Kwantyfikacja cytotoksyczności komórek NK potencjowanej przez chimeryczne receptory antygenowe i przeciwciała terapeutyczne z wykorzystaniem obrazowania żywych komórek i cytometrii przepływowej

Podsumowanie

Ten protokół zapewnia zstandaryzowany in vitro przepływ pracy dla spójnego pomiaru naturalnej, chimerycznej receptora antygenowego–pośredniczonej i zależnej od przeciwciał cytotoksyczności ludzkich naturalnych komórek zwanych zbójcami przy użyciu żywego obrazu komórkowego i cytometrii przepływowej.

Streszczenie

Komórki natural killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają krytyczną rolę w ochronnej odporności przeciwko różnym patogenom wewnątrzkomórkowym i rakiem. Ich główną funkcją jest zabijanie komórek docelowych, które są zakażone, złośliwie przekształcone lub pokryte przeciwciałami poprzez cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC). Komórki NK mogą być również genetycznie modyfikowane tak, aby wyrażały chimeryczne receptory antygenowe (CAR), które umożliwiają selektywne rozpoznawanie określonych antygenów. Ilościowe pomiary cytotoksyczności komórek NK są niezbędne do oceny początkowej funkcjonalności oraz do przedklinicznej ewaluacji przeciwciał monoklonalnych i strategii inżynierii CAR. Jednak in vitro testy funkcjonalne nadal są bardzo różnorodne w różnych laboratoriach z powodu różnic w przygotowaniu komórek, komórkach docelowych, proporcjach efektor-cel oraz czasach współinkubacji i metodach pomiarów, co ogranicza powtarzalność i możliwość porównywania różnych badań. W tym artykule przedstawiono znormalizowany protokół ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK za pomocą cytometrii przepływowej i obrazowania na żywo w czasie rzeczywistym. Pierwotne ludzkie komórki NK i komórki NK-92 wyrażające CAR były oceniane pod kątem ich zdolności do zabijania komórek nowotworowych i komórek pokrytych przeciwciałami w formacie 96-dołkowej płytki w celu zmierzenia naturalnej cytotoksyczności, zabijania za pośrednictwem CAR i ADCC. Przeżywalność komórek docelowych była mierzona ciągle za pomocą obrazowania na żywo lub w określonym punkcie czasowym za pomocą cytometrii przepływowej, co również umożliwiało charakteryzację fenotypową komórek NK i komórek docelowych. Te protokoły zapewniają solidną ramę za pomocą rutynowych metod hodowli tkankowej, obrazowania i cytometrii przepływowej, aby umożliwić powtarzalne ilościowe określenie funkcji efektorowych komórek NK w badaniach nad wrodzoną odpornością i immunoterapiami opartymi na komórkach NK.

Wprowadzenie

Komórki Natural Killer (NK) są wrodzonymi limfocytami, które odgrywają kluczową rolę w nadzorze immunologicznym przeciwko wirusowo zakażonym i złośliwym komórkom, wykazując szybką i silną cytotoksyczność¹. W przeciwieństwie do komórek B i T, komórki NK nie wykazują receptorów antygenowo-specyficznych i zamiast tego polegają na szeregiem receptorów aktywacyjnych i hamujących w celu wykrycia utraty ekspresji głównego zespołu zgodności tkankowej klasy I lub stresu komórkowego. Umożliwia im to mediację bezpośredniej cytotoksyczności poprzez uwolnienie granule cytotoksycznych zawierających perforację i granzymy lub, w niektórych przypadkach, poprzez aktywację receptorów śmierci^1,2,3,4. Oprócz naturalnej cytotoksyczności, komórki NK wykazują FcγRIII (CD16), receptor, który rozpoznaje fragment Fc immunoglobuliny G (IgG) i wpływa na cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC) przeciwko komórkom docelowym pokrytym IgG^5,6.

Ze względu na swoje wrodzone mechanizmy cytotoksyczne i korzystny profil bezpieczeństwa, komórki NK stały się obiecującymi kandydatami do immunoterapii komórkowej. Dzięki potencjałowi zastosowania allogenicznego, komórki NK mogą funkcjonować jako terapia "pod ręką" z minimalnym ryzykiem choroby przeszczepu przeciw gospodarzowi, umożliwiając szersze zastosowanie kliniczne i obniżając koszty⁷. Ostatnie osiągnięcia dalece poszerzyły terapeutyczny potencjał komórek NK poprzez strategie inżynierii genetycznej, w tym wprowadzanie chimerycznych receptorów antygenowych (CAR) które przekierowują komórki NK do rozpoznawania specyficznych antygenów nowotworowych. CAR-NK wykazały skuteczność przeciwnowotworową w in vivo modelach ksenograftu i badaniach klinicznych, z mniejszą toksycznością w porównaniu z komórkami CAR-T^8,9,10. Dlatego wzrasta zainteresowanie rozwijaniem inżynieryjnych platform dla komórek NK i strategii terapeutycznych opartych na przeciwciałach. W tym kontekście, dokładne i ilościowe pomiary zdolności do zabijania komórek NK są niezbędne do zrozumienia biologii komórek NK, oceny skuteczności CAR lub innych inżynieryjnych terapii komórek NK oraz oceny przeciwciał monoklonalnych, które polegają na ADCC.

Różnorodne in vitro metody były szeroko stosowane w laboratoriach w celu oceny cytotoksyczności komórek NK. Typowymi metodami są testy uwalniania radioaktywnego chromu-51, testy uwalniania dehydrogenazy mleczanowej oraz testy uwalniania kalceiny-acetoksymetylowej^11,12. Chociaż te tradycyjne metody były szeroko stosowane do pomiaru cytotoksyczności, opierają się na pośrednich wskaźnikach śmierci komórkowej, dostarczają pomiarów końcowych zamiast danych kinetycznych oraz oferują ograniczoną czułość i zakres dynamiczny. Nie dostarczają również informacji o fenotypie lub stanie aktywacji komórek efektorowych. Ostatnio, platformy obrazowania żywych komórek i cytometria przepływowa są coraz częściej stosowane, ponieważ umożliwiają bezpośrednie ilościowe pomiary przeżycia komórek docelowych, monitorowanie zabijania w czasie oraz jednoczesną analizę fenotypową komórek efektorowych i docelowych^13,14. Jednak nawet wśród tych nowszych podejść istnieje znaczna zmienność między laboratoriami i opublikowanymi badaniami, w tym różnice w przygotowaniu komórek docelowych, stosunkach efektor-do-cel (E:T) i czasach współinkubacji, co ogranicza powtarzalność i porównania między badaniami, szczególnie w ocenach przedklinicznych immunoterapii opartych na komórkach NK.

Niniejszy artykuł przedstawia standaryzowany proces ilościowej oceny cytotoksyczności komórek NK przy użyciu dwóch niezależnych, uzupełniających się platform: obrazowanie żywych komórek w czasie rzeczywistym (IncuCyte SX5) oraz testy końcowe oparte na cytometrii przepływowej. Obrazowanie żywych komórek umożliwia ciągłe monitorowanie przeżycia komórek docelowych podczas współhodowli z komórkami efektorowymi, pozwalając na kinetyczną ocenę cytotoksyczności w wielu stosunkach E:T i warunkach eksperymentalnych przy minimalnym manipulowaniu testem¹⁵. W przeciwieństwie do cytometrii przepływowej, która dostarcza wysoce wrażliwej pomiaru końcowego śmierci komórek docelowych, wraz z jednoczesną charakterystyką fenotypową komórek NK i komórek docelowych przy użyciu panelu barwników wielomarkerowych.

Dodatkowo, ten protokół uwzględnia standaryzowane parametry eksperymentalne, w tym stosunki E:T, warunki inkubacji, format płytki i przepływy analityczne, aby poprawić powtarzalność i ułatwić porównanie pomiarów cytotoksyczności między laboratoriami i badaniami. Proces umożliwia ilościową ocenę wielu funkcji efektorowych NK, w tym naturalnej cytotoksyczności, zabijania z pośrednictwem CAR oraz ADCC, i jest kompatybilny z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK i liniami komórek NK.

Protokół

Wykorzystanie próbek od ludzkich dawców do celów badawczych zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Recenzencką (Institutional Review Board) i przeprowadzono je zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (numer zatwierdzenia #2022P000699).

1. Analiza zabijania z obrazowaniem żywych komórek w czasie rzeczywistym

1. Powlekanie płytek
   1. Do siatki 6 × 10 w płytce 96-dołkowej o płaskim dnie dodać 50 µL/dołek poli-D-lizyny (0,1 mg/mL w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem [PBS]). Delikatnie potrząsnąć płytką, aby upewnić się, że dno każdego dołka jest całkowicie pokryte.
   2. Inkubować płytkę przez 2 h w temperaturze pokojowej (RT; 18°C–26°C) z zamkniętą pokrywą.
   3. Przemyć dołki 3× za pomocą 200 µL/dołek PBS i odpiłować nadsącz.
      UWAGA: Powleczone płytki można uszczelnić parafilmem i przechowywać w temperaturze 4°C do 1 tygodnia, dodając do każdego dołka 200 µL PBS. Przed użyciem należy upewnić się, że płytki pozostały sterylne, usunąć PBS i pozwolić im wyrównać temperaturę do RT.
2. Przygotowanie komórek docelowych
   1. Przygotować 10 mL 2× SYTOX Orange (200 nM), rozcieńczając roztwór stokowy SYTOX Orange (250 µM w DMSO) w pożywce hodowlanej NK-92 (dodać 8 µL stoku do objętości całkowitej 10 mL) w probówce wirówkowej o stożkowym dnie o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Pożywka hodowlana dla komórek NK-92 składa się z pożywki Advanced RPMI-1640, 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 2 mM L-alanylo-L-glutaminy, 100 µg/mL primocyny i 500 U/mL ludzkiej IL-2.
      OSTRZEŻENIE: SYTOX Orange jest barwnikiem fluorescencyjnym i może stwarzać zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Należy go używać z odpowiednimi środkami ochrony osobistej i zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa.
   2. Policzyć komórki docelowe, stosując metodę liczenia opartą na wykluczaniu barwnika (np. błękit trypanowy) lub równoważną zwalidowaną metodę (np. automatyczny licznik komórek).
      UWAGA: W tym teście komórkami docelowymi były komórki Ramos, linia komórkowa chłoniaka z komórek B wykazująca ekspresję antygenu dojrzewania komórek B (BCMA⁺), zmodyfikowana tak, aby eksprymowała białko fluorescencyjne bliskiej podczerwieni (NIR) emiRFP670.
   3. Przenieść wymaganą ilość do probówki wirówkowej o stożkowym dnie o pojemności 15 mL.
   4. Wirować (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   5. Odpiłować nadsącz.
   6. Resuspendować komórki docelowe do końcowego stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL (2,5 × 10⁴ komórek/100 µL) w pożywce 2× SYTOX Orange.
      UWAGA: Resuspendowane komórki docelowe można utrzymać w temperaturze 37°C z 5% CO₂ w probówce do 30 min podczas przygotowywania rozcieńczeń komórek efektorowych.
      UWAGA: Dla jednej pełnej płytki: 60 dołków × 2,5 × 10⁴ komórek/dołek = 1,5 × 10⁶ łącznie komórek docelowych. Przygotować 2,0 × 10⁶ komórek, aby uwzględnić straty. Dostosować liczbę komórek w zależności od wielkości testu i pożądanej gęstości zasiewu.
3. Przygotowanie komórek efektorowych
   1. Ocenić stężenie i żywotność komórek NK-92, stosując metodę liczenia opartą na wykluczaniu barwnika (np. błękit trypanowy) lub równoważną zwalidowaną metodę. Kontynuować tylko w przypadku żywotności ≥80%, ponieważ niższa żywotność może wpłynąć na wyniki testu.
      UWAGA: Jako komórki efektorowe zastosowano komórki NK-92 zmodyfikowane w celu stabilnej ekspresji białka fluorescencyjnego ZsGreen, albo samodzielnie (kontrola), albo wraz z konstruktami CAR skierowanymi przeciwko BCMA.
   2. Policzyć i przenieść wymaganą liczbę komórek do oddzielnych probówek wirówkowych o stożkowym dnie o pojemności 15 mL.
      UWAGA: Obliczyć całkowitą liczbę wymaganych komórek efektorowych, sumując liczbę komórek potrzebnych dla wszystkich stosunków E:T dla jednego powtórzenia, mnożąc przez liczbę powtórzeń i dodając 50% nadmiaru w celu uwzględnienia strat komórkowych. Zaokrąglić liczby w razie potrzeby, aby ułatwić przygotowanie. Na przykład dla stosunków E:T od 2:1 do 0,25:1 użyć 1,5 × 10⁵ komórek NK na powtórzenie. Dla powtórzeń trzykrotnych przygotować 4,5 × 10⁵ komórek na warunek zgodnie z układem płytki opisanym na Rysunku uzupełniającym 1A.
   3. Wirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [brake] = maksymalne).
   4. Odpiłować nadsącz.
   5. Resuspendować komórki do końcowego stężenia 5,0 × 10⁵ komórek/mL (5,0 × 10⁴ komórek/100 µL).
4. Przygotowanie rozcieńczeń komórek efektorowych
   1. Przygotować rozcieńczenia komórek efektorowych, w tym kontrolę z samymi komórkami docelowymi, w płytce 96-dołkowej o okrągłym dnie (patrz Rysunek uzupełniający 1A w celu uzyskania reprezentatywnego układu płytki z czterema warunkami w powtórzeniach trzykrotnych). Każdy warunek jest przygotowany w trzech powtórzeniach.
   2. Dodać 240 µL/dołek komórek efektorowych (5,0 × 10⁵ komórek/mL) do dołków odpowiadających stosunkowi E:T 2:1.
   3. Dodać 120 µL/dołek pożywki do wszystkich pozostałych dołków.
   4. Wykonać 2-krotne rozcieńczenia seryjne od dołków E:T = 2:1 do dołków E:T = 0,25:1. Wymieszać dokładnie, pipetując ≥5 razy, i zmieniać końcówki między transferami.
      UWAGA: Jeśli sesje obrazowania nie zostały zaplanowane w systemie obrazowania, należy je zaplanować przed ustawieniem kokultury. Przygotowane rozcieńczenia komórek efektorowych można utrzymać w temperaturze 37°C z 5% CO₂ w płytce 96-dołkowej o okrągłym dnie do 30 min podczas konfiguracji systemu obrazowania żywych komórek.
5. Ustawienie kokultury
   1. Pobrać płytkę 96-dołkową o płaskim dnie powleczoną poli-D-lizyną.
   2. Dodać 100 µL/dołek zawiesiny komórek docelowych do wszystkich dołków. Dokładnie resuspendować komórki docelowe bezpośrednio przed rozdzieleniem, pipetując w górę i w dół ≥5 razy za pomocą odpowiedniej pipety (np. 200 µL) i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza podczas transferu.
   3. Dodać 100 µL/dołek zawiesiny komórek efektorowych do odpowiadających im dołków. Dokładnie resuspendować komórki efektorowe bezpośrednio przed rozdzieleniem, pipetując w górę i w dół ≥5 razy za pomocą odpowiedniej pipety (np. 200 µL) i unikać tworzenia pęcherzyków powietrza podczas transferu.
   4. Dodać 200 µL/dołek PBS do otaczających nieużywanych dołków.
   5. Wirować płytkę (2 min, 100 × g, RT, przyspieszenie = niskie [np. 2]; hamowanie [brake] = niskie [np. 2]).
      UWAGA: To delikatne wirowanie jest kluczowe dla szybkiego i równomiernego osadzenia komórek na dnie dołka w celu dokładnego obrazowania w systemie IncuCyte SX5. Używamy stacjonarnej wirówki Eppendorf 5810R z rotorem z koszykami wahadłowymi, z ustawieniami przyspieszenia i hamowania na poziomie 2 (z 9).
   6. Umieścić płytkę w systemie obrazowania żywych komórek i pozyskiwać obrazy co 1 h przez 24 h (możliwość przedłużenia do 72 h w razie potrzeby). Upewnić się, że obrazowanie odbywa się w standardowych warunkach inkubacji (37°C/5% CO₂).
      UWAGA: Aby upewnić się, że obrazowanie w czasie t = 0 h dokładnie odzwierciedla bazową liczbę komórek docelowych, należy rozpocząć pozyskiwanie obrazów w ciągu 10–15 min po ustawieniu kokultury i wirowaniu. Dla pełnej płytki z trzema kanałami obrazowania (tj. zielonym, pomarańczowym i NIR), czas skanowania wynosi około 10 min na godzinę dla 3 obrazów/dołek przy powiększeniu 20×.
   7. Zweryfikować jakość obrazu po pierwszym skanowaniu i w razie potrzeby dostosować ustawienia.
6. Ustawienia instrumentu
   1. Ustawić rozdzielanie spektralne (spectral unmixing), aby skorygować przenikanie fluorescencji SYTOX Orange do kanału zielonego. Dostosować wartość rozdzielania w oprogramowaniu, porównując kanał zielony i pomarańczowy i potwierdzając, że martwe komórki Orange⁺ nie są błędnie wykrywane jako Green⁺. Dla reprezentatywnego eksperymentu (Rysunek 1) wkład kanału pomarańczowego do kanału zielonego ustawiono na 8,5%. Wartości te są specyficzne dla zestawu danych i powinny być optymalizowane dla każdego eksperymentu.
   2. Skonfigurować analizę komórka po komórce (Cell-by-Cell) dla komórek nieadherentnych, aby zapewnić dokładną segmentację i maskowanie wszystkich komórek w każdym polu widzenia (patrz Rysunek uzupełniający 1B w celu uzyskania reprezentatywnego ustawienia). Dla systemu obrazowania żywych komórek przy użyciu modeli linii komórkowych efektorowych i docelowych w zawiesinie zaleca się następujące parametry:
      1. Ustawić oczekiwaną średnicę obiektu na 15 µm (przybliżona średnica komórki).
      2. Ustawić czułość progu (threshold sensitivity) i czułość tekstury (texture sensitivity) na 5.
      3. Ustawić czułość krawędzi (edge sensitivity) na 10, aby ułatwić rozdzielanie skupisk komórek.
      4. Ustawić zakres filtra akceptowanej powierzchni obiektu na 50–2000 µm², aby wykluczyć zanieczyszczenia i duże obiekty.
      5. Ustawić maksymalną ekscentryczność na 0,95, aby wykluczyć obiekty niekomórkowe.
   3. Skonfigurować progi klasyfikacji (patrz Rysunek uzupełniający 1C w celu uzyskania reprezentatywnego bramkowania). Użyć dołków kontrolnych z samymi komórkami docelowymi do zdefiniowania bazowej populacji żywych komórek docelowych NIR⁺/Orange⁻. Następnie użyć dołków z kokulturą w późniejszych punktach czasowych (np. t = 4 h), aby potwierdzić wyraźne oddzielenie z minimalnym nakładaniem się populacji NIR⁺/⁻ i Orange⁺/⁻. Przykładowe progi klasyfikacji i parametry analizy przedstawiono na Rysunku uzupełniającym 1C.
      1. Ustawić próg intensywności Orange na około 15.
      2. Ustawić próg intensywności NIR na około 0,1.
         UWAGA: Wartości parametrów i progów mogą się różnić w zależności od instrumentu, oprogramowania, modelu linii komórkowej i intensywności sygnału fluorescencyjnego.
         UWAGA: Protokół ten można dostosować do testów cytotoksyczności pierwotnych ludzkich komórek NK lub testów ADCC, jeśli komórki docelowe stabilnie wykazują fluorescencję NIR (np. emiRFP670). Można go również dostosować do testów zabijania opartych na cytometrii przepływowej, pomijając powlekanie poli-D-lizyną i stosując płytki 96-dołkowe o płaskim lub okrągłym dnie.

Rysunek 1. Ilościowe określanie kinetyki i siły cytotoksyczności komórek NK-92 z chimerycznym receptorem antygenowym (CAR) przy użyciu obrazowania żywych komórek w czasie rzeczywistym. (A) Schematyczny przegląd testu obrazowania żywych komórek IncuCyte do monitorowania cytotoksyczności indukowanej przez komórki NK. Komórki docelowe Ramos BCMA⁺ wykazujące ekspresję emiRFP670 (kanał bliskiej podczerwieni [NIR]) są współhodowane z komórkami efektorowymi NK-92 wykazującymi ekspresję ZsGreen (kanał zielony), a śmierć komórek jest wykrywana za pomocą SYTOX Orange (kanał pomarańczowy). (B) Reprezentatywny obraz fluorescencyjny studni z współhodowlą przy stosunku efektorów do komórek docelowych (E:T) 1:1 po 12 h. Żywe komórki docelowe (emiRFP670⁺) zaznaczono kolorem niebieskim, komórki efektorowe NK-92 (ZsGreen⁺) kolorem zielonym, a martwe komórki (SYTOX Orange⁺) kolorem czerwonym. Obrazy uzyskano przy użyciu modułu analizy Cell-by-Cell dla komórek nieprzywierających przy powiększeniu 20×. Pasek skali = 100 µm. (C) Ilościowe określenie wzrostu i przeżywalności komórek docelowych w czasie przy różnych stosunkach E:T dla komórek NK-92 kontrolnych i wykazujących ekspresję CAR. (D) Ilościowe określenie przeżywalności komórek docelowych jako funkcji stosunku E:T w wielu punktach czasowych (4, 8, 16 i 24 h). Liczba komórek docelowych została znormalizowana względem studni zawierających tylko komórki docelowe (E:T = 0:1) w każdym punkcie czasowym. (E) Schematyczne przedstawienie parametrów ilościowych użytych do oceny cytotoksyczności: KR₅₀, stosunek efektorów do komórek docelowych wymagany do osiągnięcia 50% zabicia po 12 h; KT₅₀, czas wymagany do osiągnięcia 50% zabicia przy stosunku E:T 1:1; oraz IKI₅₀, zintegrowany indeks zabijania zdefiniowany jako pole powierzchni mapy ciepła poniżej izokliny 50% przeżywalności. (F) Mapy ciepła pokazujące wzrost i przeżywalność komórek docelowych jako funkcję stosunku E:T i czasu dla każdego stanu efektorów. Wartości ilościowe dla KR₅₀, KT₅₀ i IKI₅₀ są wskazane dla każdego stanu. Surowe dane dotyczące liczby żywych komórek docelowych uzyskano z populacji NIR⁺/SYTOX Orange^– za pomocą analizy klasyfikacyjnej Cell-by-Cell w oprogramowaniu IncuCyte 2021C. Wszystkie warunki przeprowadzono w trzech powtórzeniach (n = 3). Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe. Do modelowania trendów cytotoksyczności w panelach D i F zastosowano nieliniową analizę regresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

2. Ilościowe oznaczanie cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał metodą cytometrii przepływowej

1. Przygotowanie pierwotnych ludzkich komórek NK
   UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki NK zostały wyizolowane z krwi obwodowej wzbogaconej w leukocyty, pobranej od zdrowych dorosłych dawców, przy użyciu metody wzbogacania w komórki NK, a następnie centryfugacji w gradiencie gęstości, jak opisano wcześniej³. Oczyszczone komórki NK kriokonserwowano w stężeniu 5 × 10⁶ komórek/mL w roztworze do mrożenia (90% FBS i 10% dimetylosulfoksyd [DMSO]) w aliquotach 0,5 mL w krioprobówkach i przechowywano w temperaturze poniżej −150°C do momentu użycia³.
   1. Rozmrozić jedną probówkę zawierającą 5 × 10⁶ pierwotnych ludzkich komórek NK poprzez delikatne wstrząsanie krioprobówką w łaźni wodnej o temperaturze 37°C przez około 1 min, aż pozostanie tylko mały kryształ lodu.
      OSTROŻNIE: Wszystkie próbki pochodzenia ludzkiego należy obchodzić zgodnie z odpowiednimi procedurami bezpieczeństwa biologicznego i przy użyciu środków ochrony indywidualnej, zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi.
      OSTROŻNIE: DMSO ułatwia wchłanianie substancji chemicznych przez skórę. Należy stosować odpowiedni sprzęt ochronny i unikać bezpośredniego kontaktu.
   2. Przenieść rozmrożone komórki do 15-ml probówki wirówkowej z dnem stożkowym zawierającej 10 mL podgrzanego (37°C) medium do hodowli komórek NK i wymieszać poprzez delikatne wirowanie.
      UWAGA: Medium do hodowli komórek NK składa się z Advanced RPMI-1640 uzupełnionego o 10% FBS, 10% ludzką surowicę AB, 2 mM L-alanylo-L-glutaminę, 100 µg/mL primocyny oraz 50 U/mL ludzkiego IL-2.
   3. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   4. Odlać nadsącz.
   5. Resuspendować osad w 5 mL podgrzanego (37°C) medium do hodowli komórek NK.
   6. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   7. Odlać nadsącz.
   8. Resuspendować osad w 1 mL podgrzanego medium do hodowli komórek NK.
   9. Przenieść zawiesinę do jednego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkanek.
   10. Dodać 1 mL sterylnego PBS do sąsiednich dołków, aby zminimalizować parowanie.
   11. Inkubować 24-dołkową płytkę pod kątem 45° (używając statywu do płytek lub podpórki w celu utrzymania kąta) w temperaturze 37°C przy 5% CO₂ przez 16–24 h, aby umożliwić regenerację komórek NK.
       UWAGA: Pierwotne ludzkie komórki NK wymagają bliskiego kontaktu komórka-komórka dla maksymalnego przeżycia i regeneracji, co można osiągnąć poprzez przechylenie 24-dołkowej płytki i umożliwienie ich gromadzenia się przy krawędziach dołków. Należy zachować spójny czas inkubacji we wszystkich eksperymentach.
       UWAGA: Po okresie regeneracji przejść bezpośrednio do przygotowania komórek docelowych i zestawienia ko-kultury.
2. Barwienie komórek docelowych przy użyciu estru sukcynimidylowego karboksyfluoresceiny (CFSE).
   1. Przygotować 5 × 10⁵ komórek docelowych i przenieść je do 15-ml probówki wirówkowej z dnem stożkowym.
      UWAGA: Jako komórki docelowe wykorzystano linię komórkową chłoniaka pochodzącą od pacjenta CD38⁺¹⁶.
   2. Przemyć komórki raz 10 mL PBS.
   3. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   4. Przygotować 0,5 µM roztwór roboczy CFSE w PBS z 5 mM roztworu stokowego poprzez rozcieńczenie 1 µL 5 mM CFSE w 10 mL PBS w 15-ml probówce wirówkowej z dnem stożkowym.
      OSTROŻNIE: CFSE jest reaktywnym barwnikiem fluorescencyjnym wiążącym się z aminami i może stwarzać zagrożenie w przypadku kontaktu ze skórą lub oczami. Należy go używać w odpowiednich środkach ochrony indywidualnej i utylizować niezużyty odczynnik zgodnie z lokalnymi wytycznymi bezpieczeństwa biologicznego.
   5. Odlać nadsącz.
   6. Resuspendować osad w roztworze CFSE do stężenia około 1 × 10⁶ komórek/mL.
   7. Inkubować przez 15 min w temperaturze 37°C, owijając probówkę folią aluminiową lub umieszczając ją w nieprzezroczystym pojemniku w celu ochrony przed światłem.
   8. Zatrzymać reakcję poprzez dodanie 5–10 objętości medium hodowlanego.
   9. Inkubować przez 5 min w temperaturze 37°C.
   10. Odwirować komórki (5 min, 300 × g, RT, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   11. Odlać nadsącz.
   12. Resuspendować komórki do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL, tak aby 100 µL zawierało 2,5 × 10⁴ komórek.
       UWAGA: Przejść bezpośrednio do wysiewania, aby zachować spójną intensywność sygnału CFSE i żywotność komórek docelowych.
3. Wysiewanie komórek docelowych
   1. Przygotować 96-dołkową płytkę z dnem okrągłym.
   2. Dodać 100 µL/dołek komórek docelowych (2,5 × 10⁵ komórek/mL) do wyznaczonych dołków za pomocą pipety wielokanałowej (patrz Rycina uzupełniająca 2). Każdy wariant wysiewany jest w trzech powtórzeniach.
      UWAGA: Przed wysiewaniem należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest jednorodna.
4. Przygotowanie i dodanie przeciwciał
   1. Przygotować 200 µL 4× roztworu przeciwciała (100 µg/mL) w medium do hodowli komórek NK dla każdego testowanego przeciwciała i dopasowanej kontroli izotypowej.
      UWAGA: Ten krok jest modułowy i może być dostosowany do każdego przeciwciała pośredniczącego w ADCC przeciwko wybranej linii komórek docelowych. Stężenia stokowe i formulacje przeciwciał mogą się różnić; należy odpowiednio dostosować rozcieńczenia. Konserwanty, takie jak azydki, mogą wpływać na przeżywalność komórek docelowych i funkcjonalność komórek NK. Chociaż można przetestować zakres stężeń przeciwciał, w tym protokole zastosowano stężenie końcowe 25 µg/mL.
   2. Przenieść roztwory przeciwciał do płytki z głębokimi dołkami.
   3. Dodać 50 µL/dołek roztworu przeciwciała do komórek docelowych i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   4. Dodać 50 µL/dołek medium do hodowli komórek NK do dołków kontrolnych bez przeciwciał i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   5. Inkubować przez 25–30 min w temperaturze 37°C przy 5% CO₂.
5. Przygotowanie i dodanie komórek NK
   1. Policzyć i przygotować 2 × 10⁵ komórek NK, stosując metodę liczenia komórek opartą na wykluczaniu barwnika (np. błękit trypanu) lub równoważną zwalidowaną metodę. Liczba ta jest wystarczająca dla trzech wariantów zawierających komórki NK wysiewanych w trzech powtórzeniach, z nadmiarem uwzględniającym straty podczas pipetowania (patrz Rycina uzupełniająca 2). Kontynuować, jeśli żywotność wynosi ≥75%, ponieważ niższa żywotność może wpływać na wyniki testu.
   2. Resuspendować komórki do stężenia 2,5 × 10⁵ komórek/mL w 800 µL pierwotnego ludzkiego medium do hodowli komórek NK (stężenie końcowe = 1,25 × 10⁴ komórek/50 µL).
   3. Dodać 50 µL/dołek komórek NK do odpowiednich dołków i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie ≥5 razy.
      UWAGA: Przed wysiewaniem należy upewnić się, że zawiesina komórkowa jest jednorodna.
   4. Dodać 50 µL/dołek medium hodowlanego do dołków kontrolnych i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie ≥5 razy.
6. Zestawienie końcowej ko-kultury
   1. Uważnie sprawdzić 96-dołkową płytkę z dnem okrągłym, aby potwierdzić, że wszystkie dołki zawierają 200 µL z jednolitymi poziomami menisku i bez pęcherzyków powietrza.
   2. Odwirować płytkę (2 min, 100 × g, przyspieszenie = niskie [np. 2]; hamowanie [hamulec] = niskie [np. 2]).
      UWAGA: To delikatne wirowanie jest ważne dla szybkiego osadzenia komórek i zwiększenia kontaktu komórka-komórka. Używamy laboratoryjnej wirówki Eppendorf 5810R kompatybilnej z rotorem z koszykami wahadłowymi z ustawieniami przyspieszenia i hamowania na poziomie 2 (z 9).
   3. Inkubować przez 16–18 h (całą noc) w temperaturze 37°C przy 5% CO₂.
      UWAGA: Ten czas inkubacji jest zoptymalizowany pod kątem odczytu cytotoksyczności, a nie degranulacji, którą najlepiej oceniać poprzez pomiar ekspresji CD107a we wcześniejszych punktach czasowych (2–6 h). W związku z tym szczytowe odpowiedzi degranulacyjne mogą być niedoszacowane.
      UWAGA: Nie przedłużać inkubacji powyżej 18 h, ponieważ przedłużona ko-kultura może prowadzić do nadmiernej śmierci komórek docelowych w dołkach kontrolnych i zmniejszenia zakresu dynamicznego między wariantami doświadczalnymi.
7. Wykonanie cytometrii przepływowej
   1. Odwirować (5 min, 300 × g, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   2. Odlać nadsącz.
   3. Przemyć wszystkie dołki 200 µL/dołek buforu FACS (2% FBS, 2 mM EDTA w PBS).
   4. Przygotować master mix przeciwciał powierzchniowych w buforze FACS, dodając CD56-BV421 w rozcieńczeniu 1:50, CD16-BV785 w rozcieńczeniu 1:50 oraz CD107a-PE-Cy7 w rozcieńczeniu 1:25.
      UWAGA: Obliczyć całkowitą objętość master mixu na podstawie projektu płytek doświadczalnych (liczba dołków × 50 µL/dołek + 20% zapasu). Klon przeciwciał może różnić się intensywnością barwienia i dostępnością epitopu. Klony użyte w reprezentatywnych danych są wymienione w Tabeli Materiałów, a alternatywne klony mogą wymagać miareczkowania. Można dołączyć dodatkowe przeciwciała do fenotypowania subpopulacji komórek NK (np. KIRs, NKG2A/C/D oraz CD57) i markerów aktywacji (np. CD69 i HLA-DR).
   5. Resuspendować komórki w 50 µL/dołek master mixu przeciwciał i dokładnie wymieszać poprzez pipetowanie ≥5 razy.
   6. Inkubować przez 15 min w temperaturze 4°C, owijając płytkę folią aluminiową lub umieszczając ją w nieprzezroczystym pojemniku w celu ochrony przed światłem.
   7. Dodać 150 µL/dołek buforu FACS.
   8. Odwirować (5 min, 300 × g, przyspieszenie = maksymalne; hamowanie [hamulec] = maksymalne).
   9. Odlać nadsącz.
   10. Resuspendować komórki w 100 µL/dołek 5 µM 4′,6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w buforze FACS i natychmiast przejść do akwizycji w cytometrii przepływowej. Inkubacja przed akwizycją nie jest wymagana.
   11. Zebrać dane za pomocą cytometrii przepływowej i zarejestrować kanały fluorescencji dla CFSE, BV421, BV785, PE-Cy7, DAPI oraz wszelkich dodatkowych fluoroforów.
       UWAGA: Ustawienia akwizycji (np. napięcia detektora, kompensacja i bramkowanie) mogą wymagać optymalizacji. Do ustawienia kompensacji i bramkowania należy użyć kontroli niebarwionych i pojedynczo barwionych, stosując kulek kompensacyjnych lub reprezentatywnych komórek, zależnie od potrzeb. W przypadku markerów o ciągłej lub słabej ekspresji (np. CD107a) należy rozważyć zastosowanie kontroli Fluorescence-minus-one (FMO). Należy zachować spójne ustawienia i strategię bramkowania, w tym bramkowanie żywe/martwe oraz identyfikację populacji docelowych i efektorowych, we wszystkich eksperymentach.
       UWAGA: Zarówno Krok 1, jak i Krok 2 mogą być dostosowane do przylegających komórek docelowych. Wysiać komórki docelowe (w ich odpowiednich mediach hodowlanych) na 96-dołkowej płytce z dnem płaskim na jeden dzień przed ko-kulturą, w zagęszczeniu, które pozwoli osiągnąć około 70% konfluencji w dniu testu. Po potwierdzeniu przylegania odlać medium komórek docelowych i zastąpić je 100 µL świeżego medium dla komórek NK, a następnie dodać komórki efektorowe, aby rozpocząć ko-kulturę. Ze względu na różnice w wielkości i morfologii komórek, parametry analizy IncuCyte Cell-by-Cell powinny być zoptymalizowane dla każdej linii komórek przylegających.
       UWAGA: W przypadku testów opartych na cytometrii przepływowej z komórkami przylegającymi, po ko-kulturze odwirować płytkę (300 × g, 5 min) i odlać nadsącz. Dodać 100 µL/dołek TrypLE i inkubować w 37°C przy 5% CO₂ przez około 5–15 min (w zależności od linii komórkowej), aby odkleić komórki. Dodać 100 µL/dołek buforu FACS, wymieszać pipetując w górę i w dół ruchem okrężnym i przenieść wszystkie komórki do 96-dołkowej płytki z dnem okrągłym. Sprawdzić dołki mikroskopowo, aby potwierdzić całkowite odklejenie przed przejściem do barwienia (Krok 2, podkrok 7). Zoptymalizować czas inkubacji z TrypLE zgodnie z potrzebami, aby uzyskać zawiesinę pojedynczych komórek.

Wyniki

Aby ilościowo określić cytotoksyczność komórek NK w czasie rzeczywistym, komórki efektorowe NK-92 zmodyfikowane w celu ekspresji CAR przeciwko BCMA współhodowano z komórkami docelowymi Ramos BCMA⁺ w czarnej, przezroczystej płytce 96-dołkowej z płaskim dnem i monitorowano za pomocą obrazowania żywych komórek (Rysunek 1A oraz Rysunek uzupełniający 1A). Komórki efektorowe dodawano w stosunkach E:T wynoszących 0:1 (tylko komórki docelowe), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdy warunek powtórzono w trzech próbkach. Oceniać trzy różne konstrukty CAR NK-92: CAR1 bez domeny kostymulującej, CAR2 z domeną kostymulującą 4-1BB (CD137) oraz CAR3 z domeną kostymulującą DAP10, wraz z kontrolnymi komórkami NK-92 wykazującymi ekspresję samego wektora ZsGreen. Wszystkie komórki efektorowe otrzymano poprzez transdukcję lentiwirusową, zgodnie z wcześniejszym opisem⁴, wykorzystując kasety transgenowe ZsGreen-P2A-CAR. Komórki docelowe Ramos transdukowano w analogiczny sposób wektorem lentiwirusowym kodującym emiRFP670. Wzrost i przeżywalność komórek docelowych śledzono co godzinę przez okres 24 h za pomocą urządzenia do obrazowania żywych komórek, mierząc fluorescencję zieloną dla komórek NK-92 ZsGreen⁺, fluorescencję pomarańczową dla martwych komórek SYTOX Orange⁺ oraz fluorescencję NIR dla komórek docelowych emiRFP670⁺ (Rysunek 1A oraz Rysunek uzupełniający 1B i 1C).

Obrazy mikroskopowe pozyskano w określonych odstępach czasu, aby zwizualizować komórki efektorowe, żywe komórki docelowe oraz komórki martwe podczas kokultury (Rycina 1B). Ilościowe określenie wzrostu i przeżywalności komórek docelowych wykazało, że komórki CAR2 i CAR3 NK-92 charakteryzowały się szybszą kinetyką zabijania niż komórki CAR1 NK-92, szczególnie we wczesnych punktach czasowych przy stosunku E:T wynoszącym 1:1. Zabijanie komórek docelowych wzrastało wraz z wyższymi stosunkami E:T, w tym w przypadku kontrolnych komórek NK-92, które wykazały naturalną cytotoksyczność (Rycina 1C). Pomiary te podkreślają zdolność obrazowania żywych komórek do rejestrowania dynamicznych zmian w aktywności cytotoksycznej. Przeżywalność komórek docelowych analizowano również jako funkcję stosunku E:T w określonych punktach czasowych, aby porównać potencję komórek CAR NK-92. Komórki CAR2 i CAR3 NK-92 wykazały większą potencję przy niższych stosunkach E:T w późniejszych punktach czasowych (np. E:T = 0,25:1 po 24 h) oraz przy średnich stosunkach E:T we wczesnych punktach czasowych (np. E:T = 1:1 po 4 h) (Rycina 1D). W przeprowadzonych analizach nie zaobserwowano istotnych różnic w zabijaniu pomiędzy efektorowymi komórkami CAR2 i CAR3 NK-92.

Mapa ciepła integrująca stosunek E:T, czas wspólnej inkubacji i przeżywalność komórek docelowych zapewnia kompleksową wizualizację cytotoksyczności naturalnej oraz CAR-zależnej we wszystkich populacjach efektorowych i umożliwia ocenę ilościową. Zdefiniowano trzy parametry w celu określenia siły działania i kinetyki: KR₅₀, czyli stosunek komórek zabójczych do docelowych, przy którym uzyskuje się 50% zabicia (po 12 h); KT₅₀, czyli czas wspólnej inkubacji wymagany do osiągnięcia 50% zabicia (przy stosunku E:T wynoszącym 1:1); oraz IKI₅₀, zintegrowany indeks zabójczych, reprezentujący obszar mapy ciepła poniżej 50% przeżywalności, wyznaczony przez izoklinę 50% przeżywalności (Rysunek 1E). Metryki te umożliwiają porównanie siły działania komórek CAR NK-92 (KR₅₀), kinetyki zabijania (KT₅₀) oraz zintegrowanej wydajności cytotoksycznej (IKI₅₀) (Rysunek 1F). Analiza ta pokazuje, w jaki sposób test może ilościowo porównywać zmodyfikowane platformy komórek NK w oparciu o wiele parametrów w ramach jednego eksperymentu.

Do pomiaru ADCC wykorzystano cytometrię przepływową z liczeniem komórek, polegającą na kokulturze fluorescencyjnie znakowanych komórek docelowych z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK w obecności lub przy braku przeciwciał terapeutycznych oraz ilościowym oznaczeniu pozostałej populacji żywych komórek docelowych po 16–18 h inkubacji (Rysunek 2A). Można zastosować cytometry przepływowe takie jak Cytek Aurora, BD Symphony lub BD Fortessa z wysokoprzepustowym próbnikiem. W reprezentatywnej konfiguracji (Rysunek dodatkowy 2) komórki docelowe chłoniaka pochodzenia pacjenta CD38⁺ wysiano do okrągłodennej płytki 96-dołkowej, a do odpowiednich dołków dodano daratumumab (lub przeciwciało izotypowe). Następnie przeprowadzono kokulturę z komórkami NK w stosunku E:T wynoszącym 0,5:1; stosunek ten został zoptymalizowany dla tych komórek docelowych, aby zminimalizować naturalną cytotoksyczność, umożliwiając jednocześnie detekcję ADCC. Po inkubacji wykonano cytometrię przepływową w celu rozdzielenia populacji komórek na podstawie rozproszenia światła przedniego i bocznego, wykluczenia zdarzeń nieżywotnych przy użyciu DAPI oraz oddzielenia komórek docelowych CFSE⁺ od komórek NK CD56⁺CD16⁺ do równoległej analizy (Rysunek 2B). Taki schemat pozwala na jednoczesny pomiar cytotoksyczności i charakterystykę fenotypową.

Rycina 2. Test cytotoksyczności komórkowej zależnej od przeciwciał (ADCC) oparty na cytometrii przepływowej umożliwia jednoczesną kwantyfikację przeżywalności komórek docelowych i aktywacji komórek NK. (A) Schematyczny przegląd testu ADCC. Komórki docelowe chłoniaka CD38⁺ znakowane CFSE wysiano w zagęszczeniu 2,5 × 10⁴ komórek na dołek i hodowano w pięciu warunkach: same komórki docelowe; komórki docelowe z daratumumabem (25 µg/mL); komórki docelowe z komórkami NK (E:T = 0,5:1); komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem oraz komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym (25 µg/mL). (B) Reprezentatywna strategia bramkowania w cytometrii przepływowej. Zdarzenia najpierw bramkowano według rozproszenia przedniego (FSC) i bocznego (SSC), a następnie wykluczono komórki nieżywe za pomocą DAPI. Komórki docelowe zidentyfikowano jako zdarzenia CFSE⁺, a komórki NK jako zdarzenia CD56⁺ i CD16⁺. Degranulację komórek NK oceniano na podstawie ekspresji CD107a. (C) Kwantyfikacja przeżywalności komórek docelowych, wyrażona jako procent w stosunku do warunku kontrolnego z samymi komórkami docelowymi (ustalonego na 100%). (D) Kwantyfikacja degranulacji komórek NK, przedstawiona jako procent komórek CD107a⁺ w populacji komórek NK. Słupki reprezentują średnią ± odchylenie standardowe, a nałożone punkty reprezentują poszczególne dołki powtórzeń (n = 3). Analizę statystyczną wykonano za pomocą jednoczynnikowej analizy wariancji z testem wielokrotnych porównań post hoc Tukeya. Istotność statystyczną oznaczono następująco: *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Głównym punktem końcowym jest przeżywalność komórek docelowych, obliczana w bramce dla żywych komórek CFSE⁺ i znormalizowana względem warunku z samymi komórkami docelowymi, który przyjmuje wartość 100% przeżywalności. Normalizacja ta pozwala kontrolować spontaniczną utratę komórek docelowych i umożliwia bezpośrednie porównanie pomiędzy poszczególnymi warunkami. Na reprezentatywnych danych (Rysunek 2C) dodanie samego daratumumabu nie zmniejszyło przeżywalności komórek docelowych, co potwierdza, że przeciwciało nie ma bezpośredniego wpływu na żywotność komórek docelowych wobec braku komórek efektorowych. Ko-kultura z samymi komórkami NK zredukowała przeżywalność komórek docelowych do około 70%, co wskazuje na bazową cytotoksyczność naturalną. Dodanie daratumumabu dalej obniżyło przeżywalność do około 37%, co jest spójne ze zwiększoną cytotoksycznością zależną od przeciwciał, podczas gdy w warunku z kontrolą izotypową przeżywalność wyniosła około 62%, co jest wartością porównywalną z warunkiem z samymi komórkami NK. Pomyślne eksperymenty wykazują wyraźne rozróżnienie między warunkami z zastosowaniem przeciwciała a grupami kontrolnymi, przy wysokiej powtarzalności między powtórzeniami.

Wtórne fenotypowanie komórek NK zapewnia uzupełniające potwierdzenie związku między zabijaniem komórek docelowych a aktywacją efektorową. Degranulacja komórek NK, mierzona jako procent komórek NK CD107a⁺, była najniższa w kokulturze komórek NK i komórek docelowych bez przeciwciał, a najwyższa w warunkach z zastosowaniem daratumumabu (około 31%), podczas gdy kontrola izotypowa wykazała średnią degranulację (około 19%), co potwierdza aktywację zapośredniczoną przez przeciwciała (Rycina 2D). Wyniki te dowodzą, że test pozwala odróżnić zabijanie komórek docelowych od aktywacji efektorowej. Chociaż trendy degranulacji i przeżywalności są zazwyczaj zbieżne, nie pokrywają się one w pełni, co wskazuje, że reprezentują one powiązane, lecz odrębne procesy biologiczne.

Nieoptymalne eksperymenty zazwyczaj wykazują zmniejszoną separację między warunkami, zmienność liczby komórek w poszczególnych studniach, wysoką śmiertelność komórek docelowych w studniach kontrolnych, słabe barwienie CFSE lub podwyższoną tło degranulacji. Wyniki te mogą wynikać z niskiej żywotności komórek docelowych, niespójnego odzysku komórek NK, niewłaściwego mieszania lub zmienności w barwieniu i akwizycji. Ponieważ test niezależnie identyfikuje przedziały komórek docelowych i efektorowych, można go rozszerzyć o dodatkowe fenotypowanie komórek docelowych (np. gęstość antygenu lub ekspresję liganda) oraz szerszą charakterystykę komórek NK. Wprowadzenie warunku „tylko NK” pozwala dodatkowo określić poziom bazowej degranulacji i żywotność komórek NK. Taki wieloparametrowy projekt jest kluczową zaletą, umożliwiając interpretację funkcjonalnej cytotoksyczności w powiązaniu z mechanicznymi fenotypami immunologicznymi.

Rysunek dodatkowy 1. Reprezentatywny układ płytki i schemat analizy dla testu cytotoksyczności z obrazowaniem żywych komórek. (A) Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej dla testu zabijania przez komórki CAR NK. Cztery warunki komórek efektorowych są rozmieszczone w kwadrantach, z których każdy jest testowany przy stosunkach E:T wynoszących 0:1 (kontrola z samymi komórkami docelowymi), 0,25:1, 0,5:1, 1:1 oraz 2:1, przy czym każdy warunek jest powtórzony w trzech powtórzeniach (łącznie 60 dołków testowych). (B) Reprezentatywna konfiguracja analizy Cell-by-Cell dla komórek nieadherujących w oprogramowaniu IncuCyte 2021C, ilustrująca parametry rozdzielania spektralnego, segmentacji i maskowania użyte do identyfikacji poszczególnych komórek efektorowych i docelowych przy jednoczesnym wykluczeniu debris i agregatów. (C) Reprezentatywna strategia bramkowania klasyfikacji Cell-by-Cell z wykorzystaniem fluorescencji NIR względem SYTOX Orange w celu zdefiniowania populacji żywych komórek docelowych. Do potwierdzenia separacji między populacjami komórek żywych i martwych wykorzystano dołki z samymi komórkami docelowymi oraz dołki z kokulturą w przykładowym punkcie czasowym (t = 4 h). Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina dodatkowa 2. Reprezentatywny układ płytki dla testu ADCC opartego na cytometrii przepływowej. Reprezentatywny układ płytki 96-dołkowej ilustrujący pięć warunków eksperymentalnych naniesionych w trzech powtórzeniach w rzędach B–D i kolumnach 2–6 (łącznie 15 dołków testowych): (1) kontrola z samymi komórkami docelowymi, (2) komórki docelowe z daratumumabem, (3) komórki docelowe z komórkami NK, (4) komórki docelowe z komórkami NK i daratumumabem oraz (5) komórki docelowe z komórkami NK i przeciwciałem kontrolnym izotypowym. Komórki docelowe naniesiono w liczbie 2,5 × 10⁴ komórek na dołek, a komórki NK dodano w liczbie 1,25 × 10⁴ komórek na dołek, aby uzyskać stosunek E:T wynoszący 0,5:1. Przeciwciała zastosowano w końcowym stężeniu 25 µg/mL. Sąsiednie dołki wypełniono PBS w celu zminimalizowania parowania. Warunek z samymi komórkami docelowymi służył do normalizacji przeżywalności komórek docelowych, a kontrola izotypowa uwzględniała efekty wynikające z formulacji przeciwciał, niezależnie od specyficzności antygenowej. W zależności od podatności linii komórek docelowych może być wymagana optymalizacja stosunku E:T. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Te protokoły zapewniają dwa uzupełniające się podejścia do ilościowego określania cytotoksyczności komórek NK w standaryzowanym formacie 96-dołkowej płytki. Krok 1 wykorzystuje obrazowanie na żywo w czasie rzeczywistym do ciągłego monitorowania utraty komórek docelowych i nadaje się do oceny kinetyki naturalnego oraz pośredniczonego CAR zabijania dla wielu stosunków E:T. Krok 2 wykorzystuje cytometrię przepływową do ilościowego określania ADCC po określonym czasie współinkubacji, jednocześnie rozdzielając komponenty docelowe i efektorowe do analizy fenotypu¹⁷. Te metody, prezentowane jako uzupełniające się platformy assay, które mogą być wykorzystywane do modelowania odrębnych procesów biologicznych, są również łatwo zamieniane. Pierwotne ludzkie komórki NK mogą być używane do assayów ADCC opartych na obrazowaniu na żywo, a także mogą być przeprojektowane do zabijania pośredniczonego CAR w assayach cytometrii przepływowej. Ponadto, chociaż dzikobieżne komórki NK-92 nie wykazują ekspresji CD16¹⁸, wdrożenie CD16 (np. poprzez transdukcję lentiwirusową) pozwala komórkom NK-92 na pośredniczenie silnej ADCC. W związku z tym, oba assaye mogą być dostosowane do indywidualnych potrzeb naukowych i translacyjnych.

Istnieje kilka kroków, które są szczególnie ważne dla reprodukowalności w obu assayach. Drobne zmiany w liczbie i fenotypie komórek efektorowych mogą drastycznie zmienić przeżywalność komórek docelowych. Dokładne liczenie komórek i dokładne zawieszenie podczas nakładania na płytkę są niezbędne, aby zminimalizować odchylenia w liczbie komórek i niekompletne mieszanie. Podobnie, przygotowanie komórek musi być spójne między eksperymentami, w tym żywotność, czas odzyskania i poprzednie narażenie na cytokiny, aby zapewnić jednolite funkcjonowanie efektorów. Geometria płytki jest kolejnym kluczowym czynnikiem wpływającym na wydajność assayu. W przepływie obrazowania na żywo płytki z płaskim dnem i powłoką wspierają stabilne nabywanie obrazów i spójną analizę pola, podczas gdy w przepływie cytometrii przepływowej płytki z zaokrąglonym dnem sprzyjają kontaktowi komórka-komórka i ułatwiają odzyskiwanie nieadhezyjnych kultur współistniejących w punkcie końcowym. Ponadto, jakość fluorescencyjnego znaczenia musi być potwierdzona przed assayem, ponieważ słaba dyskryminacja komórek docelowych przez obrazowanie lub słabe rozdzielenie CFSE przez cytometrię przepływową kompromitują ilościową ocenę i interpretację.

Te dwa przepływy pracy prezentują odrębne uwagi techniczne. W assayu obrazowania na żywo, typowe przyczyny złej jakości danych obejmują nierównomierne nakładanie komórek, gęste skupienia komórek lub skupiska oraz nieoptymalne progi analizy obrazu, które wszystkie są łatwo korektowalne. Te problemy mogą zniekształcić liczenie komórek i prowadzić do niekonsekwentnego śledzenia w czasie. W assayu opartym na cytometrii przepływowej, nieoptymalne wyniki są częściej spowodowane wysokim tłem śmierci komórek docelowych, słabym rozdzieleniem populacji docelowych i efektorowych, słabym barwieniem przeciwciał lub niespójnym pipetowaniem między powtórzonymi dołkami. Ponieważ te assaye są zaprojektowane do analizy porównawczej, włączenie odpowiednich kontroli wewnętrznych jest niezbędne do interpretacji, w tym kontroli tylko docelowych do normalizacji i dopasowanych kontroli negatywnych dla warunków specyficznych dla przeciwciał lub CAR.

Kilka wspólnych i specyficznych dla assayu ograniczeń musi być brane pod uwagę przy tych metodach. Assay obrazowania na żywo zapewnia rozdzielczość czasową, ale zależy od dokładnego fluorescencyjnego znaczenia i parametrów analizy obrazu, które mogą być wpłynięte przez skupienia komórek, nakładanie spektralne lub zmiany w morfologii podczas współkultury¹⁵. W niektórych przypadkach, szczególnie gdy assaye obejmują pierwotne komórki efektorowe, osiągnięcie odpowiedniego fluorescencyjnego znaczenia bez zmiany dynamiki zabijania jest trudne lub niemożliwe. Assay oparty na cytometrii przepływowej zapewnia wyższą rozdzielczość fenotypową w określonym punkcie końcowym, ale nie rozróżnia niezależnie wczesnego od późnego zabijania, chyba że zebrane są wielokrotne dopasowane punkty czasowe, co może być kosztowne i czasochłonne¹⁷. Ponadto, pomiary końcowe mogą odzwierciedlać nie tylko śmierć komórek docelowych, ale także różnice w proliferacji komórek docelowych, zużyciu efektorów lub odzyskiwaniu podczas obsługi próbki. W związku z tym, odczyty mechanistyczne takie jak CD107a są najlepiej interpretowane jako uzupełniające wskaźniki aktywacji komórek efektorowych, a nie bezpośrednie zamienniki dla eliminacji komórek docelowych¹⁹. Bardziej ogólnie, żadna z platform nie odzwierciedla w pełni architektury przestrzennej, interakcji z stromą, gradientów cytokin czy ograniczeń ruchu, które kształtują funkcję komórek NK in vivo.

Kilka czynników biologicznych musi również być brane pod uwagę przy interpretacji assayów zabijania komórek NK. Zmienność między dawcami jest właściwa eksperymentom z pierwotnymi ludzkimi komórkami NK, które

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Advanced RPMI-1640 medium	Thermo Fisher Scientific	12633020	Podstawowe medium dla kultur NK-92 i pierwotnych ludzkich komórek NK (patrz protokół dla pełnej formuły)
Anti-human CD107a antibody, PE-Cy7 conjugated (clone H4A3)	BioLegend	328618	Marker degranulacji do cytometrii przepływowej
Anti-human CD16 antibody, BV785 conjugated (clone 3G8)	BioLegend	302046	Cytometria przepływowa
Anti-human CD56 antibody, BV421 conjugated (clone HCD56)	BioLegend	318328	Cytometria przepływowa
Centryfuga stołowa z obrotowym rotorem do pojemników 15-mL i płytek 96-dołkowych (Eppendorf Centrifuge 5810R)	Eppendorf	5811000015	Używany do pelletowania komórek i wirowania płytek (100–300 × g)
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE)	Thermo Fisher Scientific	C34554	Barwnik proliferacji komórkowej do oznaczania komórek docelowanych
Cytek Aurora spectral flow cytometer (lub odpowiednik)	Cytek Biosciences	N7-00003	Używany do akwizycji i analizy cytometrii przepływowej
DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindol)	BioLegend	422801	Barwnik jądrza do różnicowania żywych i martwych komórek
Głębokodołkowa płytka 96-dołkowa	USA Scientific	1896-2110	Używany do przygotowania przeciwciał
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific	BP231-100	Środek do krioprezerwacji
Fetal bovine serum (FBS)	Avantor	76419-584	Dodatek do podstawowego medium; używany w buforze FACS (2% FBS)
General Purpose Water Bath, 10 L (37 °C)	PolyScience	WBE10	Do odmrażania komórek
GlutaMAX (suplement L-alanyl-L-glutamina)	Thermo Fisher Scientific	35050061	Stabilne źródło glutaminy
Human AB serum	Sigma-Aldrich	H4522-100ML	Dodatek do kultur medium pierwotnych ludzkich komórek NK
IncuCyte SX5 live-cell imaging system	Sartorius	4816	Obrazy na żywo w czasie rzeczywistym i analiza komórka po komórce
LUNA-FL dual fluorescence cell counter (lub odpowiednik)	Logos Biosystems	L20001	Automatyczne liczenie komórek
Parafilm M (4 in × 250 ft roll)	Genesee	16-101	Uszczelnianie i przechowywanie płytek
Phosphate-buffered saline (PBS), sterile (pH 7.2–7.4)	Corning	21-020-CV	Używany do płukania i przygotowania bufora FACS
Poly-D-lysine (0.1 mg/mL)	Thermo Fisher Scientific	A3890401	Środek do powlekania płytek
Primocin	InvivoGen	ant-pm-2	Antybiotyk
Recombinant human interleukin-2 (IL-2)	R&D Systems	202-IL-500	Cytokine
RosetteSep Human NK-cell enrichment kit	STEMCELL Technologies	15065	Kompleks wzbogacania ludzkich komórek NK
SYTOX Orange dead cell stain	Thermo Fisher Scientific	S34861	Barwnik do obrazów na żywo martwych komórek
Trypan Blue 0.4%	Gibco	15250-061	Barwnik do liczenia komórek
TrypLE Express Enzyme (1X), no phenol red	Thermo Fisher Scientific	12604039	Do odczepiania komórek przylegających
UltraPure EDTA (0.5 M, pH 8.0)	Thermo Fisher Scientific	15575020	Używany do przygotowania bufora FACS
15-mL stożkowe pojemniki z dnem do wirowania	Corning	352097	Sterylne
24-dołkowa płytka do hodowli tkankowej (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3524	Używany do odzyskiwania komórek NK
96-dołkowa płytka z okrągłym dnem (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3799	Używany do kokultur i badań cytometrii przepływowej
96-dołkowa płaska płytka z czarnym, przezroczystym dnem z polistyrenu (płytki przeznaczone do hodowli tkankowej)	Corning	3603	Kompatybilny z systemami obrazu na żywo