Artykuł metodologiczny

Wytwarzanie pionowo ułożonego urządzenia organ-na-chip kompleksu zębinowo-miazgowego z wykorzystaniem ludzkiego krążka zębinowego

DOI:

10.3791/71713

⸱

14 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  ,  , 
1Center of Excellence in Physics and Engineering in Health, Universidad de La Frontera, 2Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 3Master in Dentistry Program, Faculty of Dentistry, Universidad de La Frontera, 4Center for Science and Technology of Valparaíso (CCTVal), Universidad Técnica Federico Santa María, 5Scientific and Technological Bioresource Nucleus (BIOREN), Universidad de La Frontera, 6Department of Chemical Engineering, Faculty of Engineering and Sciences, Universidad de La Frontera

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Opisano sposób wykonania i montażu urządzenia organ-on-a-chip z pionowo ułożonym kompleksem miazga-zębina, zawierającego ludzki krążek zębiny oraz mikrokanały wykonane metodą fotolitografii, a następnie zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Konwencjonalne modele przedkliniczne stosowane w badaniach stomatologicznych, w tym modele zwierzęce i statyczne hodowle komórkowe, wykazują istotne ograniczenia w odtwarzaniu warunków fizjologicznych granicy między zębiną a miazgą oraz w przewidywaniu biologicznych odpowiedzi organizmu człowieka na biomateriały stomatologiczne. Technologia organ-on-a-chip (OoC) stanowi alternatywne podejście, umożliwiając odtworzenie specyficznych dla tkanki mikrośrodowisk w kontrolowanych systemach mikroprzepływowych. Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia OoC kompleksu zębina-miazga, zawierającego ludzki dysk zębiny w trzywarstwowej mikroprzepływowej platformie z polidimetylosiloksanu (PDMS). Protokół obejmuje przygotowanie dysku zębiny, wykonanie mikrostrukturalnych form z zastosowaniem fotolitografii, odlewanie i utwardzanie PDMS, łączenie warstw wspomagane plazmą, montaż urządzenia, testy szczelności oraz wysiew mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba w warunkach hodowli statycznej. Omówiono krytyczne parametry wytwarzania wpływające na działanie urządzenia, w tym kontrolę grubości warstwy PDMS, plazmową obróbkę powierzchni oraz integrację dysku zębiny wewnątrz urządzenia w celu zminimalizowania wycieków. Adhezję i żywotność komórek wewnątrz urządzenia oceniono za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej oraz konfokalnego barwienia żywe/martwe. Reprezentatywne wyniki wykazują udaną integrację dysku zębiny w obrębie układu mikroprzepływowego, utrzymanie szczelności oraz adhezję żywotnych komórek macierzystych miazgi zęba do powierzchni zębiny. Przedstawiony protokół zapewnia powtarzalną metodę wytwarzania platformy OoC kompleksu zębina-miazga, która może wspierać przyszłe badania nad odpowiedziami komórkowymi na biomateriały stomatologiczne i bodźce mikrośrodowiskowe.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Eksperymenty na zwierzętach od dawna odgrywają kluczową rolę w pogłębianiu wiedzy na temat procesów patologicznych i fizjologicznych oraz stanowią centralny element wczesnych etapów opracowywania leków1. W ciągu XX wieku średnia długość życia ludzi znacznie wzrosła i choć nie można precyzyjnie określić, w jakim stopniu poprawa ta wynika wyłącznie z badań na zwierzętach, powszechnie uznaje się, że wiele współczesnych metod leczenia zostało opracowanych lub zweryfikowanych z wykorzystaniem modeli zwierzęcych2. Godnymi uwagi przykładami są opracowanie szczepionek przeciwko poliomyelitis, odrze i wirusowemu zapaleniu wątroby typu B, ocena bezpieczeństwa i skuteczności penicyliny oraz produkcja insuliny. W dziedzinie badań nad materiałami stomatologicznymi i biomateriałami modele te miały krytyczne znaczenie dla badania procesu próchnicy, biologii i regeneracji kompleksu zębinowo-miazgowego oraz fizjopatologii tkaneky periodontalnych3,4.

Mimo szerokiego zastosowania tych metodologii, obecny proces opracowywania leków nadal wykazuje wysoki odsetek niepowodzeń, przy czym wiele kandydatów na leki zawodzi podczas badań klinicznych, mimo wykazania skuteczności i bezpieczeństwa w przedklinicznych warunkach laboratoryjnych oraz w modelach zwierzęcych5. Rozbieżność ta wiąże się z różnicami międzygatunkowymi, które mogą ograniczać przewidywalność translacyjną modeli zwierzęcych ze względu na różnice anatomiczne, genetyczne i fizjologiczne między gatunkami6. Ponadto opracowanie nowych podejść terapeutycznych pozostaje czasochłonne i kosztowne7. Co więcej, konwencjonalne modele in vitro wykorzystują głównie uproszczone dwuwymiarowe (2D) hodowle monowarstwowe na niefizjologicznych podłożach plastikowych, co nie pozwala na odtworzenie sygnałów biochemicznych i fizycznych, oddziaływań międzykomórkowych oraz sygnalizacji macierzy pozakomórkowej (ECM) obecnych w ludzkiej jamie ustnej8,9. Chociaż modele 2D oferują pewne zalety eksperymentalne, są one z natury niezdolne do odtworzenia złożonych interakcji zachodzących jednocześnie między wieloma komponentami, takimi jak biofilmy, biomateriały, zębina i komórki miazgi10. W konsekwencji rośnie zainteresowanie opracowaniem alternatywnych platform eksperymentalnych, zdolnych do dokładniejszego odwzorowania ludzkich odpowiedzi biologicznych. W 2022 roku ustawa FDA Modernization Act 2.0 zniosła obowiązek przeprowadzania badań na zwierzętach w procesie zatwierdzania leków i uznała potencjalne zastosowanie alternatywnych platform, w tym technologii organ-on-a-chip (OoC), w badaniach przedklinicznych11.

Organ-on-a-chip (OoC) to urządzenie mikrofluidyczne zaprojektowane w celu replikacji struktury, funkcji i mikrośrodowiska konkretnego organu lub komponentu tkankowego12. Urządzenia te są zasiedlane przez żywe komórki i tkanki hodowane w zaprojektowanych mikrokanałach, które odtwarzają kluczowe aspekty fizjologicznego mikrośrodowiska, w którym komórki naturalnie występują. Poza naśladownictwem strukturalnym, mikrokanały umożliwiają czasowo-przestrzenną kontrolę nad środowiskiem komórkowym i wspierają utrzymanie funkcji specyficznych dla tkanki, zapewniając tym samym warunki eksperymentalne, które mogą bardziej przypominać fizjologię in vivo niż konwencjonalne systemy hodowli12. Szczególnie istotne jest to, że mikrokanały w urządzeniach OoC umożliwiają kontrolowany przepływ medium hodowlanego, który wywiera naprężenie ścinające na obecne w nich komórki13. Te bodźce mechaniczne wpływają na odpowiedzi komórkowe, w tym adhezję, proliferację, migrację, ekspresję genów oraz interakcje międzykomórkowe14,15. Dodatkowo, ciągły przepływ medium przyczynia się do utrzymania mikrośrodowiska poprzez dostarczanie składników odżywczych i usuwanie produktów przemiany materii16. Co więcej, w porównaniu z konwencjonalnymi hodowlami 2D, zgłaszano, że niektóre platformy OoC w trójwymiarowych (3D) modelach na chipie wspierają lepszą kontrolę odczytów związanych ze stresem oksydacyjnym, w tym wewnątrzkomórkowych reaktywnych form tlenu oraz żywotności komórek17. Systemy OoC stały się zatem obiecującymi platformami do badania fizjologii tkanek, interakcji z biomateriałami i procesów chorobowych w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych18. W badaniach stomatologicznych technologia OoC jest sukcesywnie stosowana do modelowania coraz bardziej złożonych interfejsów tkanek jamy ustnej19. Wczesne platformy tooth-on-a-chip emulowały interfejs biomateriał–dentyna–miazga20, podczas gdy bardziej zaawansowane wersje włączyły naczynia krwionośne i unerwienie nerwem trójdzielnym, aby wierniej odtworzyć złożoność strukturalną i funkcjonalną kompleksu miazga-dentyna21. Poza miazgą, modele 3D niedojrzałych kanałów korzeniowych umożliwiły ocenę irygantów endodontycznych oraz angiogennego pączkowania komórek macierzystych z brodawki szczytowej22,23. Na poziomie periodontu platformy gum-on-a-chip zostały wykorzystane do badania interakcji gospodarz-mikrob oraz oceny potencjału immunomodulacyjnego probiotyków jako czynników terapeutycznych24, natomiast urządzenia periodontal ligament-on-chip wykazały, w jaki sposób przepływ płynu śródręśnego moduluje tworzenie sieci naczyniowej i różnicowanie osteogenne sferoidów komórek macierzystych więzadła ozębnego25,26. Uzupełniając te modele, wyspecjalizowane systemy oral mucosa-on-a-chip oraz dental implant-on-a-chip dodatkowo rozszerzyły zakres mikrofluidycznych badań stomatologicznych poprzez charakteryzację interakcji gospodarz-materiał oraz cytotoksyczności monomerów stomatologicznych w fizjologicznie istotnych warunkach27,28.

Choć systemy OoC są coraz częściej stosowane w badaniach stomatologicznych, jamy ustnej i kraniomaksylofaccjalnych, dalsze wysiłki na rzecz standaryzacji i powtarzalności procesów wytwarzania pozostają istotne. W literaturze opisano kilka modeli tooth-on-a-chip20,29,30,31, prezentujących różne konfiguracje urządzeń i zastosowania eksperymentalne. Jednakże różnice w architekturze urządzeń, metodach wytwarzania, sposobie włączania zębiny oraz raportowaniu parametrów eksperymentalnych mogą ograniczać powtarzalność i bezpośrednie porównywanie badań. W szczególności różnice w geometrii mikrokanałów, strategiach integracji zębiny i podejściach do produkcji mogą wpływać na biologiczne i mechaniczne mikrośrodowisko wewnątrz urządzenia. Niektóre opisane modele wykorzystują zębinę w celu odtworzenia aspektów interfejsu zębina–miazga20,29,30, podczas gdy inne stosują alternatywne konfiguracje31. Ponadto metody wytwarzania, takie jak fotolitografia, cięcie laserowe, mikrofrezowanie i druk 3D, prezentują określone zalety i ograniczenia w zależności od zamierzonego projektu urządzenia i jego zastosowania. Co więcej, krytycznym determinantem użyteczności biologicznej jest orientacja architektoniczna urządzenia, a konkretnie to, czy kanały i plaster zębiny są rozmieszczone w konfiguracji poziomej czy pionowej19,32. W konfiguracjach ułożonych poziomo przedziały rozmieszczone obok siebie ułatwiają boczną kompartymentację i wizualizację komórek w czasie rzeczywistym, co czyni je szczególnie odpowiednimi do modelowania tkanek o naturalnej bocznej organizacji przestrzennej, takich jak kompleks periodontalny24,32. Jednakże projekt ten jest z natury ograniczony w zdolności do odtworzenia prostopadłych interfejsów biologicznych, takich jak kompleks biomateriał-zębina-miazga, ponieważ boczny układ przedziałów nie oddaje wiernie in vivo orientacji bariery zębinowej między jamą a miazgą20,32. Konfiguracje ułożone pionowo rozwiązują te ograniczenia poprzez superpozycję dwóch przedziałów wzdłuż osi y, oddzielonych natywnym plastrem zębiny, co umożliwia jednoczesną kwantyfikację transportu molekularnego przez nienaruszoną zębinę oraz monitorowanie w czasie rzeczywistym odpowiedzi komórek miazgi mierzonych w medium wylotowym30. Niemniej jednak, rozpoznaną wadą tej orientacji jest obrazowanie przekroju interfejsu zębina-komórka, ponieważ uzyskanie obrazów przekroju interfejsu zębina-komórka w tej samej płaszczyźnie ogniskowania pozostaje technicznie trudniejsze niż w konfiguracjach ułożonych poziomo, gdzie komórki i macierze zewnątrzkomórkowe są rozmieszczone bocznie. Mimo że w literaturze opisano wiele modeli kompleksu zębina-miazga on-a-chip, większość z nich przyjmuje konfigurację poziomą, w której przedziały są rozmieszczone obok siebie w tej samej płaszczyźnie10,20,21,29, podczas gdy stosunkowo niewiele z nich włączyło natywny plaster zębiny w konfiguracji pionowej30. Niemniej jednak, różnice w podejściach do produkcji i parametrach raportowania w tych modelach nadal ograniczają powtarzalność i porównania między badaniami33. Niniejsza praca ma na celu poprawę powtarzalności metodologicznej poprzez dostarczenie szczegółowego protokołu wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, co ułatwi szersze przyjęcie tej platformy w środowisku badawczym stomatologii.

Niniejszy artykuł opisuje szczegółowy protokół wytwarzania i montażu urządzenia typu OoC do pionowo ułożonego kompleksu miazga-zębina, zawierającego ludzki dysk zębiny wewnątrz trójwarstwowej mikrofluidycznej platformy z polidimetylosiloksanu (PDMS), wykonanej przy użyciu formy otrzymanej metodą fotolitografii. Protokół opisuje również zasiewanie i hodowlę mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba wewnątrz urządzenia w warunkach statycznych.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Badanie przeprowadzono zgodnie z Deklaracją Helsińską, a protokół został zatwierdzony przez Komisję Etyczną Universidad de La Frontera w odniesieniu do badań z wykorzystaniem próbek pochodzenia ludzkiego.

1. Pozyskiwanie krążka dentynowego

UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować projekt urządzenia (Rycina 1A–1C).

  1. Zbieranie i przechowywanie zębów
    1. Zebrać zdrowe ludzkie zęby trzonowe lub przedtrzonowe po uzyskaniu świadomej zgody pacjenta.
    2. Przechowywać wszystkie próbki w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C, aby zapobiec odwodnieniu dentyny i denaturacji białek.
    3. Wymieniać roztwór chloraminy raz w tygodniu podczas przechowywania.
  2. Przygotowanie krążków dentynowych
    1. Przeciąć każdy ząb poziomo w środkowej trzeciej części korony, używając wysokobiegowej końcówki pracującej z prędkością 350 000 rpm, wyposażonej w cylindryczny wiertak diamentowy (średnica 1 mm; rozmiar ziarna 100–150 µm).
    2. Przeciąć ząb pod konieccowym nawadnianiem wodą z przepływem około 50 mL/min.
    3. Ustawić miejsce cięcia w środkowej trzeciej części korony, aby uniknąć komory miazgi oraz szkliwa obecnego w bruzdach i szczelinach okluzyjnych, uzyskując w ten sposób krążek składający się głównie z tkanki dentynowej.
      UWAGA: Przeciąć ząb pod ciągłym nawadnianiem i stosować odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawiczki, maseczkę oraz okulary ochronne.
  3. Wykończenie krążków dentynowych
    1. Wypolerować krążek dentynowy, używając sekwencyjnie dysków wykończeniowych o malejącej gradacji ziarna.
    2. Kontynuować polerowanie aż do uzyskania końcowej grubości dentyny około 0,8 mm (±± 0,3 mm) i wymiarów bocznych około 5 mm × 5 mm (±± 0,3 mm) (Rysunek 1D).
  4. Przechowywanie krążków dentynowych
    1. Przechowywać przygotowane krążki dentynowe w 0,5% roztworze chloraminy w temperaturze 4°C do czasu montażu urządzenia OoC.

Montaż i testowanie urządzenia mikroprzepływowego, schemat z wymiarami komponentów, wykonanie, dynamika płynów.
Rycina 1: Schemat projektowania i procesu wytwarzania urządzenia organ-on-a-chip (OoC) dla kompleksu miazga–zębina. (A) Projekt trójwymiarowy urządzenia przedstawiający trójwarstwową architekturę. (B) Widok z góry projektu urządzenia z głównymi wymiarami. (C) Widok boczny konfiguracji trójwarstwowego urządzenia. (D) Reprezentatywny krążek zębiny przygotowany z przybliżoną grubością 0.8 mm i wymiarami bocznymi około 5 mm × 5 mm. (E) Krzemowa forma matrycowa wykonana metodą fotolitografii i wykorzystana do odlewania górnej i dolnej warstwy polidimetylosiloksanu (PDMS). (F) Usuwanie utwardzonej warstwy PDMS z formy krzemowej po polimeryzacji termicznej. (G) Obróbka plazmowa powierzchni PDMS przed łączeniem warstw. (H) Gotowe trójwarstwowe urządzenie OoC kompleksu miazga–zębina, złożone poprzez wiązanie plazmowe i zawierające interfejs zębiny. (I) Złożone urządzenie podłączone do rurek w celu testowania szczelności i przygotowania do eksperymentów mikroprzepływowych. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

2. Wykonanie urządzenia OoC kompleksu zębinowo-miazgowego

  1. Przygotowanie obszaru roboczego i materiałów
    1. Przygotowanie materiałów i sprzętu
      1. Przed rozpoczęciem procesu wytwarzania urządzenia należy przygotować wszystkie materiały i sprzęt wymienione w Tabeli materiałów.
      2. Przed montażem urządzenia należy przygotować wycinaki do biopsji.
      3. Wszystkie procedury wytwarzania należy przeprowadzać w czystym środowisku, wolnym od kurzu.
      4. Podczas wytwarzania i montażu urządzenia należy używać rękawiczek, okularów ochronnych i odpowiednich środków ochrony osobistej.
        UWAGA: Przed rozpoczęciem protokołu należy przygotować formę wykonaną metodą fotolitografii (Rysunek 1E).
  2. Wytwarzanie mikrostrukturalnej formy
    1. Przygotowanie wafla krzemowego
      1. Wytworzyć formę na 4-calowym, jednostronnie polerowanym waflu krzemowym (typ N, domieszkowany As, metoda wzrostu CZ, orientacja <100>, grubość 500 ±± 25 µm, TTV ≤ 10 µm, BOW ≤ 35 µm, rezystywność 0,001–0,005 Ω·cm).
      2. Wafle należy czyścić sekwencyjnie w acetonie, izopropanolu i wodzie ultrapurej przez 10 min każdy, stosując sonikację.
      3. Wafel należy osuszyć sprężonym powietrzem.
      4. Wafel należy wygrzać w temperaturze 200°C przez 10 min na płycie grzejnej w celu usunięcia resztkowej wilgoci.
      5. Należy pozwolić waflu ostygnąć do temperatury pokojowej (RT; 20°C–25°C).
    2. Aktywacja powierzchni i powlekanie fotorezystem
      1. Powierzchnię wafla krzemowego należy aktywować za pomocą próżniowego czyścika plazmowego, stosując plazmę powietrzną na poziomie 7 przez 120 s.
      2. Należy nanieść negatywny fotorezyst epoksydowy GM 1060 metodą spin-coatingu przy 300 rpm przez 10 s.
      3. Kontynuować spin-coating przy 565 rpm przez 100 s i 965 rpm przez 1 s, stosując przyspieszenie 200 rpm/s.
      4. Powleczony wafel należy pozostawić do odpocznienia na 10 min.
      5. Przeprowadzić wstępne wygrzewanie (pre-bake) w 65°C przez 10 min.
      6. Kontynuować wstępne wygrzewanie w 95°C przez 1 h.
      7. Pozostawić wafel do ostygnięcia do RT.
    3. Naświetlanie i wywoływanie
      1. Naświetlić fotorezyst za pomocą systemu bezpośredniej litografii laserowej przy dawce 1 950 mJ/cm2.
      2. Przeprowadzić wygrzewanie po naświetlaniu (post-bake) w 65°C przez 10 min.
      3. Kontynuować wygrzewanie w 95°C przez 30 min.
      4. Pozostawić wafel do ostygnięcia do RT.
      5. Pozostawić wafel do odpocznienia na 10 min.
      6. Wywołać wzór w PGMEA przez 4 min.
      7. Przedłużyć wywoływanie w odstępach 30-sekundowych, jeśli pozostaje resztkowy fotorezyst.
      8. Przerwać wywoływanie poprzez płukanie izopropanolu.
      9. Wafel należy osuszyć sprężonym powietrzem.
    4. Utwardzanie końcowe (hard bake)
      1. Przeprowadzić utwardzanie końcowe w 135°C przez 2 h.
      2. Otrzymać mikrostrukturalną formę matrycę zawierającą mikrokanały o szerokości 1 mm i wysokości 50 µm.
  3. Przygotowanie i odgazowanie mieszaniny PDMS
    1. Przygotowanie mieszaniny PDMS
      1. Zmieszać bazę PDMS i czynnik sieciujący w stosunku wagowym 10:1.
      2. Mieszaninę mieszać ręcznie szklaną rurką w plastikowym zlewce przez około 5 min.
      3. Podczas mieszania stosować powolne i ciągłe ruchy okrężne.
        UWAGA: Należy unikać wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas mieszania.
    2. Odgazowywanie
      1. Umieścić mieszaninę PDMS w desykatorze próżniowym podłączonym do pompy próżniowej.
      2. Odgazować mieszaninę przy ciśnieniu około 700 mmHg przez 5 min.
      3. Krótko przerwać próżnię, aby umożliwić pęknięcie pęcherzyków powierzchniowych.
      4. Ponownie przyłożyć próżnię.
      5. Powtarzać cykl, aż do całkowitego zniknięcia widocznych pęcherzyków.
        UWAGA: Całkowity czas odgazowywania wynosi zazwyczaj około 30 min.
  4. Odlewanie PDMS na formie
    1. Przygotowanie formy
      1. Umieścić formę na płaskiej powierzchni.
      2. Oczyścić formę za pomocą sprężonego powietrza.
      3. Unikać bezpośredniego kontaktu z powierzchnią z wzorem.
      4. Upewnić się, że forma jest wolna od kurzu i zanieczyszczeń.
    2. Aplikacja PDMS
      1. Wylać około 8 g PDMS wokół dysku dentynowego w celu wytworzenia warstwy zatapiającej dentynę.
      2. Dostosować wysokość PDMS tak, aby odpowiadała grubości dysku dentynowego (0,8 ±± 0,3 mm).
      3. Zapobiec zakryciu powierzchni dentyny przez PDMS.
      4. Wylać około 0,26 g PDMS na jednostkę formy w celu wytworzenia każdej warstwy mikrokanałów.
      5. Delikatnie ostukać formę lub zastosować wibracje, aby ułatwić wypełnienie mikrostruktur.
      6. Pozostawić PDMS, aby osiadł w najmniejszych elementach.
      7. Przykryć formę pokrywką lub płaskim osłoną, nie dotykając powierzchni PDMS.
        UWAGA: Warstwa zatapiająca dentynę ma grubość około 0,8 mm, a każda warstwa mikrokanałów około 0,4 mm, co daje całkowitą grubość urządzenia około 1,6 mm.
        UWAGA: W przypadku planowania obrazowania konfokalnego należy dostosować grubość warstwy do odległości roboczej obiektywu konfokalnego.
  5. Utwardzanie
    1. Umieścić formy w piekarniku w temperaturze 50°C.
    2. Utwardzać PDMS przez 4 h.
  6. Usuwanie warstw PDMS
    1. Usuwanie utwardzonego PDMS
      1. Ostrożnie odkleić utwardzone warstwy PDMS od formy (Rysunek 1F).
      2. Ostrożnie obchodzić się z warstwami PDMS, aby nie uszkodzić mikrostruktur.
  7. Łączenie warstw PDMS i wytwarzanie portów wlotowych i wylotowych
    1. Wytwarzanie portów wlotowych i wylotowych
      1. Wyciąć otwory w wyznaczonych miejscach wlotowych i wylotowych za pomocą 1-milimetrowego wycinaka do biopsji.
      2. Podczas wycinania ustawić stronę z mikrokanałami do góry.
        UWAGA: Położyć warstwę PDMS na macie do cięcia, aby uniknąć uszkodzeń strukturalnych.
      3. Wyciąć dwa otwory w górnej warstwie, odpowiadające górnemu mikrokanałowi.
    2. Czyszczenie warstw PDMS
      1. Oczyścić warstwy PDMS za pomocą alkoholu izopropylowego lub etanolu.
      2. Usunąć resztkowe cząsteczki kurzu za pomocą sterylnej taśmy klejącej.
      3. Przed montażem sprawdzić, czy wszystkie powierzchnie wiążące są wolne od zanieczyszczeń.
    3. Aktywacja plazmowa powierzchni PDMS
      1. Ustawić górną i środkową warstwę PDMS do obróbki plazmą (Rysunek 1G).
      2. Aktywować powierzchnie za pomocą ręcznego urządzenia do plazmy koronowej pracującego przy mocy około 25 W z powietrzem otoczenia jako gazem roboczym.
      3. Zachować odległość roboczą około 1 mm między źródłem plazmy a powierzchnią PDMS.
        OSTRZEŻENIE: Obróbkę plazmową należy przeprowadzać przy odpowiedniej wentylacji i unikać bezpośredniej ekspozycji na generowany przez plazmę ozon.
      4. Włączyć urządzenie do obróbki plazmowej i odczekać 5 s na stabilizację.
      5. Przed obróbką sprawdzić, czy generowana jest jednolita wiązka plazmy.
      6. Przetwarzać górną warstwę PDMS przez 10 s, wykonując ciągły ruch w przód i w tył z prędkością około 5 mm/s.
      7. Przetwarzać środkową warstwę PDMS przez 10 s, stosując ten sam ruch i odległość.
      8. Zastosować dodatkową 1-sekundową obróbkę plazmową górnej warstwy bezpośrednio przed łączeniem.
    4. Łączenie górnej i środkowej warstwy
      1. Niezwłocznie po obróbce plazmowej dopasować górny mikrokanał do dysku dentynowego.
      2. Połączyć górną i środkową warstwę.
      3. Umieścić połączony zespół w piekarniku w 75°C przez 5 min.
      4. Utrwalić wiązanie podczas inkubacji.
        UWAGA: Dysk dentynowy i mikrokanał są widoczne gołym okiem i można je wyrównać bez dodatkowych narzędzi do pozycjonowania.
    5. Wytwarzanie portów dolnego mikrokanału
      1. Wyciąć dwa otwory odpowiadające dolnemu mikrokanałowi przez połączone górną i środkową warstwy.
      2. Wycinanie przeprowadzić przez obie warstwy jednocześnie, aby zapewnić wyrównanie.
        UWAGA: Procedura ta generuje cztery otwory w górnej warstwie i dwa otwory w środkowej warstwie.
      3. Przed wycinaniem położyć połączony zespół na sztywnej macie do cięcia.
      4. Zastosować jednostajny nacisk w dół jednym ruchem.
        UWAGA: Należy unikać sił rotacyjnych lub bocznych, aby zminimalizować ryzyko rozwarstwienia.
      5. Usunąć resztki z miejsc perforacji za pomocą sterylnej, niepozostawiającej kłaczków gazy zwilżonej alkoholem izopropylowym.
      6. Obejrzeć otwory i otaczające je obszary wiązania przy odpowiednim oświetleniu.
      7. Przed kontynuacją upewnić się, że nie występują rozwarstwienia, pęknięcia lub niepełne perforacje.
    6. Łączenie warstwy dolnej
      1. Przetraktować warstwę dolną plazmą zgodnie z opisem w kroku 2.7.4.
      2. Dopasować porty wlotowe i wylotowe dolnego mikrokanału do otworów w górnej i środkowej warstwie.
      3. Przyłączyć warstwę dolną, aby dokończyć montaż urządzenia.
        UWAGA: Przed łączeniem należy zaznaczyć miejsca wlotowe i wylotowe na zewnętrznej powierzchni warstwy dolnej, aby ułatwić wyrównanie.
        UWAGA: Komory plazmowe mogą zapewniać silniejsze wiązanie niż pisawki plazmowe, jak podano w literaturze36.
        UWAGA: Gotowe urządzenie składa się z trójwarstwowej platformy mikrofluidycznej zawierającej interfejs dentynowy (Rysunek 1H). Dolna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę miazgi modelu, natomiast górna powierzchnia dentyny reprezentuje stronę koronarną przeznaczoną do ekspozycji na biomateriały stomatologiczne lub preparaty bakteryjne.
  8. Test szczelności urządzenia mikrofluidycznego
    1. Inspekcja zmontowanego urządzenia
      1. Sprawdzić zmontowane urządzenie pod kątem przesunięć.
      2. Sprawdzić zespół pod kątem niepełnego wiązania i widocznych wycieków.
    2. Test szczelności
      1. Podłączyć igły Luer-lock 19G do portów wlotowych (Rysunek 1E).
      2. Podłączyć igły do przewodów pompy mikrofluidycznej.
      3. Delikatnie wcisnąć piasty igieł w wycięte otwory, aby uzyskać szczelne dopasowanie.
      4. Wstrzyknąć sterylny PBS lub pożywkę hodowlaną z prędkością przepływu 10 µL/min.
      5. Utrzymać przepływ cieczy przez co najmniej 5 min.
      6. Podczas przepływu kontrolować wszystkie interfejsy wiążące, krawędzie kanałów i brzegi dysku dentynowego.
      7. Obserwować urządzenie przy odpowiednim oświetleniu podczas i po wstrzykiwaniu.
      8. Potwierdzić brak gromadzenia się cieczy, zawilgocenia lub tworzenia się kropli.
      9. Zaklasyfikować urządzenie jako szczelne, jeśli nie wykryto wycieków.
      10. Odrzucić urządzenia wykazujące wycieki.
        UWAGA: Test szczelności należy przeprowadzić na każdym wytworzonym urządzeniu przed zasiewem komórek lub użyciem eksperymentalnym.
  9. Sterylizacja i przechowywanie urządzenia mikrofluidycznego
    1. Sterylizacja
      1. Ekspozycję górnej powierzchni zmontowanego urządzenia na światło UV (254 nm) przeprowadzić przez 30 min w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
      2. Ekspozycję dolnej powierzchni na światło UV przeprowadzić przez dodatkowe 30 min.
      3. Przepłukać mikrokanały 70% etanolem przez 20 min.
      4. Przemyć mikrokanały trzy razy sterylnym PBS, aby usunąć resztkowy etanol.
    2. Przechowywanie
      1. Zesterylizowane urządzenie należy wykorzystać niezwłocznie do eksperymentów z kulturą komórek.
      2. Alternatywnie, urządzenie można przechowywać zanurzone w sterylnym PBS w temperaturze 4°C w sterylnym pojemniku do czasu użycia.
        ​OSTRZEŻENIE: Po montażu urządzenia nie należy używać chloraminy ani innych roztworów dezynfekcyjnych, ponieważ PDMS może absorbować te związki, co może wpłynąć negatywnie na żywotność komórek.

3. Ocena adhezji i żywotności mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba

  1. Przygotowanie powierzchni dentyny
    1. Wstrzyknąć 10% EDTA do urządzenia.
    2. Utrzymać kontakt roztworu EDTA z powierzchnią dentyny przez 15 min.
    3. Wstrzykiwać 0,5 mL EDTA co 3 min, aby utrzymać ruch cieczy w mikrokanale.
    4. Przepłukać krążek dentynowy trzy razy wodą ultraczystą.
    5. Każde płukanie prowadzić przez 5 min.
      UWAGA: Obróbka EDTA usuwa warstwę smear i odsłania białka macierzy dentynowej.
      OSTROŻNIE: Roztworami EDTA należy operować w rękawiczkach i okularach ochronnych, aby uniknąć podrażnienia skóry i oczu.
  2. Siew macierzystych komórek miazgi zębowej
    1. Ekspansja macierzystych komórek miazgi zębowej
      1. Zasiać macierzyste komórki miazgi zębowej do kolby T75 w gęstości 1 × 106 komórek na kolbę.
      2. Inkubować komórki w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 aż do osiągnięcia około 80% konfluencji.
      3. Odczepić komórki za pomocą trypsyny.
      4. Zneutralizować trypsynę za pomocą kompletnej pożywki hodowlanej.
      5. Odwirować zawiesinę komórkową w celu uzyskania osadu komórkowego.
      6. Ocenić żywotność komórek za pomocą błękitu trypanu.
      7. Używać zawiesin komórkowych wykazujących żywotność ≥90%.
    2. Przygotowanie zawiesiny komórkowej
      1. Przygotować uprzednio ogrzaną do 37°C zawiesinę komórkową.
      2. Dostosować stężenie komórek do 100 000 komórek/mL w kompletnej pożywce hodowlanej.
      3. Przygotować końcową objętość zawiesiny wynoszącą 1–2 mL.
        UWAGA: W niniejszym badaniu wykorzystano komórki w 5. pasażu.
    3. Siew komórek
      1. Wstrzyknąć zawiesinę komórkową do wlotu dolnego mikrokanału.
      2. Odwrócić urządzenie po siewie komórek.
        UWAGA: Odwrócenie urządzenia sprzyja sedymentacji komórek w kierunku powierzchni dentyny i zwiększa adhezję komórkową.
    4. Inkubacja
      1. Umieścić odwrócone urządzenie wewnątrz szalki Petriego.
      2. Dodać 1 mL pożywki hodowlanej do szalki Petriego, aby zminimalizować parowanie.
      3. Inkubować urządzenie w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 przez 24 h.
      4. Utrzymywać statyczne warunki hodowli przez cały okres inkubacji.
        UWAGA: W niniejszym badaniu nie przeprowadzono walidacji przepływu dynamicznego.
        UWAGA: Niniejszy protokół opisuje statyczne warunki hodowli dla wstępnej walidacji urządzenia i oceny adhezji komórkowej.
    5. Wstępna walidacja urządzenia
      1. Ocenić adhezję komórek za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.
      2. Przed analizą odzyskać krążek dentynowy poprzez demontaż urządzenia.
  3. Przygotowanie próbek do skaningowej mikroskopii elektronowej
    1. Odzyskiwanie i płukanie próbek
      1. Zdemontować urządzenie po 24 h inkubacji.
      2. Odzyskać krążek dentynowy i przenieść go na płytkę hodowlaną lub do szalki Petriego.
      3. Ułożyć krążek tak, aby zasiana komórkami powierzchnia dentyny była skierowana ku górze.
      4. Przepłukać krążek dentynowy dwukrotnie, używając 1 mL PBS.
    2. Fiksacja
      1. Dodać 2 mL 2,5% glutaraldehydu w 0,1 M buforze fosforanowym Sorensena.
      2. Inkubować próbkę przez 30 min w temperaturze pokojowej (RT).
        OSTROŻNIE: Glutaraldehyd jest toksyczny i może powodować podrażnienia skóry, oczu i dróg oddechowych. Procedury fiksacji należy przeprowadzać w dygestorium chemicznym, stosując odpowiednie środki ochrony osobistej.
    3. Płukanie po fiksacji
      1. Usunąć roztwór glutaraldehydu.
      2. Przepłukać krążek dentynowy trzy razy ultraczystą wodą destylowaną w temperaturze pokojowej (RT).
    4. Analiza SEM
      1. Przeanalizować próbki przy użyciu środowiskowego skaningowego mikroskopu elektronowego.
      2. Obsługiwać mikroskop w warunkach niskiej próżni (25 Pa).
      3. Użyć napięcia przyspieszającego 10,0 kV i odległości roboczej 7,0 mm.
      4. Pozyskać obrazy w trybie detekcji 3D elektronów wstecznie rozproszonych (BSE-3D).
      5. Wykonać zdjęcia przy powiększeniu ×200 (Rysunek 2A).
  4. Ocena żywotności komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej
    1. Przygotowanie próbek
      1. Zasiać i hodować komórki zgodnie z opisem w kroku 3.2.
      2. Inkubować urządzenie przez 24 h w temperaturze 37°C i przy 5% CO2.
      3. Zdemontować urządzenie i odsłonić powierzchnię dentyny.
      4. Przenieść krążek dentynowy do płytki wielodołkowej zawierającej uprzednio ogrzany HBSS+/+ uzupełniony o Ca2+ i Mg2+.
    2. Płukanie próbek
      1. Przepłukać krążek dentynowy dwukrotnie HBSS+/+.
      2. Usunąć pozostałości surowicy i czerwieni fenolowej przed barwieniem.
        UWAGA: Pozostałości surowicy i czerwieni fenolowej mogą zwiększać tło autofluorescencji.
    3. Barwienie żywych komórek
      1. Przygotować świeży roztwór roboczy Calcein AM o stężeniu 2 µM w HBSS+/+.
      2. Dodać odpowiednią ilość roztworu barwiącego, aby w pełni pokryć powierzchnię dentyny.
      3. Inkubować próbkę przez 20 min w temperaturze 37°C w ciemności.
      4. Usunąć roztwór barwiący po inkubacji.
    4. Barwienie martwych komórek
      1. Dodać roztwór roboczy jodku propidynyum (1–2 µg/mL w HBSS+/+).
      2. Inkubować próbkę przez 5–8 min w temperaturze 37°C w ciemności.
      3. Nie przekraczać 10 min inkubacji.
      4. Przepłukać próbkę dwukrotnie HBSS+/+.
      5. Utrzymywać próbkę zanurzoną w buforze aż do momentu obrazowania.
    5. Pozyskiwanie obrazów mikroskopii konfokalnej
      1. Pozyskać obrazy konfokalne w ciągu 30 min od barwienia.
      2. Pozyskiwać obrazy sekwencyjnie w kanałach zielonym i czerwonym.
      3. Do obrazowania żywych komórek użyć λex 490 nm i λem 515 nm.
      4. Do obrazowania martwych komórek użyć λex 535 nm i λem 617 nm.
        UWAGA: Chronić fluorescencyjne roztwory barwiące i zabarwione próbki przed ekspozycją na światło podczas procedur inkubacji i obrazowania (Rysunek 2B).

Obrazy z SEM i mikroskopii fluorescencyjnej; struktura powierzchni komórek; barwienie tkanek; analiza komórkowa.
Rycina 2: Reprezentatywna ocena adhezji i żywotności komórek macierzystych miazgi zębnej w urządzeniu OoC kompleksu zębina–miazga. (A) Obraz z mikroskopii elektronowej skaningowej (SEM) przedstawiający adherentne komórki macierzyste miazgi zębnej (biała gwiazdka) na powierzchni zębiny po 24 h statycznej hodowli w urządzeniu OoC. Po 24 h hodowli adherentne komórki pokrywały 54,35 ± 0,92% powierzchni zębiny wystawionej na mikrokanał. W obszarze zębiny pokrytym PDMS (czarna gwiazdka) nie obserwuje się komórek, co wskazuje na skuteczne uszczelnienie między warstwami urządzenia. Pasek skali = 200 µm. (B) Obraz z mikroskopii konfokalnej przedstawiający żywe komórki macierzyste miazgi zębnej zabarwione na zielono i przytwierdzone do powierzchni zębiny (białe strzałki) po 24 h statycznej hodowli. Obserwuje się również martwe komórki zabarwione na czerwono (niebieskie strzałki). Pasek skali = 50 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pomyślne wykonanie urządzenia typu tooth-on-a-chip przebiegało zgodnie z schematem przedstawionym na Rysunku 1A–1I, obejmującym przygotowanie krążka zmęża (Rysunek 1D), wykonanie formy metodą fotolitografii (Rysunek 1E), usunięcie utwardzonych warstw PDMS (Rysunek 1F), aktywację plazmą przed bondowaniem (Rysunek 1G), montaż końcowego urządzenia (Rysunek 1H) oraz podłączenie urządzenia do układu mikroprzepływowego (Rysunek 1I). Powstałe urządzenie składało się z trójwarstwowej konstrukcji z PDMS, w której krążek zmęża został w pełni zintegrowany z warstwą środkową, a górny i dolny mikrokanał zostały rozmieszczone po obu stronach powierzchni zmęża (Rysunek 1H).

Pozytywny wynik na tym etapie charakteryzował się brakiem widocznych pęcherzyków powietrza lub delaminacji oraz szczelnym przepływem cieczy po wstrzyknięciu PBS lub pożywki hodowlanej przez porty wlotowe (Rycina 1I). Niewłaściwe ustawienie portów mikrokanałów, niepełne wiązanie plazmowe lub nieszczelność na styku dentyna–PDMS świadczyły o niepowodzeniu procesu montażu i wymagały powtórzenia procedury wykonania.

Wytworzono łącznie 30 urządzeń, z czego około 20% uległo awarii podczas produkcji lub testowania. Awarię wiązano przede wszystkim z wyciekiem cieczy poza granice mikrokanału w wyniku niepełnego wiązania plazmowego, natomiast mniejsza część awarii wynikała z delaminacji w innych regionach urządzenia. Żadnych awarii nie przypisano wyciekom na styku dentyna–PDMS ani niewłaściwemu wyrównaniu wlotowych i wylotowych portów mikrokanału.

Po 24 h hodowli statycznej pomyślne zasianie komórek potwierdzono obecnością przylegających mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba o morfologii fibroblastycznej na powierzchni dentyny. Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwoliła ocenić zarówno adhezję komórek, jak i integralność urządzenia (Rysunek 2A). Z zastosowaniem niniejszego protokołu komórki przylegające pokryły 54,35 ± 0,92% powierzchni dentyny wystawionej na działanie mikrokanału po 24 h hodowli. Wynik pozytywny objawiał się obecnością komórek przylegających wyłącznie w obszarze mikrokanału, podczas gdy powierzchnia dentyny pokryta PDMS pozostała wolna od przylegania komórek (Rysunek 2A). Taki rozkład przestrzenny potwierdził skuteczne uszczelnienie między warstwami urządzenia oraz prawidłowy montaż urządzenia. Przeciwnie, obecność komórek poza granicami mikrokanału świadczyła o przecieku i powinna być uznana za wynik negatywny.

Mikroskopia konfokalna z zastosowaniem barwienia żywe/martwe umożliwiła nieniszczącą ocenę żywotności komórek wewnątrz urządzenia. Pomyślny wynik charakteryzował się przewagą żywych komórek wykazujących zieloną fluorescencję i morfologię fibroblastyczną, przy jedynie sporadycznym występowaniu martwych komórek zabarwionych na czerwono (Rycina 2B). Z kolei wysoki odsetek martwych komórek wskazywałby na nieoptymalne przygotowanie wstępne dentyny, niewystarczające przemycie lub nieodpowiednie warunki hodowli.

Podczas optymalizacji protokołu oceniono wstępną strategię wykonania, w której do pozycjonowania dysku dentynowego w środkowej warstwie PDMS wykorzystano stałą formę z wcześniej zdefiniowanym wgłębieniem (Rycyna 3A). Choć podejście to miało na celu standaryzację rozmieszczenia dysku i ograniczenie wycieków na styku dysku i PDMS, w praktyce okazało się nieefektywne. Ponieważ obszar odpowiadający wgłębieniu na dysk dentynowy musiał być ręcznie wycinany z utwardzonej warstwy PDMS, nie można było niezawodnie osiągnąć precyzyjnego dopasowania krawędzi dysku do wyciętych brzegów PDMS, co prowadziło do powstania szczelin międzyfazowych powodujących wycieki w około 50% wykonanych urządzeń (Rycina 3A).

Analiza SEM mikrochipu; schemat przedstawiający cechy powierzchni do badania materiału przy powiększeniu 500x.
Rysunek 3: Reprezentatywne obrazy ilustrujące nieudane podejścia do wykonania urządzenia, zidentyfikowane podczas optymalizacji urządzenia OoC kompleksu zębinowo-miazgowego. (A) Forma krzemowa zawierająca stałe wgłębienia zaprojektowane dla standaryzowanego pozycjonowania krążka zębiny (białe strzałki). Ze względu na naturalną zmienność wymiarów krążków zębiny wynikającą z ręcznego przygotowania próbek, nie udało się osiągnąć niezawodnego dopasowania do stałej geometrii formy, co prowadziło do powstania szczelin międzyfazowych i przecieków w około 50% wykonanych urządzeń. (B) Obraz z pomiaru za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej powierzchni zębiny po zastosowaniu materiału uszczelniającego na styku krążka i PDMS. Wskazano odsłoniętą zębinę (czarna gwiazdka) oraz osady materiału uszczelniającego (biała gwiazdka). Niezamierzone rozprzestrzenienie się materiału uszczelniającego na powierzchnię zębiny upośledziło adhezję komórek i zmniejszyło dostępną powierzchnię dla kolonizacji komórek. Pasek skali = 100 µm. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Aby rozwiązać ten problem, na styku dysku i PDMS zastosowano materiał uszczelniający. Podejście to wprowadziło jednak dodatkową wadę, ponieważ materiał uszczelniający rozprzestrzenił się na powierzchnię dentyny i zapobiegł adhezji komórek w obszarach pokrytych tym materiałem, co wykazano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Rycina 3B). Te nieoptymalne wyniki uwydatniły dwa krytyczne ograniczenia początkowej strategii wykonania: niewystarczające dopasowanie między wyciętym ręcznie wgłębieniem w PDMS a dyskiem dentynowym oraz obniżoną adhezję komórek związaną z zastosowaniem materiału uszczelniającego.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsze badanie opisuje szczegółowy protokół wytwarzania pionowo ułożonego urządzenia tooth-on-a-chip, zawierającego zębinę oraz komórki macierzyste miazgi zęba, i demonstruje reprezentatywną adhezję oraz żywotność komórek wewnątrz urządzenia w warunkach hodowli statycznej. Protokół został opracowany w celu zapewnienia powtarzalnego schematu pracy dla wytwarzania i montażu platformy OoC kompleksu zębina–miazga, odpowiedniej do badań in vitro interfejsu zębiny. Ustanowienie takiego schematu pracy jest szczególnie istotne, ponieważ nasz niedawny przegląd systematyczny wykazał, że dziedzina modeli mikrofluidycznych dla kompleksu zębina–miazga znajduje się w fazie początkowej, charakteryzującej się dużą heterogenicznością metodologiczną w zakresie architektury urządzeń i materiałów, co poważnie ogranicza powtarzalność i standaryzację obecnych modeli tooth-on-a-chip34. Poprzez dostarczenie szczegółowego i powtarzalnego protokołu, niniejsze badanie eliminuje te ograniczenia i przyczynia się do rozwoju lepiej zdefiniowanych modeli biologicznych. W szerszym kontekście rozwoju OoC zastosowanego w biologii jamy ustnej, França i współpracownicy15 zapoczątkowali tę dziedzinę mikrofluidycznym modelem tooth-on-a-chip zawierającym dyski zębinowe i komórki odontoblastopodobne, wykazując możliwość odtworzenia interfejsu zębina–miazga w dynamicznym środowisku mikrofluidycznym oraz oceny odpowiedzi cytotoksycznej na materiały stomatologiczne. Od tego przełomowego wkładu w literaturze opisano coraz większą liczbę platform oralnych OoC34, odnoszących się do różnych aspektów biologii tkanek zębowych, interakcji biomateriałowych oraz mikrobiologii jamy ustnej, co ugruntowało to podejście jako aktywną i szybko rozwijającą się dziedzinę badań. Przedstawiony protokół wnosi wkład w ten obszar, dostarczając szczegółowy i powtarzalny schemat wytwarzania platformy tooth-on-a-chip o pionowej strukturze, dostępnej dla grup badawczych dysponujących standardowymi możliwościami mikrofluidycznymi.

Kilka etapów protokołu jest krytycznych dla pomyślnego wykonania i działania urządzenia. W szczególności wylewanie PDMS na formę wymaga dokładnej kontroli w celu uzyskania jednolitej grubości warstwy i właściwego ukształtowania mikrokanałów. Grubość warstw PDMS powinna być dobrana w zależności od zamierzonego zastosowania końcowego. Na przykład mikroskopia konfokalna wymaga odpowiednio cienkich warstw PDMS, aby umożliwić wizualizację optyczną komórek przylegających do powierzchni zębiny. Jednakże cieńsze warstwy mogą być trudniejsze w manipulacji podczas procedur wykonania i montażu. W konsekwencji optymalizacja grubości PDMS stanowi istotny kompromis między dostępnością do obrazowania a praktyczną obsługą podczas wytwarzania urządzenia. Ponadto w niniejszym badaniu mikroskopia konfokalna nienaruszone urządzeń nie była możliwa, ponieważ warstwa PDMS pokrywająca komórki miała grubość 0,4 mm, co przekraczało głębokość penetracji dostępnego mikroskopu konfokalnego (0,2 mm). W rezultacie obrazowanie konfokalne przeprowadzono po demontażu urządzenia i bezpośredniej ekspozycji powierzchni zębiny. Dodatkowo mikroskopia fluorescencyjna nie była możliwa do zastosowania w tym urządzeniu, ponieważ naturalna nieprzezroczystość zębiny uniemożliwiała bezpośrednią wizualizację optyczną komórek przylegających do jej powierzchni.

Ograniczenie to jest szczególnie istotne w przypadku konfiguracji OoC o układzie pionowym, w których mikrokanał zawierający komórki znajduje się pod krążkiem dentyny, co powoduje, że dostęp optyczny jest utrudniony zarówno przez znajdującą się powyżej warstwę PDMS, jak i przez nieprzezroczystość samej dentyny. Ograniczenie to nie występuje w projektach chipów o układzie poziomym, gdzie mikrokanały biegną bocznie obok dentyny, a nie pod nią, co umożliwia bezpośredni dostęp optyczny do powierzchni zasianej komórkami bez zakłóceń wynikających z nieprzezroczystości dentyny lub grubości PDMS. Wybór między konfiguracją pionową a poziomą powinien zatem uwzględniać nie tylko wymagania płynowe i biologiczne, ale także dostępne w laboratorium metody obrazowania. W systemie OoC projekt urządzenia odgrywa istotną rolę, a mikrośrodowisko musi być utrzymywane jak najbliżej warunków in vivo. Podobnie jak większość tkanek, ząb jest poddawany bodźcom mechanicznym i wykazuje zachowanie anizotropowe35, co oznacza, że jego właściwości różnią się w zależności od kierunku przyłożonego bodźca. Ponadto istnieją różnice histologiczne między koronalną częścią kompleksu dentyna-miazga, gdzie dentyna i odontoblasty są ułożone pionowo, a częścią boczną, gdzie odontoblasty znajdują się obok dentyny, z wyraźnymi różnicami w liczbie komórek, ich organizacji oraz orientacji kanalików dentynowych. Projekt chipa o układzie pionowym zapewnia zatem bardziej wierną reprezentację anatomiczną zmian próchnicowych i materiałów restauracyjnych wpływających na aspekt koronalny kompleksu dentyna-miazga.

Precyzyjna obróbka powierzchni plazmą jest niezbędna dla pomyślnego montażu urządzeń i pozostaje jednym z głównych wyzwań w produkcji chipów36. W niniejszym badaniu w 20% wykonanych urządzeń wystąpiła delaminacja. Wynik ten nie jest zaskakujący, ponieważ wiązanie PDMS–PDMS uzyskiwane za pomocą ręcznego pióra plazmowego, zastosowanego w obecnej pracy, generuje niższą koncentrację reaktywnych form tlenu niż systemy komór plazmowych próżniowych, które pozwalają na osiągnięcie stężeń tlenu powyżej poziomu atmosferycznego, a w konsekwencji tworzą większą liczbę kowalencyjnych grup powierzchniowych dostępnych do wiązania36. W rezultacie wytrzymałość wiązania osiągnięta przy użyciu pióra plazmowego jest z natury niższa i mniej powtarzalna niż ta uzyskiwana w dedykowanej komorze plazmowej, co prawdopodobnie przyczyniło się do zaobserwowanego wskaźnika delaminacji. Optymalizacja strategii integracji z dentyną wymagała również wielokrotnych iteracji procesu wytwarzania, aby uzyskać ścisły kontakt między dyskiem dentynowym a środkową warstwą PDMS przy jednoczesnym zminimalizowaniu wycieków. Początkowe podejście polegało na wykonaniu w środkowej warstwie zdefiniowanego wcześniej zagłębienia do umieszczenia dentyny; jednak ręczne wycinanie zagłębienia uniemożliwiło spójne dopasowanie dysku dentynowego do krawędzi PDMS, co prowadziło do wycieków podczas wstrzykiwania pożywki hodowlanej i skutkowało ogólnym wskaźnikiem sukcesu produkcji na poziomie około 50%.

Następnie oceniono zastosowanie kleju do protez w celu poprawy uszczelnienia na styku dentyna–PDMS, jednak skaningowa mikroskopia elektronowa wykazała zakłócenia w adhezji komórek oraz utrudnioną wizualizację komórek na powierzchni dentyny. W związku z tym zoptymalizowano ostateczny protokół poprzez umieszczenie krążka dentynowego bezpośrednio w formie przed starannym odlewaniem PDMS wokół próbki, co poprawiło integrację krążka dentynowego z urządzeniem i zmniejszyło potrzebę stosowania dodatkowych materiałów uszczelniających. Podejście to skutecznie wyeliminowało przecieki na styku dentyna–PDMS, zapewniając ścisły i dopasowany kontakt między krawędziami krążka dentynowego a otaczającym go PDMS, bez polegania na wtórnych środkach uszczelniających, które mogłyby zakłócać adhezję komórek do powierzchni dentyny. Należy również wziąć pod uwagę kilka ograniczeń niniejszej metody. Wytwarzanie urządzeń mikroprzepływowych wciąż w części zależy od procedur manualnych, co może wprowadzać zmienność między urządzeniami i operatorami. Chociaż fotolitografia zapewnia wysoką precyzję i powtarzalność w wytwarzaniu geometrii mikrokanałów, proces ten może wymagać specjalistycznego sprzętu i wiedzy technicznej. Alternatywne podejścia do wytwarzania, w tym techniki druku trójwymiarowego, mogą ułatwić prototypowanie urządzeń i zwiększyć dostępność dla niektórych laboratoriów; jednak czynniki takie jak rozdzielczość druku, pozostałości monomerów i biokompatybilność materiałów wymagają starnej optymalizacji37.

Ciągłe dostarczanie pożywki zapewnia komórkom stabilne środowisko i chroni je przed gromadzeniem się produktów przemiany materii lub zaburzeniami równowagi wapniowo-fosforowej16. Liczne badania wykazały, że naprężenia ścinające indukowane stałym przepływem mogą symulować procesy mechanotransdukcji podobne do sygnalizacji in vivo, które są kluczowymi czynnikami determinującymi zachowanie komórek38,39, przyczyniając się do różnicowania i dojrzewania komórek oraz indukując znaczące zmiany w ich morfologii, ekspresji genów i funkcji39. Niniejsze badanie opisuje wykonanie i wstępną walidację urządzenia, wykazując adhezję i żywotność komórek po 24 h w warunkach hodowli statycznej; w związku z tym nie oceniano wpływu dynamicznego przepływu. Wprowadzenie warunków dynamicznego przepływu stanowi ważny kierunek przyszłych badań i zostanie omówione w kolejnych pracach. Przedstawiony protokół zapewnia powtarzalny schemat wytwarzania urządzenia OoC z pionowo ułożonym kompleksem miazga–zębina, zawierającego zębinę w obrębie trójwarstwowej platformy mikroprzepływowej z PDMS. Potencjalne zastosowania modelu obejmują badanie oddziaływań między zębiną a biomateriałem, odpowiedzi komórkowych na materiały stomatologiczne oraz ocenę in vitro interfejsu miazga–zębina w kontrolowanych warunkach eksperymentalnych.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy deklarują brak konkurencyjnych interesów finansowych oraz brak konfliktów interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejsza praca była wspierana przez Projekt DIM24-0004 i Projekt PP24-0031, Dirección de Investigación, Universidad de La Frontera; FONDECYT Regular nr 1260116 oraz FONDECYT de Iniciación nr 11230701, Narodowa Agencja Badań i Rozwoju (ANID), Chile.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Materiały biologiczne i chemiczne
AcetonExpertQSOLV 8Czyszczenie wafla krzemowego
podłoże hodowlane Alpha MEMCytivaSH30265.02Pożywka do hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Chloramina (0,5%)Merck7080-50-4Roztwór do przechowywania krążków dentynowych
Macierzyste komórki miazgi zębaNie dotyczyNie dotyczyPierwotna hodowla komórek. Patrz kroki 3.2.1 i 3.2.2
EDTA (10%)WinklerN2222158EUsuwanie warstwy przesmarowania
Negatywowy fotorezyst na bazie epoksyduGersteltecGM1060Wytwarzanie form metodą fotolitografii
Glutaraldehyd (2,5%) w buforze Sorensena 0,1 M’bufor fosforanowySigma-Aldrich210908-06utrwalanie do SEM
Zdrowe ludzkie zęby (trzonowce lub przedtrzonowce)Nie dotyczyNie dotyczyPróbka ludzka
IzopropanolExpertQSOLV 16Czyszczenie wafla, zatrzymywanie wywoływania i czyszczenie PDMS
Zestaw do oceny żywotności LIVE/DEADSigma-Aldrich451Barwienie fluorescencyjne żywotności. 
PBS (bufor fosforanowy)Corning46-013-CMMycie i test szczelności
Baza i czynnik sieciujący PDMS (polidimetylosiloksan)DowSylgard 184Wytwarzanie urządzenia
PGMEASigma Aldrich484431Wywoływanie fotorezystu
Błękit trypanuSigma Aldrich T8154-100mlOcena żywotności komórek
TrypsynaCorning25-053-CIOdrywanie komórek
Woda ultrazczystaCytivaSH30529.01Roztwór piorący
Materiały eksploatacyjne i sprzęt laboratoryjny
igły do strzykawek 19GVmaticVCB19050Podłączenie urządzenia do mikropompy lub strzykawki
Wyciśnik do biopsji (średnica: 1 mm)Harris UnicoreWHAWB100073Wykonanie portów wlotowych i wylotowych
Mata do cięciaNicecoolNie dotyczyOchrona powierzchni podczas wykrawania
Dyski do wykańczania stomatologicznego (np. Sof-Lex)3MSof-LexPolerowanie dentyny
Adaptery z gniazdem Luer na kolceRunze FluidicsRH-M016Połączenie rurek
Szklany lub plastikowy pręt do mieszaniaDuranNie dotyczyMieszanie PDMS
Strzykawki podskórneŻurawinapc-12246Wysiew komórek i test szczelności
Sterylna gaza niepozostawiająca włókienLindersonNie dotyczyUsuwanie resztek po wycinaniu
Adaptery Luer męskieRunze FluidicsRH-G016Połączenie przewodów
Naczynie do mieszaniaDuranNie dotyczyPrzygotowanie PDMS
Szalka Petriego (140 mm × 20 mm)Deltalab2000219Hodowla komórkowa/inkubacja
Podłoże z politetrafluoroetylenuCCTValNie dotyczyWytwarzanie pośredniej warstwy dentynowej
Wafer krzemowyJiaozuo Commercial FineWinNie dotyczyWytwarzanie form
Rurka silikonowaRunze Fluidics96421Połączenie płynowe
kolba T75Corning 353136Ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych miazgi zęba
Płytka wielodołkowaSPL Life Sciences30006Barwienie konfokalne i przygotowanie do obrazowania
Sprzęt i instrumenty
Osuszacz powietrzaMETALPLANTITAN-040Osuszanie sprężonego powietrza
Źródło sprężonego powietrzaSCHULZCSD-18.1Czyszczenie form i powierzchni
Mikroskop konfokalnyOlympusNie dotyczyModel: FV1000
System bezpośredniej litografii laserowejHeidelberguPG 101Naświetlanie fotorezystu
Skaningowy mikroskop elektronowy z komorą środowiskowąHitachiNie dotyczyModel: Quanta 400 
Głowica szybkozrotowaNakanishiNie dotyczyModel: Pana-max2
Płyta grzewczaLabTechEH20A PlusWygrzewanie wafla i wygrzewanie fotorezystu
Dygestorium z laminarnym przepływem powietrzaBioBaseBBS8V1708313DSterylizacja urządzeń
Pompa mikroprzepływowaNowa EraNie dotyczyModel: 1002X-ES. Badanie szczelności przy 10 µl/min
Forma mikrostrukturalna (wykonana metodą fotolitografii)CCTValNie dotyczySpecyfikacje dotyczące wykonania formy znajdują się w kroku 2.2
Piec lub inkubatorMemmertUN110Utwardzanie PDMS w temperaturze 50°C°C i konsolidacja wiązań w 75°C
Komora do czyszczenia plazmowego w próżniPlazma FariGD-5Aktywacja wafli plazmą
Ręczne urządzenie do plazmy koronowej Aurora Pro ScientificAPS-CD-20ACAktywacja plazmowa PDMS
SonikatorElma SonicS 10 (H)Czyszczenie wafla
Komora próżniowa lub eksykator (250 mm)WinglassNie dotyczyOdpowietrzanie PDMS
Pompa próżniowaKOŁYSARKA300Odgazowywanie PDMS

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Schlüter KD. The use of animals in physiological science: the past, the present, and the future. Pflugers Arch. 2024;476(11):1653-63.
  2. Robinson NB, et al. The current state of animal models in research: a review. Int J Surg. 2019;72:9-13.
  3. Nakashima M, et al. Animal models for stem cell-based pulp regeneration: foundation for human clinical applications. Tissue Eng Part B Rev. 2019;25(2):100-13.
  4. Ribeiro AB, et al. Short-term effect of ligature-induced periodontitis on cardiovascular variability and inflammatory response in spontaneously hypertensive rats. BMC Oral Health. 2021;21(1):515.
  5. IQVIA Institute. Global trends in R&D 2022. IQVIA Institute; 2021.
  6. Loewa A, Feng JJ, Hedtrich S. Human disease models in drug development. Nat Rev Bioeng. 2023;1:1-15.
  7. Paul SM, et al. How to improve R&D productivity: the pharmaceutical industry's grand challenge. Nat Rev Drug Discov. 2010;9(3):203-14.
  8. Rosa V, et al. A critical analysis of research methods and biological experimental models to study pulp regeneration. Int Endod J. 2022;55(Suppl 2):446-55.
  9. França CM, et al. The tooth on-a-chip: a microphysiologic model system mimicking the biologic interface of the tooth with biomaterials. Lab Chip. 2020;20(2):405-13.
  10. Zhang H, et al. Research and development of microenvironment's influence on stem cells from the apical papilla: construction of novel research microdevices, tooth-on-a-chip. Biomed Microdevices. 2024;26(3):33.
  11. Han JJ. FDA Modernization Act 2.0 allows for alternatives to animal testing. Artif Organs. 2023;47(3):449-50.
  12. Leung C, et al. A guide to the organ-on-a-chip. Nat Rev Methods Primers. 2022;2:33.
  13. Whitesides GM. The origins and the future of microfluidics. Nature. 2006;442:368-73.
  14. Belin S, Zuloaga KL, Poitelon Y. Influence of mechanical stimuli on Schwann cell biology. Front Cell Neurosci. 2017;11:347.
  15. Jansen KA, et al. A guide to mechanobiology: where biology and physics meet. Biochim Biophys Acta. 2015;1853(11):3043-52.
  16. Atif AR, et al. A microfluidics-based method for culturing osteoblasts on biomimetic hydroxyapatite. Acta Biomater. 2021;127:327-37.
  17. Soragni C, et al. A versatile multiplexed assay to quantify intracellular ROS and cell viability in 3D on-a-chip models. Redox Biol. 2022;57:102488.
  18. Ingber DE. Human organs-on-chips for disease modelling, drug development and personalized medicine. Nat Rev Genet. 2022;23(8):467-91.
  19. Huang C, et al. The application of organs-on-a-chip in dental, oral, and craniofacial research. J Dent Res. 2023;102(4):364-75.
  20. Rodrigues NS, et al. Biomaterial and biofilm interactions with the pulp-dentin complex-on-a-chip. J Dent Res. 2021;100(10):1136-43.
  21. Cordiale A, et al. An innovative "tooth-on-chip" microfluidic device emulating the structure and physiology of the dental pulp tissue. Adv Healthc Mater. 2025. doi:10.1002/adhm.202502080.
  22. Sanz-Serrano D, Mercade M, Ventura F, Sánchez-de-Diego C. Engineering a microphysiological model for regenerative endodontic studies. Biology. 2024;13(4):221.
  23. Qi Y, et al. Fabrication of tapered fluidic microchannels conducive to angiogenic sprouting within gelatin methacryloyl hydrogels. J Endod. 2021;47(1):52-61.
  24. Hu Q, et al. Gum-on-a-chip exploring host-microbe interactions: periodontal disease modeling and drug discovery. J Tissue Eng. 2025;16:20417314251314356.
  25. Svanberg S, et al. "Periodontal ligament-on-chip" as a novel tool for studies on the physiology and pathology of periodontal tissues. Adv Healthc Mater. 2024;13:e2303942.
  26. Mishra A, et al. Fluid flow-induced modulation of viability and osteodifferentiation of periodontal ligament stem cell spheroids-on-chip. Biomater Sci. 2023;11(22):7432-44.
  27. Rahimi C, et al. Oral mucosa-on-a-chip to assess layer-specific responses to bacteria and dental materials. Biomicrofluidics. 2018;12(5):054106.
  28. Dhall A, et al. A dental implant-on-a-chip for 3D modeling of host-material-pathogen interactions and therapeutic testing platforms. Lab Chip. 2022;22(24):4905-16.
  29. Franca CM, et al. In vitro models of biocompatibility testing for restorative dental materials: from 2D cultures to organs-on-a-chip. Acta Biomater. 2022;150:58-66.
  30. Hu S, et al. Characterization of silver diamine fluoride cytotoxicity using microfluidic tooth-on-a-chip and gingival equivalents. Dent Mater. 2022;38(8):1385-94.
  31. Niu L, et al. Microfluidic chip for odontoblasts in vitro. ACS Biomater Sci Eng. 2019;5(9):4844-51.
  32. Sriram G, Makkar H. Microfluidic organ-on-chip systems for periodontal research: advances and future directions. Front Bioeng Biotechnol. 2025;12:1490453.
  33. Pierfelice TV, et al. A systematic review on organ-on-a-chip in PDMS or hydrogel in dentistry: an update of the literature. Gels. 2024;10(2):102.
  34. Baeza-Fernández J, Bucchi C. Organ-on-a-chip devices to simulate the dentin-pulp complex: a qualitative systematic review. Ann Biomed Eng. 2026. doi:10.1007/s10439-026-04058-0.
  35. Arola D, et al. Transition behavior in fatigue of human dentin: structure and anisotropy. Biomaterials. 2007;28(26):3867-75.
  36. Kratz SRA, et al. A compression transmission device for the evaluation of bonding strength of biocompatible microfluidic and biochip materials and systems. Sci Rep. 2020;10(1):1400.
  37. Carvalho V, et al. 3D printing techniques and their applications to organ-on-a-chip platforms: a systematic review. Sensors (Basel). 2021;21(9):3304.
  38. LeGoff L, Lecuit T. Mechanical forces and growth in animal tissues. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2015;8(3):a019232.
  39. Akimoto S, et al. Laminar shear stress inhibits vascular endothelial cell proliferation by inducing cyclin-dependent kinase inhibitor p21(Sdi1/Cip1/Waf1). Circ Res. 2000;86(2):185-90.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Organ na chipieurz dzenie mikroprzep ywoweodlewanie PDMSfotolitografiaplazmowa modyfikacja powierzchnimezenchymalne kom rki macierzyste miazgi z baadhezja kom rkowamikroskopia konfokalna
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły