekt uzyskał dofinansowanie z Programu Ramowego Unii Europejskiej na rzecz Badań i Innowacji, Horyzont Europa, na mocy umowy o dofinansowanie nr 101119880. Projekt ten był finansowany przez dotację „Flanders Resilience” od rządu flamandzkiego, pochodzącą z „Europejskiego Mechanizmu Odbudowy i Odporności” (RRF) (VV021/13).
Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE
Poproś o pozwolenie