Przesiewowe badanie wysokowydajne mutantów Bacillus coagulans hiperprodukujących kwas L-mlekowy za pomocą zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej kroplowej

Podsumowanie

Ten protokół przedstawia standardowy przepływ wysokowydajnego przesiewania dla mikroorganizmów przemysłowych. Obejmuje ono konstruowanie biblioteki mutantów poprzez mutagenezę ARTP, przeprowadzanie pozytywnego przesiewania kropel za pomocą zautomatyzowanych mikrofluidów i następnie weryfikację wyników. Niezawodność przepływu została zweryfikowana poprzez przesiewanie wysokowydajnych szczepów B. coagulans.

Streszczenie

Przemysłowe bioprodukowanie opiera się na mikroorganizmach do wydajnego syntetyzowaniu produktów docelowych w inżynieryzowanych warunkach. Jednak szczepy dzikiego typu często nie mają zdolności do tego, z powodu ich rodzimych sieci metabolicznych. Dlatego szybkie i dokładne przesiewanie wysokowydajnych szczepów z dużych bibliotek mutantów jest kluczowymi krokiem w przemysłowej hodowli mikroorganizmów. W ostatnich latach technologia mikrofluidyki kroplowej przyciągnęła znaczną uwagę ze względu na swoją wysoką przepustowość, niski zużycie i zdolności do kompartmentalizacji pojedynczych komórek, co doprowadziło do opracowania licznych systemów sortowania pojedynczych komórek. W niniejszej pracy przedstawiono protokół przesiewania wysokowydajnego dla mikroorganizmów przemysłowych przy użyciu zautomatyzowanej platformy mikrofluidyki kroplowej. Zintegrowany przepływ pracy obejmuje cztery kluczowe etapy: budowę biblioteki mutantów poprzez mutagenezę plazmą atmosferyczną i plazmą w temperaturze pokojowej (ARTP); wysokowydajne enkapsulację pojedynczych komórek i kontrolowane mikrohodowlę w kroplach skalii pikoliterowe; precyzyjne mikrowstrzyknięcie fluorescencyjnego bioczujnika, a następnie sortowanie kropli aktywowanych fluorescencyjnie (FADS), aby odizolować krople zawierające wysokowydajne warianty; oraz walidację posortowanych kandydackich szczepów poprzez fermentację w płytkach mikrotypowych i w flaszy wstrząsającej. Pełny i zintegrowany przepływ pracy przesiewania jest przeznaczony jako znormalizowany szablon, a jego walidacja jest demonstrowana poprzez odizolowanie mutantów wysokowydajnych w produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako konkretnego przykładu. Ta zautomatyzowana platforma przesiewania wysokowydajnego oferuje potężne rozwiązanie techniczne z znacznym potencjałem przyspieszenia przemysłowej hodowli wysokowydajnych szczepów.

Wprowadzenie

Biotechnologia przemysłowa wykorzystuje mikroorganizmy i enzymy jako biokatalizatory do produkcji cennych produktów na dużą skalę. Takie podejście jest uważane za bardziej przyjazne dla środowiska i efektywne niż tradycyjna produkcja chemiczna. Jednak naturalne sieci metaboliczne mikroorganizmów ewoluowały, aby priorytetowo dbać o ich przetrwanie i rozmnażanie, a nie o efektywną syntezę produktów pożądanych przez ludzi. W rezultacie, wysokowydajna hodowla mikrobiologiczna jest często konieczna, aby sprostać wymogom środowiska produkcyjnego przemysłowego z rygorystycznymi warunkami^1,2,3. Proces ten polega na szybkiej budowie dużych bibliotek mutantów mikrobiologicznych poprzez mutagenezę fizyczną lub chemiczną, a następnie hodowli i fenotypową detekcję mutantów o różnych genotypach. Następnie wybiera się tylko niewielką część lepszych szczepów. Jednak tradycyjne technologie przesiewowe oparte na płytkach i mikrotalerzy są ograniczone przez uciążliwe procedury, niski przepływ i wysoki koszt. Ta cieśnina, wraz z znacznym zużyciem materiałów eksploatacyjnych i odczynników, prowadzi do niskiej ogólnej efektywności hodowli mikrobiologicznej^4,5.

Mikrofluidyka kropel stała się ostatnio przełomowym rozwiązaniem tego problemu. W przeciwieństwie do sortowania komórek aktywowanych fluorescencyjnie (FACS), które są nieodpowiednie do sortowania wydzielonych produktów ze względu na szybkie dyfuzowanie cząsteczek z komórki, sortowanie kropel aktywowanych fluorescencyjnie (FADS) umieszcza pojedyncze komórki w mikrokomorach skali pikolitrowej, skompartymentalizowanych^6,7,8. Ta fizyczna izolacja zapobiega konkurencji szczepów, umożliwia zlokalizowany akumulację wydzielonych metabolitów i pozwala na ich ilościową detekcję za pomocą fluorescencyjnych biosensorów. W rezultacie FADS okazało się idealną platformą do przesiewania wysokowydajnego różnych produktów wydzielniczych, w tym aminokwasów, kwasów organicznych i enzymów. Zespół opracował genetycznie zakodowany fluorescencyjny biosensor GECFINDER i w połączeniu z FADS z powodzeniem przesiewał szczepy wytwarzające wysokie poziomy fenyloalaniny i poprawił efektywność sortowania o ponad 1000 razy⁹. Inna grupa opracowała platformę sortowania kropel aktywowanych fluorescencyjnie sprzężoną z genetycznie zakodowanym biosensorem do przesiewania wysokowydajnych szczepów produkujących kwas 3-dehydroszikiminowy w E. coli, a zoptymalizowany system FADS znacznie poprawił efektywność sortowania i umożliwił izolację mutantów o znacznie zwiększonej produkcji¹⁰. Niektórzy naukowcy zastosowali technologię FADS do inżynierii polimerazy DNA Bst, a uzyskane mutanty o znacznie zwiększonej termostabilności i aktywności przemieszczania się nici zostały następnie zastosowane do wykrywania LAMP, co skróciło czas reakcji z 40 min do 10 min¹¹.

Jednakże, translacja tych postępów technologicznych do rutynowych przepływów pracy rozwoju szczepów przemysłowych pozostaje wyzwaniem. Wiele komercyjnych systemów mikrofluidycznych kropel, pomimo ich zaawansowanego sprzętu, nie posiada kompletnej, intuicyjnej i powtarzalnej standardowej procedury operacyjnej dostosowanej do przesiewania fenotypowego mikroorganizmów. Aby zapełnić tę lukę, przyjęto zautomatyzowany mikrofluidyczny platformę kropel integrującą modułową kontrolę płynów, przyjazne dla użytkownika oprogramowanie i standaryzowany projekt chipu, kładąc idealne techniczne podstawy dla ustanowienia w pełni zintegrowanego przepływu pracy sortowania. To badanie wykorzystuje wysokowydajne przesiewanie wysokowydajnych L-kwasu mlekowego produkujących szczepów B. coagulans jako przypadek walidacji. Na podstawie platformy mikrofluidycznej kropel, ustanowiono następujący przepływ pracy, składający się z czterech kluczowych sekwencyjnych kroków: (1) budowa zróżnicowanej biblioteki mutantów poprzez mutagenezę plazmową atmosferyczną i temperatury pokojowej (ARTP); (2) wysokowydajne enkapsulacja pojedynczych komórek i kontrolowana mikrohodowla w kropelach w warunkach zoptymalizowanych dla wzrostu B. coagulans i produkcji L-kwasu mlekowego; (3) precyzyjne pikowy wstrzyknięcie fluorescencyjnego biosensora specyficznego dla L-laktanu, po którym następuje szybkie sortowanie kropel zawierających wyższe producentów; i (4) rygorystyczna walidacja wyselekcjonowanych kandydatów poprzez fermentację w kultiwatorach wstrząsających, aby potwierdzić zwiększoną produkcję i stabilność genetyczną. Ten protokół jest przeznaczony dla naukowców i inżynierów zaangażowanych w przemysłową hodowlę mikroorganizmów, którzy wymagają wysokowydajnego przesiewania produktów wydzielniczych. Jest szczególnie odpowiedni dla hodowli bakterii, które wydziela małe cząsteczki metabolitów lub enzymów. Platforma przesiewowa musi być wyposażona w czujniki kompatybilne z mikrośrodowiskiem kropli, aby umożliwić specyficzną detekcję docelowych metabolitów. Dla szczepów wymagających specjalnych warunków hodowli (np. ścisłe anaeroby), parametry hodowli mogą być dostosowane, aby zoptymalizować i ustalić dedykowaną strategię hodowli. Poprzez ustanowienie

Protokół

Dla niniejszego badania nie było wymagane zatwierdzenie etyczne. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono z wykorzystaniem czystych kultur mikroorganizmów bez udziału ludzkich osób lub zwierząt laboratoryjnych. Szczegóły dotyczące wszystkich materiałów użytych w poniższym protokole znajdują się w Tabeli materiałów.

1. Przygotowania

UWAGA: Stosuj zasady bezpieczeństwa biologicznego. B. coagulans jest organizmem Biosafety Level 1. Należy nosić rękawice i fartuch laboratoryjny. Przeprowadzaj wszystkie otwarte manipulacje wewnątrz kapturowego dyfuzora powietrza. Wysterylizuj wszystkie materiały stykające się z żywymi komórkami w autoklawie w temperaturze 121 °C przez 20 min przed usunięciem.

1. Źródło i utrzymanie szczepu
   1. Kup B. coagulans ATCC 7050 od komercyjnego centrum kolekcji kultur jako kulturę na pochyłym podłożu drugiej‑generacji.
   2. Strekk łyżeczką kultury pochyłej na agar z pożywki siewnej i inkubatoruj w temperaturze 50 °C przez 24 h. Wybierz pojedynczą kolonię, zaszczep ją w pożywce siewnej w postaci płynnej i hodowlaj w temperaturze 50 °C, 200 obr/min przez 12 h.
   3. Zmieszaj wynikającą kulturę ze sterylnym 40% glikolem do ostatecznego stężenia 25% (v/v) i przechowuj jako zamrożone zapasy w temperaturze –80 °C. Na potrzeby każdego eksperymentu rozmroź świeżą alikwotę, strekk ją na agar z pożywki siewnej i inkubatoruj w temperaturze 50 °C przez 24 h.
   4. Następnie wybierz pojedynczą kolonię, zaszczep ją w pożywce siewnej w postaci płynnej i hodowlaj w temperaturze 50 °C, 200 obr/min przez 12 h przed użyciem do mutagenezy i przesiewu (Dodatkowa rycina 1).
2. Czujnik kwasu mlekowego
   1. Wyprodukuj i oczyść czujnik eLACCO1.1 zgodnie z opisem w Materiałach uzupełniających¹² (Dodatkowa rycina 2).
   2. Uzupełnij oczyszczony czujnik o 5% (v/v) glikolu i przechowuj w temperaturze –80 °C. Na potrzeby każdego eksperymentu rozmroź jedną alikwotę na lodzie i natychmiast rozcieńcz ją sterylnym 10 mM buforem PBS (pH 7.4) do ostatecznego stężenia roboczego 0,1 mg/mL.
3. Przygotowanie pożywek
   1. Pożywka siewna (g/L: glukoza 20, ekstrakt drożdżowy 5, trypton 10, octan sodu 2, cytrynian sodu 2, K₂HPO₄ 2, MgSO₄·7H₂O 0.2, MnSO₄·H₂O 0.05, FeSO₄·7H₂O 0.01). Wysterylizuj glukozę oddzielnie jako 200 g/L stock w temperaturze 115 °C przez 20 min.
      1. Wysterylizuj pozostałe składniki w temperaturze 121 °C przez 15 min. Po schłodzeniu dodaj sterylny stock glukozy do ostatecznego stężenia 20 g/L, a następnie przefiltruj.
      2. Przechowywaj pełne pożywki w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Stosuj do aktywacji na noc i przygotowania inokulum.
   2. Pożywka przesiewowa (g/L: glukoza 20, ekstrakt drożdżowy 6.66, NaCl 0.333, NH₄Cl 0.665, KH₂PO₄ 2, Na₂HPO₄ 4.46, MgSO₄ 0.12, CaCl₂ 0.074).
      1. Wysterylizuj glukozę oddzielnie w temperaturze 115 °C przez 20 min. Wysterylizuj mieszaninę soli i ekstraktu drożdżowego w temperaturze 121 °C przez 15 min.
      2. Po schłodzeniu dodaj sterylny stock glukozy do 20 g/L. Przechowuj w temperaturze 4 °C do jednego tygodnia. Stosuj jako fazę wodną do generowania kropli i jako pożywkę w kroplach podczas 10 godzinnej inkubacji.
   3. Pożywka fermentacyjna (g/L: glukoza 90, trypton 13.33, ekstrakt drożdżowy 13.33, octan sodu 0.67, NaCl 0.0133, MgSO₄·7H₂O 0.0133, MnSO₄·H₂O 0.0133,

Wyniki

Na podstawie zautomatyzowanej platformy mikrofluidycznej opartej na kroplowych systemach, stworzono model wysokowydajnego przesiewania. Biblioteka mutantów B. coagulans została stworzona za pomocą mutagenezy ARTP z optymalnym czasem napromieniowania 20 s, co dało wskaźnik śmiertelności wynoszący około 90% (Rysunek 4A). Mutanty zostały następnie zamknięte w kroplkach o objętości 14 pL, około 30 µm średnicy, ze szybkością generowania 1500 Hz (Rysunek 4B). Po inkubacji...

Dyskusja

Ten protokół przedstawia standaryzowany proces przesiewowy mikroorganizmów przemysłowych oparty na zautomatyzowanej platformie mikrokropelkowej. Zintegrowany proces obejmuje budowę bibliotek mutantów, generowanie kropel i enkapsulację jednokomórkową, hodowlę w mikroreaktorach, wstrzyknięcie bioczujników, sortowanie kropel z aktywacją fluorescencji i ostateczną weryfikację docelowych szczepów. Wykorzystując wysokowydajne przesiewanie o wysokiej wydajności produkcji kwasu L-mlekowego szczepu B. coagulans jako przy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Agar	Becton, Dickinson and Company	214030	Do przygotowania płyt litych
Anhydrous Ethanol	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	10009218	Wycieranie i dezynfekcja blatów laboratoryjnych i urządzeń
Atmospheric and Room Temperature Plasma (ARTP)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-002	ARTP  został zastosowany do konstrukcji biblioteki mutantów w celu mutageneza szczepów.
B. coagulans	Beijing Microbial Culture Collection Center, BMCC	1511C0004000002355	B. coagulans ATCC 7050 został użyty jako szczep wyjściowy do mutageneza i cel do wysokowydajnego przesiewania kropel.
Black microplate (96 well)	Corning	3925	96-dołkowa czarna płytka mikroskoliczna była używana do testów czujników mlekonianu i oznaczania stężenia kwasu mlekowego.
Calcium carbonate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	20011062	Do izolacji hiperproducentów L-kwasu mlekowego.
Calcium chloride	Sinopharm	10005819	Chlorku wapnia używano do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Calcium L-lactate	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	69027528	Używane jako próbki do przygotowania krzywej standardowej w procesie wykrywania.
Centrifuge tube (15 mL)	Beijing Xinhengyan Technology Co., Ltd	HB53397	Używany do rozcieńczania płynu bakteryjnego
Collection tube	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell-CL	Do pobierania kropel i późniejszego uprawu
Computer	Lenovo	E450	Instalacja oprogramowania i sterowanie komórką DREM.
DAPI	Solarbio	c0065	Do barwienia komórek.
Deep-well plate (24-well)	BKMAMLAB	110424008	Do początkowej weryfikacji wydajności mutantów B. coagulans przy użyciu głębokich płytek dołkowych
Demulsifier (1H,1H,2H,2H-Perfluorooctanol)	MACKLIN	H817022	Demulgator kropli służy do rozbijania mikrodrobin wody w oleju i uwalniania komórek wewnętrznych, szczepów lub supernatantu do dalszego wykrywania i analizy.
D-Glucose	Solarbio	G8150-1000	D-Glukoza jest używana do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Diammonium hydrogen citrate	Solarbio	D9950	Wodoroortofosforan diamonowy jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
Dipotassium hydrogen phosphate anhydrous	Sigma-Aldrich	P8281	Bezwodny wodoroortofosforan dipotasu jest używany do przygotowania pożywki mikrobowej, zapewniając niezbędne składniki odżywcze do wzrostu mikroorganizmów.
DREM Software version	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	DREMcell v02.01.18	Do sterowania instrumentem DREM Cell. Oprogramowanie DREM jest programem komercyjnym wyłącznie dla instrumentu DREM Cell firmy Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd. Nie ma publicznego oficjalnego dostępu ani URL do pobrania i jest dystrybuowane tylko wraz z urządzeniem na podstawie autoryzacji.
Droplet Entrapping Microfluidic Cell-sorter (DREM Cell)	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	CP-027	Był używany do wysokowydajnego pojedynczego zamknięcia komórek i sortowania, aby szybko przesiewać wysokowydajne szczepy z biblioteki mutantów.
Droplet generation chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-009	Chip do generowania kropel jest używany do produkcji jednorodnych kropel skalowania pikolitera (pL) do pojedynczego zamknięcia komórek.
Droplet injection chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-003	Mikroiniekcyjny chip kropli jest używany do osiągnięcia precyzyjnego i śladowego wtrysku reagentów do wstępnie uformowanych kropel na potrzeby późniejszych reakcji biochemicznych.
Droplet sorting chip	Jiangsu TMAXTREE Biotechnology Co., Ltd.	HC-03-002	Chip do sortowania kropel jest używany do sortowania docelowych kropel zawierających komórki wysokowydajne na podstawie sygnałów fluorescencyjnych.
Erlenmeyer shake flask (250 mL)	Sichuan Shuniu Glass Instrument Co., Ltd.	B-001006	Służy do weryfikacji uprawy skalowania mutantów B. coagulans po wstępnym przesiewaniu za pomocą głębokich płytek, aby potwierdzić stabilność i powtarzalność wysokowydajnych szczepów.
Filter Membranes (0.22 μm)	Merck	SLGPR33RB	Używany do filtracji bulionu fermentacyjnego.
Fluorescence inverted microscope	Olympus	IX73	Mikroskop fluorescencyjny Olympus IX73 był używany do obserwacji morfologii bakterii wewnątrz kropel
Fluorinated Oil	Bio-Rad	1864006	Olej fluorowany służy jako faza ciągła w mikrofluidyce kropel do generowania stabilnych, jednorodnych i nieinterferujących mikrodrobin wody w oleju, wspierających hodowlę i przesiewanie pojedynczych komórek.
High Performance Liquid Chromatography column	Bio-Rad	Bio-Rad Aminex HPX-87	Służy do separacji kwasu mlekowego od innych składników w bulionie fermentacyjnym według różnych właściwości retencji, aby osiągnąć dokładne ilościowe wykrywanie kwasu mlekowego.
High-Performance Liquid Chromatography	Shimadzu	228-34001-02	HPLC