Trójwymiarowa immunolokalizacja w mejocytach kukurydzy

Podsumowanie

Ten protokół immunolokalizacji w męskich mejocytach kukurydzy zachowuje trójwymiarową integralność komórek podczas mejozy. Umożliwia dynamiczne śledzenie lokalizacji wewnątrzkomórkowej do trzech niezależnych przeciwciał w zachowanym materiale utrwalonym paraformaldehydem, oprócz DAPI, które barwi DNA.

Streszczenie

W czasie profazy I mejozy, fizyczna konfiguracja chromosomów różni się znacznie na poszczególnych etapach rozwoju, na szczęście te specyficzne dla faz konfiguracje pozwalają na prawidłową identyfikację każdego z tych klasycznych etapów mejozy, które są odpowiednio znane jako leptoten (np. ‘cienkie nici’), zygoten (np. ‘spojene nici’), pachyten (np. ‘grubkie nici’), dyploten (np. ‘podwójne nici’) i diakineza (np. ‘ruch odpychający’). Wizualna analiza kilku zjawisk cytogenetycznych, które występują podczas profazy I, takich jak rekombinacja, parowanie i synapsis, wymaga wysoce niezawodnych technik immunolokalizacji. W przeciwieństwie do tradycyjnych technik rozciągania i miażdżenia, które tłumią wszystkie informacje subkomórkowe i subnuklearne, opisana tu procedura 3D konserwacji pozwala na zachowanie kluczowych białek mejotycznych w ich naturalnych miejscach lokalizacji subkomórkowej (cytoplazmatycznej, jądrowej i subnuklearnej: euchromatyna, heterochromatyna i nukleolus). Dlatego protokół ten opisuje, jak efektywnie fiksować mejotyczne pylniki, dysekcję i uwalnianie mejocytów z pylników oraz przeprowadzać jednoczesną immunolokalizację trzech kluczowych białek w męskich mejocytach kukurydzy.

Wprowadzenie

Mejoza jest kluczowym procesem, który reguluje przekazywanie cech u roślin modelowych i upraw; dlatego proste metody mikroskopiczne, które umożliwiają spójne i wiarygodne wizualizowanie lokalizacji białek, ułatwiają zrozumienie, jak te cechy mogą być przekazywane bardziej efektywnie. Niestety, wizualizację lokalizacji białek wewnątrz meiocytów znacznie różniła w zależności od stosowanej techniki^1,2. Zatem celem protokołu jest zapewnienie prostego, powtarzalnego metodu, który eliminuje artefakty podczas obserwacji meiocytów. Na przykład od dawna uznaje się, że obserwacja chromosomów mejotycznych jest delikatnym procesem, który ułatwia rozcieranie komórek poprzez proste rozgniatanie lub jeszcze bardziej niszczące techniki rozmazywania^3,4,5. W Arabidopsis thaliana naukowcy zwykle stosujące metody rozmazywania, które wykorzystują utrwalacz Carnoy’a (3:1 mieszanka etanolu i kwasu octowego) wraz z różnymi detergentami, takimi jak Lipsol, Tween-20 i TritonX-100, a także mieszankami enzymów zawierających celulazę, pektynazę i cytohelikazy, aby rozbić komórki i umożliwić skuteczne immunolokalizację na jego małych chromosomach^1,2. Te techniki zamieniają 3D konformację chromosomu w 2D, umożliwiając szybkie obserwowanie całości sztucznie rozproszonych chromosomów na jednym obrazku. Pewne cechy chromosomów, które przetrwają te surowe traktowania, mogą być widoczne; jednak często nie reprezentują typową zachowanie komórek i chromosomów in vivo⁶. Szybka i bardzo szeroka detekcja do dwóch przeciwciał jest możliwa za pomocą 2D technik rozmazywania u różnych gatunków roślin, w tym u kukurydzy^7,8,9,10,11.

Mimo to, pomimo wygody starszych technik 2D, obecnie uznaje się, że niektóre zjawiska są wrażliwe na metody niszczące i nie można ich obserwować, jeśli komórka, jądro lub chromosomy są uszkodzone podczas rozmazywania lub rozgniatania. Na przykład ruch białka RAD50 z cytoplazmy do jądra w czasie etapu leptotenu, lub podczas sprzęgania centromerów (leptonem/zygonem), został wykryty tylko w nienaruszonych 3D meiocytach¹². Tutaj czytelnikom oferujemy szczegółowy 4-dniowy protokół 3D, który wykorzystuje kwiatki utrwalone w 4% paraformaldehydzie do immunolokalizacji trzech kluczowych białek w męskich meiocytach kukurydzy, zachowując tym samym ich integralność strukturalną. W porównaniu do podobnej metodologii 3D immunolokalizacji kukurydzy⁸, dodaliśmy praktyczne uwagi i porady dotyczące rozwiązywania problemów dla naukowców. Ten protokół będzie przydatny dla biologów roślin i hodowców roślin zainteresowanych badaniem różnych procesów mejotycznych, takich jak kontrola rekombinacji mejotycznej przez kompleks synaptonemalową.

Protokół

UWAGA: Obsługiwać formaldehyd i akryloamid należy z zachowaniem należytej ostrożności i stosując odpowiednie wyposażenie do ochrony osobistej oraz zabezpieczenia chemicznego; oba są toksyczne (akryloamid jest również neurotoksyczny przed polimeryzacją). Wszystkie materiały użyte w badaniu są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Fiksacja pylników kukurydzy w celu zachowania integralnej struktury meiocytów

1. Użyj roślin kukurydzy na etapie V13 z kwiatostanami wciąż rosnącymi wewnątrz łodygi. W tygodniu fiksacji meiotycznych pylników, należy nosić rękawiczki i delikatnie naciskać zgrubiały łodygę w miejscu wybrzuszeń, aby sprawdzić, czy jest dość miękka, by ją otworzyć.
   UWAGA: Ten protokół fiksacji i immunolokalizacji może być stosowany zarówno dla kukurydzy, jak i pąków kwiatowych mejotycznych Arabidopsis thaliana (mniej niż 400 µm). Jednak w przypadku kukurydzy, w zależności od użytej odmiany i pory roku (wiosna przyspiesza wzrost), od momentu sadzenia do osiągnięcia odniesienia dla linii inbred B73 upływa około 8 tygodni, ale tylko 6 tygodni dla wcześnie kwitnącej linii inbred A344.
2. Przygotowanie buforów.
   UWAGA: Dzień przed fiksacją chemiczną, przygotuj następujące roztwory robocze, czyń to uważnie i poprawnie oznacz wszystkie butelki.
   1. Przygotuj 100 mL 10x Bufor A (BA) soli, dodając 4,53 g PIPES (Piperazina-N, N′-bis(2-etanosulfonian) w ostatecznym stężeniu 150 mM), 5,96 g KCl (ostateczne stężenie 800 mM), 1,17 g NaCl (ostateczne stężenie 200 mM), 0,74 g EDTA (ostateczne stężenie 20 mM), 0,19 g EGTA (ostateczne stężenie 5 mM) oraz 90 mL H₂O, najpierw dostosuj pH do 6,8–7 za pomocą KOH, a następnie dostosuj objętość do 100 mL.
   2. Na koniec filtrosterylizuj za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow z PES o porowatości 0,45 µm (przechowywaj w 4 °C, ale nie zamrażaj; możesz przechowywać przez kilka miesięcy).
   3. Przygotuj:
      - 50 mM PIPES (pH dostosowany do 7 za pomocą KOH).
      - zasoby sperminy w stężeniu 0,4 M (wcześniej rozpuszczone w 50 mM PIPES, dostosuj pH do 7 za pomocą KOH, przechowuj alikwoty 50 µL w -20 °C).
      - zasoby spermidyny w stężeniu 0,4 M (rozpuszczone w 50 mM PIPES, pH dostosowane do 7 za pomocą KOH, przechowuj zamrożone alikwoty 125 µL w -20°C).
      - zasoby Ditiotreitolu (DTT) 1 M (rozpuszczone w 0,01 M octotaniu sodu, do pH 5,2, przechowuj zamrożone alikwoty 100 µL w -20 °C).
      - sorbitol 2 M, przechowywany w 4 °C.
3. Przygotuj 50 mL 2x Bufor A (BA), na lodzie, używając 10 mL 10x Bufor A soli (przechowywany w 4 °C), 50 µL sperminy (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 125 µL spermidyny (0,4 M w 50 mM PIPES, z pH dostosowanym do 7 za pomocą KOH), 100 µL DTT (1 M w 0,01 M octotaniu sodu, pH 5,2) energicznie wymieszaj, aby się rozpuścił; i nie podgrzewaj.
   1. Następnie dodaj 16 mL 2 M sorbitolu. Dostosuj ostateczną objętość do 50 mL sterylną wodą. Przefiltruj i sterylizuj za pomocą jednorazowego sterylnego filtra Rapid-Flow i przechowuj w 4 °C.
4. Przygotuj wilgotną komorę złożoną z 5-10 zwilżonych ręczników papierowych umieszczonych w plastikowym pudełku. Upewnij się, że pokrywka szczelnie się zamyka. Usuń wszelką nadmiarę wody.
5. Następnie umieść w tacki następujące przedmioty: wilgotną komorę, ostrzałkę, drobne kleszcze (wcześniej wysuszone 70% alkoholem), małą butelkę sterylnej wody i taśmę maskującą. Przynieś tackę i jej zawartość do roślin kukurydzy sprawdzonych w kroku 1.1.
6. Użyj ostrza do otwarcia zgrubiałej łodygi na wysokości kwiatostanu. Główne gałęzie kłosów, jak również boczne gałęzie kwiatostanu, mogą być używane do zbioru meiotycznych kwiatów.
   UWAGA: Te gałęzie kłosów zawierają interesujące kwiaty do zbierania meiotycznych pylników. Każdy kwiat zawiera sześć pylników, a 3 górne, większe są zazwyczaj używane do analizy. Przybliżona wielkość i kolor pylników koreluje z każdym etapem mejozy. Prawie przezroczyste pylniki o długości około 1 mm są na etapie leptotenu, przezroczyste pylniki o długości 1,5 mm są na etapie zygotenu, białawe pylniki o długości 2 mm są na etapie pachytenu, a żółtawe pylniki o długości większej niż 2 mm mogą zawierać meiocyty na etapie diplotenu, tetrad i ziarna pyłku,

Wyniki

Stosując niniejszy protokół, możemy jednocześnie obserwować wzorce lokalizacji trzech kluczowych białek meiotycznych u kukurydzy (Ryc. 1). Białko meiotyczne ABSENCE OF FIRST DIVISION 1 (AFD1) jest homologiem podjednostki REC8 typu alpha-Kleisin kompleksu kohezyny meiotycznej. Białko ASYNAPTIC 1 (ASY1) jest kluczowym elementem osiowym, natomiast ZYPPER1 (ZYP1) stanowi element poprzeczny kompleksu synaptonemalnego¹⁵. Barwienie DAPI ukazuje wyraźne jądro i barwienie chro...

Dyskusja

To protokoll oferuje kluczową przewagę nad innymi, ponieważ zachowuje istotne trójwymiarowe dane dotyczące ładowania białek chromosomowych mejotycznych. Te cechy nie mogą być zachowane przy użyciu regularnych technik rozprowadzania^1,2. Niemniej jednak, ten protokół ma dwie ograniczenia: jest powolny i wymaga dużego nakładu pracy w porównaniu z regularnymi technikami rozprowadzania wykonywanymi w ciągu jednego dnia. W przeciwieństwie do tego, nasz protokół wymaga ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1.5 mL microtubes Axygen	Corning	MCT-150-C
15 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339651
50 mL Falcon tubes	Thermo Fisher Scientific	339652
6 well plate Falcon polystyrene microplate	Thermo Fisher Scientific	08-772-1B
Ocetowa kwas, 60%	Thermo Fisher Scientific	A38-212
Akrylamid 30%  oraz roztwór bis-akrylamidu, 29:1	Biorad	1610157
Aluminiowy składany	Reynolds	U07211R0
Persiarczan amonu (APS)	Merck	A3678
Binokularowy stereomikroskop	NA	NA
Albumina wołowa (BSA)	Merck	A9418
DAPI	Merck	D9542
Mikroskop DelltaVision	Olympus	NA
Destylowana H2O	NA	NA
Jednorazowe jednostki filtracyjne z filtrami PES o porach 0,45 μm	Thermo Fisher Scientific/Nalgene	09-740-63B
Precyzyjne kleszcze FST Dumont SS	Fine Science Tools	11200-33
kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko szczurom, oznaczony AlexaFluor647	Invitrogen	A-21247
kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko królikom, oznaczony AlexaFluor568	Invitrogen	A-21428
kozi (IgG H+L) silnie wchłaniany krzyżowo przeciwko świnkom morskim, oznaczony AlexaFluor488	Invitrogen	A-11073
Rękawiczki	Merck	Z412392
Komory hodowlanowe / szklarnia / lub pole	NA	NA
DTT	Merck	D0632
EDTA	Sigma-Aldrich	E6758
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
KCl	Sigma-Aldrich	P3911
Taśma maskująca 3M	Fisher Scientific	19-047-259
Nasienie kukurydzy	NA
Mikroskopy 22 x 22 mm-1,5 szklane pokrywki	Fisher Scientific	12-542-B
Mikroskopy 22 x 22 mm-H pokrywki	Deckgläser, Zeiss	474030-9020-000
Mikroskopowe szklany slajd	Fisher Scientific	22-230-900
Mikroskopowa skrzynka na slajd	Fisher Scientific,	03-448-9
Mikropipety P20, P200, P1000	Merck	CLS4069
NaCl	Merck	S7653
Lakier do paznokci	Electron Microscopy Science	72180
Ręczniki papierowe	Merck	Z188956
Parafilm	Merck	P7668
16% roztwór paraformaldehydu	Electron Microscopy Grade	15710
PBS	Merck	P4474
Plastowa skrzynka z pokrywką	Tupperware	NA
Poly-L-Lizyna	Merck	P4707
Przeciwciała pierwotne (anty-ZmAFD1 szczura, anty-ZmASY1 królika, anty-ZmZYP1 świnki morskiej)	NA
Prolong Antifading	Molecular Probes	P36934
Petri dish (D x H: 35 mm x 10 mm	Corning	351008
Petri dish regular size	Merck	P5731
PIPES	Merck	P1851
Końcówki pipet (0,5-10 uL) sterylne	Merck/Corning	AXYT300
Końcówki pipet (200 uL) sterylne	Merck/Corning	AXYT200Y
Końcówki pipet (1000 uL) sterylne	Merck/Corning	AXYT1000BRS
Ostrza brzytwy - jednosieczne	Fisher Scientific	12-640
Wstrząsacz z platformą obrotową	NA	NA
Spermina	Merck	85590
Spermidyna	Merck	S2626
Sorbitol	Merck	S8143
Tween-20	Merck	P9416
Triton X-100	Fisher Scientific	9002-93-1
Ultra czysty akrylamid	Invitrogen	15512023
Odkurzacz