Protokół śledzenia i automatycznej ilościowej oceny zachowania u Drosophila melanogaster

Podsumowanie

Ten protokół wykorzystuje estymację położenia przez Python do śledzenia kluczowych punktów ciała u par Drosophila, ułatwiając zautomatyzowane ilościowe określanie subtelnych zachowań społecznych, szczególnie w interakcji społecznej, a także tworzenie map cieplnych i trajektorii ruchowych.

Streszczenie

Aby opracować narzędzie analityczne open-source, które pozwala na pokonywanie ograniczeń tradycyjnych metod śledzenia opartych na centroidach, przedstawiamy protokół do dokładnej analizy interakcji społecznych w swobodnie zachowujących się parach Drosophila. Konkretnie, protokół ten jest inspirowany wysokorozdzielczymi sieciami (HRNet), które pozwalają na jednoczesne śledzenie pięciu kluczowych punktów anatomicznych – głowa, tułów, brzuch oraz końcówki lewego i prawego skrzydła – mając na celu generowanie danych współrzędnych o wysokiej rozdzielczości do późniejszej ilościowej analizy zachowań społecznych. Protokół ten zapewnia kompletny przepływ pracy oparty na Pythonie i graficznym interfejsie użytkownika (GUI), który zaprojektowaliśmy, obejmujący budowę zbioru danych, trenowanie modelu i automatyczne wyodrębnianie współrzędnych, wraz z zintegrowanymi modułami do generowania map cieplnych zajmowalności przestrzennej, trajektorii ruchowych i współczynników interakcji społecznych u muchówek. Aby zweryfikować ten framework, przeprowadzono testy z użyciem dwóch szeroko stosowanych szczepów, w1118 i Canton-S (CS). Nasze wyniki wykazały stabilność wykrywania kluczowych punktów oraz ujawniły różnice specyficzne dla genotypu w wykorzystaniu przestrzeni i strukturze lokomotorycznej. Ta metodologia zapewnia skalowalną podstawę dla ilościowej etologii i automatycznej analizy interakcji społecznych u Drosophila, zmniejszając jednocześnie wysiłek związany z manualną adnotacją i poprawiając powtarzalność.

Wprowadzenie

Drosophila melanogaster jest szeroko stosowanym organizmem modelowym z potężnymi narzędziami genetycznymi i dobrze przemapowanymi obwodami nerwowymi, które umożliwiają mechaniczne rozdzielenie zachowań¹. Posiada szeroki zakres zachowań społecznych, w tym zalotów i agresji, oraz silną zdolność uczenia się^{2,3,4,5,6,7,8}. Każde z tych zachowań składa się z odrębnych elementów motorycznych kontrolowanych przez zwarty, ale niezwykle dobrze zorganizowany układ nerwowy. Co ważne, dokładne pomiary postawy ciała są niezbędne do zrozumienia neurologicznych podstaw selekcji działań, ponieważ wiele z tych zachowań zawiera subtelne motywy postawy, które kodują informacje kontekstowe i wewnętrzne^9,10.

Mimo potrzeby rozdzielania danych na pojedyncze muchy, wiele wysokowydajnych badań behawioralnych na Drosophila nadal opiera się na wskaźnikach na poziomie populacji¹¹. Wysokowydajne badania behawioralne obejmują testy labiryntu T na preferencje społeczne^12,13, testy przestrzeni społecznej, które mierzą odległość między muszkami, lub paradygmaty agregowania/uniknięcia w warunkach stymulacji zmysłowej¹⁴, które mogą efektywnie uchwytywać trendy populacyjne. Jednak zawierają one średnie z wielu osób, co prowadzi do zacierania różnorodności w sekwencjach działań i struktury czasowej wymiany społecznej. Przez lata, próby przejścia do identyfikacji na jedną muszkę opierały się na funkcjonalnie ograniczanych metodach, takich jak wykrywanie zdarzeń na podstawie reguł z użyciem progów kinematycznych, wycinanie tła z użyciem śledzenia centroidów i ręcznej adnotacji wideo^15,16,17,18. W rezultacie, dyskretne zachowania takie jak rzucanie się, stukanie czy grożenie skrzydłami są często ignorowane lub błędnie opisane, co wymaga znaczącej manualnej korekty. Takie ograniczenia ograniczyły badania mechanistyczne, które wymagają precyzyjnego dopasowania czasowego między aktywnością nerwową a pojedynczymi działaniami.

Rewolucyjne rozwiązanie jest teraz dostępne dzięki ostatnim rozwojom w dziedzinie komputerowego widzenia i estymacji pozycji opartej na uczeniu maszynowym. Oprogramowanie typu open-source takie jak DeepLabCut¹⁹ i SLEAP²⁰ umożliwia nieinwazyjne wykrywanie części ciała, skalowalną klasyfikację dyskretnych działań i zachowanie tożsamości jednostek nawet podczas bliskich interakcji. Te funkcje pozwalają na przełamanie wad poprzednich podejść grupowych i opartych na regułach i umożliwiają powtarzalną kwantyfikację złożonych zachowań społecznych.

Indywidualne interakcje w Drosophila charakteryzują się unikalnymi cechami motorycznymi, które wskazują na postęp interakcji społecznych. Agresja na przykład obejmuje typowe zachowania takie jak rzucanie się, grożenie skrzydłami i walczenie, które reprezentują kolejne etapy wzrostu konfliktu^21,22. Zaloty są podobnie określone przez orientację, jednostronne rozciągnięcie skrzydeł z produkcją śpiewu, stukanie i próbę kopulacji, które łączą się, tworząc sekwencje czasowe interakcji godowych²³. Uchwycenie tych motywów zależy od dokładnego rozpoznawania postawy ciała i ruchów stawów^24,25. W praktyce, próbkowanie wymaga wysokiej rozdzielczości przestrzennej i czasowej przez dłuższe okresy nagrywania, aby zapewnić, że subtelne wzorce motoryczne mogą być precyzyjnie wykryte i dopasowane do aktywności nerwowej^25,26.

Przedstawiamy otwartą, opartą na widokach, ramę do zautomatyzowanego identyfikowania pięciu anatomicznych kluczowych punktów—głowa, tułów, brzuch, lewe i prawe końcówki skrzydeł²⁷. System obejmuje kompletny proces budowy zbioru danych, treningu modelu i wyodrębniania współrzędnych oraz generuje wysokiej rozdzielczości dane szeregowe czasowe, nadające się do dostosowywalnej klasyfikacji zachowań. Automatyzując procesy ręcznej adnotacji i standaryzując przepływy pracy analityczne, nasza metoda umożliwia precyzyjną analizę ilościową zachowań społecznych, zwiększając efektywność i powtarzalność, a jednocześnie znacznie zmniejszając czas i pracę wymaganą do analizy.

Aby zweryfikować niezawodność systemu, zastosowaliśmy go do dwóch powszechnie stosowanych szczepów laboratoryjnych, w1118 i Canton-S (CS), i obserwowaliśmy stabilne wykrywanie kluczowych punktów w klatkach, a także różnice specyficzne dla genotypu w zajmowaniu przestrzeni, cechach trajektorii i wskaź

Protokół

1. Przygotowanie much

1. Przed rozpoczęciem eksperymentów zebrać i wyznaczyć płeć muszek w wieku około 3–4 dni, stosując krótkotrwałą narkozę CO₂.
   UWAGA: Czas trwania narkozy oraz szybkość przepływu CO₂ mogą się różnić w zależności od specyfikacji i ciśnienia butli z dwutlenkiem węgla używanej w danym laboratorium. Muszki należy monitorować nieprzerwanie podczas narkozy, a ekspozycję na CO₂ utrzymywać tylko do momentu pełnego uśpienia muszek i całkowitego ustania ich ruchu.
2. Każdą muszkę umieścić pojedynczo w probówce Falcon o pojemności 50 mL zawierającej standardową pożywkę kukurydziano-agarową z glukozą i drożdżami.
3. Przechowywać muszki w temperaturze 25 °C w 12-godzinnym cyklu światło/ciemność aż do momentu użycia.

2. Budowa areny

1. Przygotować dwie przezroczyste płyty akrylowe o grubości 3 mm oraz jedną płytę polietylenową o grubości 3 mm.
2. W centralnej części płyty polietylenowej wyciąć cztery okrągłe komory (każda o średnicy 35 mm).
3. Za pomocą klipsów połączyć jedną płytę akrylową z płytą polietylenową, tworząc podstawę komory; drugą płytę akrylową zachować jako zdejmowaną pokrywę.

Rycina 1: Schemat areny behawioralnej i zestawu do obrazowania. (A) Na schemacie przedstawiono konstrukcję niestandardowej komory obserwacyjnej. Komora składa się z trzech głównych warstw: 3 mm przezroczystej płyty akrylowej stanowiącej podstawę; 3 mm płyty polietylenowej z czterema okrągłymi wycięciami o średnicy 35 mm, które służą jako poszczególne studzienki komory; oraz drugiej płyty akrylowej, która pełni funkcję zdejmowanej pokrywy. (B) Do pionowego montażu kamery na 40 cm słupku optycznym wykorzystano zacisk z adapterem 90°. W celu obrazowania z góry kamera została umieszczona bezpośrednio nad wielowarstwową areną obserwacyjną, z osią optyczną prostopadłą do powierzchni komory. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

3. Konfiguracja obrazowania

1. Zmontować dwa 20 cm pręty optyczne oraz jeden pręt 40 cm za pomocą zacisków z adapterem 90°.
2. Zamocować kamerę (1280 × 1024 pikseli) pionowo na pręcie 40 cm, prostopadle do powierzchni areny, i ustawić częstotliwość klatek na 150 fps.
3. Umieścić arenę na panelu LED o wymiarach 25 cm × 25 cm z regulowanym natężeniem białego światła dziennego, pokrytym arkuszem dyfuzyjnym.
4. Dostosować oświetlenie do poziomu około 1500 lux na powierzchni areny.
   UWAGA: Należy upewnić się, że krawędzie skrzydeł pozostają widoczne w podglądzie binarnym. Należy unikać wartości >2000 lux, aby zapobiec artefaktom wywołanym ciepłem, ponieważ muchy mogą zmienić naturalną lokomocję lub rozmieszczenie z powodu stresu termicznego spowodowanego źródłem światła.

4. Procedura rejestracji

1. Pod każdym narożnikiem areny umieść 3 cm piankowe podkładki w celu jej stabilizacji.
2. Przenieś pary much pod narkozą CO₂ do komór; zamknij je, nakładając górną płytkę akrylową.
3. Pozostaw muchy na 40 min w celu aklimatyzacji przed rozpoczęciem rejestracji.
4. Rozpocznij akwizycję wideo za pomocą programu MIAS.exe²⁷: naciśnij q, aby rozpocząć, i c, aby zatrzymać.
   UWAGA: Pozwala to na ciągłe nagrywanie wideo swobodnie oddziałujących par much w zestandaryzowanych warunkach.

5. Zdefiniowanie panelu aktywności społecznej

1. Uruchom skrypt preprocessingu: python SoAL_PreProcess.py [video_file_path]
   UWAGA: Wszystkie skrypty kodowe znajdują się w Pliku uzupełniającym 1.
2. Zaznacz obszar komory i przypisz metadane w formacie Genotyp_wiek (dni) × 1 (liczba komór). (np. CS_3 × 1)
3. Przesuwaj suwak progu detekcji, aż skrzydła staną się prawie niewidoczne na obrazie binarnym, aby zapewnić optymalne odjęcie tła i widoczność skrzydeł.

6. Przygotowanie zbioru danych

1. Utwórz nowy folder zbioru danych, uruchamiając polecenie:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME 10 (interwał próbkowania klatek)
   UWAGA: Parametr interwału próbkowania klatek („10”) został przyjęty z wcześniej opublikowanego protokołu²⁷. Niższe wartości zwiększają gęstość próbkowania i obciążenie obliczeniowe, natomiast wyższe wartości zmniejszają zapotrzebowanie obliczeniowe i mogą być dostosowane w zależności od wydajności dostępnego sprzętu oraz wymagań eksperymentalnych.
2. Ustaw ścieżkę do plików wideo oraz ścieżkę do zbioru danych w pliku „tools/SoAL_DatasetUtils.py”
3. Uruchom interfejs ręcznego etykietowania:
   >python tools/SoAL_LabelUI.py DATASETNAME
   1. Nawigacja po klatkach: Naciśnij klawisz Spacji lub klawisz Z, aby przejść odpowiednio do następnej lub poprzedniej klatki. Alternatywnie do nawigacji można użyć suwaka osi czasu.
   2. Etykietowanie punktów kluczowych: Kliknij w odpowiednią pozycję muchy na każdym obrazie (w określonej kolejności: głowa, tułów, odwłok, lewe skrzydło i prawe skrzydło), aby zaznaczyć 5 punktów kluczowych.
   3. Wybór punktu kluczowego: Naciśnij klawisze numeryczne, aby wybrać punkt kluczowy (oznaczony białym okręgiem). Kolejne kliknięcie przypisze nowy numer do wybranego punktu kluczowego.
   4. Zapisywanie: Zamknij okno lub naciśnij klawisz D, aby zapisać wyniki adnotacji.
      UWAGA: Kompletne archiwum zbioru treningowego składa się z dwóch elementów: katalogu obrazów oraz pliku annotation.json.

7. Trenowanie modelu

1. Podziel zbiór danych na zbiór treningowy i walidacyjny:
   python tools/SoAL_DatasetGen.py DATASETNAME divide
   W katalogu ‘dataset/’ zostaną utworzone dwa nowe foldery.
2. Skonfiguruj parametry trenowania w pliku hrnet/fly_w32.yaml:
   Współczynnik rotacji: 15°
   Współczynnik skalowania: 0,35
   Współczynnik jasności: 0,25
   Wielkość partii (batch size): 24
   Epoki: 200
3. Uruchom program treningowy:
   python hrnet/tools/train.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Przerwij trenowanie, gdy średnia precyzja (AP) osiągnie plateau; zachowaj najlepszy model (AP > 90%).
4. Zwaliduj model za pomocą polecenia:
   python hrnet/tools/test.py --cfg hrnet/fly_w32.yaml
   Wynik: Wydajny model oparty na HRNet do detekcji punktów kluczowych wielu much.

8. Uruchom program detekcyjny

1. Skopiuj nowe pliki wideo do katalogu wideo.
2. Zanotuj metadane zgodnie z instrukcjami w kroku 5.
3. Uruchom program detekcji: python SoAL_KptDetect.py all
4. Sprawdź wyniki detekcji:
   python tools/SoAL_ViewKptUI.py excel_file_path (.cvs/xslx)
   Wynik: Dwuwymiarowe współrzędne pięciu punktów anatomicznych dla każdej muchy w poszczególnych klatkach.

9. Ilościowa analiza zachowania

1. Uruchom samodzielną aplikację GUI do analizy (Supplementary File 2) i zaimportuj pliki współrzędnych do interfejsu.
2. Wygeneruj mapy cieplne zajętości przestrzennej (gęstość prawdopodobieństwa pozycji w arenie).
3. Zrekonstruuj trajektorie lokomocyjne z szeregów czasowych współrzędnych.
4. Utwórz dane dotyczące interakcji społecznych, w tym odległość głów, orientację oraz wynikający z nich stan społeczny.
   Wynik: Standaryzowana wizualizacja wykorzystania przestrzeni i dynamiki ruchu specyficznej dla danego genotypu.

Wyniki

Rysunek 1 przedstawia geometrię areny, konfigurację oświetlenia oraz rozmieszczenie kamer wykorzystanych do rejestracji naturalnych interakcji społecznych u Drosophila. Taki układ zapewnia równomierne oświetlenie i stabilne warunki obrazowania, odpowiednie do estymacji pozy oraz ekstrakcji współrzędnych.

Zautomatyzowana estymacja pozy została zastosowana do wszystkich zarejestrowanych filmów w celu wyznaczenia współrzędnych dwuwymiarowych dla zdefiniowany...

Dyskusja

Nasze badanie pokazuje, że estymacja postawy oparta na uczeniu maszynowym zapewnia skalowalną, niezawodną metodę pomiaru subtelnych interakcji społecznych u Drosophila. Przezwycięża ograniczenia podejść opartych na centroidzie^15,16,17,18 poprzez śledzenie pięciu anatomicznych punktów kluczowych w swobodnie współdziałających parach, co umożliwia pozyskanie informacji kątowych dostarczan...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	BioFroxx	8211GR500
camera(MV-CU013-A0UC)	Hikvision	MV-CU013-A0UC
Carbon Dioxide	Messer	124-38-9
D(+)-Glucose anhydrous	BioFroxx	1179GR500
Drosophila Narrow Vials (Falcon tube)	Biolgix	51-0500
Ethanol	Chron Chemicals	64-17-5
LED panel	/	/	na zamówienie
Methylparaben	Sigma	99-76-3
polyethylene plate	/	/	na zamówienie
Python	/	wersja 3.6
Sucrose	DaMao	57-50-1
transparent acrylic plates	/	/	na zamówienie
Yeast	Angel	100004237033