Znormalizowany protokół cytometrii przepływowej wielobarwnej do oceny choroby rezydualnej w ostrej białaczce

Podsumowanie

Ten protokół opisuje standaryzowany wielokolorowy przepływ cytometrii przepływowej dla oceny pozostałej choroby w ostrej białaczce, integrując kontrolowane przetwarzanie próbek, skonsolidowane parametry pozyskiwania, sekwencyjne strategie bramkowań oraz interpretację skorygowaną względem mianownika, aby poprawić analityczną reprodykowalność w rutynowych laboratoriach klinicznych.

Streszczenie

Choroba rezydualna wykrywalna (MRD) jest ważnym wskaźnikiem prognostycznym w leczeniu ostrej białaczki. Jednak rutynowa ocena wielokolorowa cytometrią przepływową (MFC) pozostaje podatna na zmienności przed analityczną i analityczną, w tym hemodilucję, niespójną głębokość nabywania oraz subiektywną interpretację. Ten artykuł przedstawia standaryzowany proces operacyjny dla rutynowej oceny MRD w ostrym białaczku limfoblastycznym limfocytów B (B-ALL) i ostrym białaczku szpikowym (AML). Protokół zawiera rygorystyczne kryteria akceptacji próbek, ze zintegrowaną oceną hemodilucji i stosuje metodę masowej lizy krwinek czerwonych dla próbek szpiku kostnego i krwi obwodowej. Standardyzacja analityczna osiągana jest poprzez chorobowo specyficzne panele przeciwciał ośmiokolorowe z dwóch probówek, zharmonizowane cele nabywania wymagające co najmniej 500 000 zdarzeń CD45-dodatnich oraz sztywne sekwencyjne strategie bramek. Ponadto, proces stosuje dostosowanie granic wykrywalności (LOD) i ilościowania (LOQ) względem mianownika, aby wspierać obiektywny trójpoziomowy system raportowania. Walidacja na 197 klinicznych próbkach wykazała mocną powtarzalność, solidną liniowość rozcieńczania i wysoką zgodność z powiązanymi ortogonalnymi badaniami molekularnymi. W sumie, ten protokół zapewnia praktyczną ramę dla standaryzowanego monitorowania MRD. dla standaryzowanego monitorowania MRD w rutynowych laboratoriach klinicznych poprzez integrację kontrolowanego przetwarzania przed-analitycznego i zharmonizowanych parametrów analitycznych.

Wprowadzenie

Nawet po osiągnięciu remisji morfologicznej, pacjenci z ostrą białaczką wymagają ciągłego monitorowania pod kątem choroby rezydualnej (MRD), aby dokładnie ocenić ryzyko nawrotu. Konwencjonalne badania morfologiczne i cytopatologiczne nie mają wystarczającej czułości, aby wykryć niskopoziomowe rezydualne populacje białaczkowych. W związku z tym ocena MRD stała się istotnym elementem monitorowania choroby zarówno w ostrej białaczce szpikowej (AML), jak i ostrej białaczce limfoblastycznej limfocytów B (B-ALL). Ostatnie zalecenia European LeukemiaNet podkreślają, że wiarygodna ocena MRD w AML zależy od standaryzacji technicznej i powtarzalności interpretacji pomiędzy obserwatorami, a nie od czystej dostępności testu^1,2. W B-ALL wielokolorowa cytometria przepływowa (MFC) pozostaje szczególnie ważna dla pacjentów bez stabilnych markerów molekularnych. Poprzednie badania wykazały, że standaryzowane wielokolorowe podejścia cytometrii przepływowej z wykorzystaniem strukturalnych paneli przeciwciał mogą zapewnić powtarzalne i czułe wykrywanie choroby rezydualnej³. Cytometria przepływowa jest szeroko stosowana ze względu na jej szerokie zastosowanie, szybki czas realizacji i opłacalność. Wynik testu zależy w dużym stopniu od standaryzowanej przygotki próbki, parametrów nabycia i interpretacji danych⁴.

Jednym z głównych wyzwań technicznych w cytometrii przepływowej MRD jest wykrywanie rzadkich zdarzeń, które są mocno zależne od głębokości nabycia i całkowitej liczby zdarzeń. Identyczne panele przeciwciał mogą dawać różne wrażliwości analityczne, jeśli próbki są zbierane z niekonsekwentnymi wielkościami mianowników⁵. Standaryzacja, dlatego, rozciąga się poza wybór przeciwciał i wymaga zharmonizowanego przetwarzania próbek, lizy dużej ilości czerwonych krwinek, kompensacji instrumentu, celów nabycia i strategii bramkowania. W próbkach szpiku kostnego, hemodilucja jest również znaczącą zmienną przed analityczną, ponieważ zanieczyszczenie krwią obwodową może sztucznie zmniejszyć pozorny rezydualny obciążenie białaczkowe^6,7. Ponadto, interpretacja zdarzeń o niskiej częstotliwości wymaga jasno określonych progów raportowania na podstawie głębokości nabycia specyficznej dla próbki. Ostatnie badania podkreślają znaczenie granic wykrywalności (LOD) i kwantyfikacji (LOQ) dostosowanych do mianownika dla poprawy spójności interpretacji MRD cytometrią przepływową⁸.

Głównym celem tego protokołu jest zapewnienie standaryzowanego przepływu pracy dla rutynowej oceny MRD opartej na MFC w B-ALL i AML. Protokół integruje kryteria akceptacji próbek, ocenę hemodilucji, projektowanie paneli przeciwciał specyficznych dla choroby, przygotowanie próbki z lizją masową, skonsolidowane cele nabycia, sekwencyjne bramki stałe i kryteria raportowania dostosowanych do mianownika w jedno ramy operacyjne^9,10. Łącząc standaryzowane procedury przed- i analityczne, ta metoda zapewnia praktyczne i powtarzalne podejście do rutynowego wdrożenia monitorowania MRD w laboratoriach klinicznych. Rysunek 1 przedstawia ogólny standaryzowany przepływ pracy przed- i analityczny zaimplementowany w tym badaniu. Tabela 1 podsumowuje cechy pacjentów i próbek osób z ostrą białaczką limfoblastyczną limfocytów B (B-ALL) i ostrą białaczkę szpikową (AML) zarejestrowanych w okresie weryfikacji w ramach wcześniej zdefiniowanych okien monitorowania (Koniec Indukcji, Konsolidacja i Przed-HSCT).

Rysunek 1: Standaryzowany przepływ pracy dla rutynowej wielokolorowej cytometrii przepływowej MRD. (A) Przedpływ pracy pokazujący przesiewanie próbek i ocenę jakości w ramach wcześniej zdefiniowanych interwałów monitorowania. (B) Analityczny przepływ pracy od lizji masowej czerwonych krwinek i barwienia przeciwciała przez sekwencyjność bramki, interpretację dostosowaną do mianownika i ostateczne raportowanie MRD. Kliknij tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Tabela 1: Skonsolidowane dane demograficzne pacjentów, cechy kliniczne próbek i rutynowe metryki nabycia. Ta jedna zaktualizowana tabela podsumowuje podstawowe cechy kliniczne zarejestrowanej kohorty obejmującej przypadki ostrej białaczki limfoblastycznej limfocytów B (B-ALL) i ostrej białaczki szpikowej (AML) i łączy dane demograficzne na poziomie pacjenta z cechami na poziomie próbki, interwałami monitorowania leczenia, wydolnością, wynikami hemodilucji, głębokością nabycia i klasyfikacjami choroby rezydualnej dostosowanymi do mianownika. Kliknij tutaj, aby pobrać tę tabelę.

Protokół

Wszystkie procedury z użyciem ludzkich próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i zatwierdzone przez Komitet Etyczny Drugiego Szpitala Ludowego w Neijiang (Numer zgody PXTS887192). W badaniu wykorzystano anonimizowane pozostałości próbek klinicznych uzyskane po rutynowych badaniach diagnostycznych. Zgoda pacjenta została uznana za niepotrzebną, ponieważ badanie nie wpłynęło na opiekę nad pacjentem, przydział leczenia lub procedury pobierania próbek. Substancje chemiczne, odczynniki i sprzęt użyty w protokole są wymienione w Tabeli Materiałów.

1. Pobieranie próbek i ocena przed-analityczna

1. Pobierz aspiraty szpiku kostnego jako preferowany rodzaj próbki do oceny pozostałej choroby (MRD). Używaj próbek krwi obwodowej tylko wtedy, gdy aspiracja szpiku kostnego jest przeciwwskazana klinicznie lub podczas wybranych analiz porównawczych i nadzorczych.
2. Pobieraj próbkę szpiku kostnego podczas pierwszego aspiratu, o ile to możliwe. Unikaj kolejnych aspiratów, aby zminimalizować skażenie krwią obwodową i niedoszacowanie niskiego poziomu pozostałej choroby.
3. Natychmiast po pobraniu przenieś próbki do probówek z dwukaliem kwasu etylenodiaminoctotetraoctowego (K2-EDTA) lub heparyny sodowej. Przechowuj i transportuj próbki w temperaturze pokojowej (18-25 °C) i chronij je przed bezpośrednim działaniem światła słonecznego.
   UWAGA: Nie należy chłodzić próbek.
4. Przetwarzaj wszystkie próbki w ciągu 24 godzin od pobrania. W przypadku badań stabilności zachowaj alikwoty do ponownej analizy po 24 godzinach i 48 godzinach, utrzymując warunki przechowywania w temperaturze pokojowej.
5. Weryfikuj identyfikator pacjenta, rodzaj antykoagulantu, integralność próbki i czas pobrania po otrzymaniu próbki. Odrzuć próbki wykazujące rozległe skrzepy, ciężką hemolizę lub zaznaczoną zmianę komórkową
6. Oceń próbki szpiku kostnego pod kątem hemodilucji przed ostateczną interpretacją. Oblicz półilościowy wynik hemodilucji w zakresie od 0,00 do 1,00, aby oszacować skażenie krwią obwodową.
7. Określ tę wartość, dzieląc ułamek dojrzałych limfocytów przez sumę progenitorów CD34-dodatnich, niedojrzałych granulocytów i dojrzałych limfocytów, gdzie wyższy wynik wskazuje na większy efekt rozcieńczenia.
   UWAGA: Oblicz wynik używając następującego wzoru:
    
   gdzie wyższy wynik wskazuje na większe skażenie krwią obwodową.
8. Klasyfikuj wyniki hemodilucji w następujący sposób: <0,20, dopuszczalne; 0,20-0,39, łagodnie hemodilucjowane; i ≥0,40, znacząco hemodilucjowane.
   UWAGA: Nie przypisuj ostatecznych interpretacji MRD-ujemnych znacząco hemodilucjonowanym próbkom, chyba że potwierdzi się odpowiednia wielkość mianownika i zachowana architektura przodków szpiku kostnego.

2. Przygotowanie panelu przeciwciał specyficznych dla choroby

1. Przygotuj standaryzowane dwu-probówkowe, ośmiokolorowe panele przeciwciał specyficznych dla choroby dla analizy B-ALL i AML. Osiągnij standaryzację panelu, ściśle przestrzegając stałych markerów rdzenia we wszystkich probówkach dla stabilnego wyznaczania populacji bramowych.
2. Używaj spójnych koniugacji fluorochromowych dla odpowiednich antygenów linii i ściśle przestrzegaj zalecanych przez producenta objętości titracji, aby zminimalizować zmienność fluorescencji między partiami.
3. Zobacz Tabelę uzupełniającą 1 dla kombinacji markerów, przypisań fluorochromów, klonów przeciwciał, objętości barwienia i parametrów akwizycji.
4. Dla oceny B-ALL używaj CD19, CD45, CD34, CD10 i CD20 jako markerów rdzenia w obu probówkach, aby zdefiniować populacje przodków i wzorce dojrzewania. Dodaj CD38, CD58 i CD81 do probówki 1.
5. Dodaj CD66c, CD123 i albo CD73 albo CD304 do probówki 2 zgodnie z ustalonym immunofenotypem ostrego białaczki związanym z chorobą w ocenie początkowej.
6. Dla oceny AML używaj CD45, CD34, CD117, CD13, CD33 i HLA-DR jako markerów rdzenia w obu probówkach, aby zdefiniować populacje blastów i niedojrzałych komórek szpiku mieloidalnego.
7. Dodaj CD7 i CD56 do probówki 1, aby ocenić ekspresję antygenów między liniami. Dodaj CD11b i CD15 do probówki 2, aby ocenić nieprawidłowości dojrzewania komórek szpiku mieloidalnego.

3. Przygotowanie do lizaty i barwienia

1. Przenieś 2,0 ml dobrze wymieszanej próbki szpiku kostnego lub krwi obwodowej do 15 ml polipropylenowej probówki. Jeśli objętość próbki jest ograniczona, użyj minimalnej objętości wejściowej 1,0 ml.
2. Dodaj 10 ml podgrzanego buforu lizującego chlorku amonu do próbki. Inkubuj zawiesinę przez 10 minut w temperaturze pokojowej, aby lizać cze

Wyniki

Charakterystyka zestawu danych dotyczących rutynowej implementacji

W okresie badania, 197 kolejnych próbek przeszło kwalifikacje i ocenę jakości przed analityczną, wchodząc w przepływ raportowania. Grupa badawcza obejmowała 98 pacjentów, 62 (63,3%) z ostrą białaczką limfoblastyczną linii B (B-ALL) i 36 (36,7%) z ostrą białaczką szpikową (AML). Grupa składała się z 64 mężczyzn (65,3%) i 34 kobiet (34,7%), z medianą wieku 32 lat (zakres międzykwartylowy [IQR], 13–49 lat; zakres, 2–73 lat). Mediana procentu blastów na poziomie początkowym wynosiła 67,2% (IQR, 56,9% – 80,2%).

Większość analizowanych próbek to wyciągi z szpiku kostnego (174/197, 88,3%), podczas gdy próbki krwi obwodowej stanowiły 23/197 (11,7%). Zgodnie z wcześniej określonymi przedziałami monitorowania, 86 próbek (43,7%) zebrano pod koniec terapii indukcyjnej, 65 (33,0%) podczas terapii konsolidacyjnej i 46 (23,4%) przed przeszczepem komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCT) (Tabela 1).

Mediana żywotności próbek wynosiła 88,3% (IQR, 84,4% – 92,6%). Przepływ nabywania danych przyniósł medianę 1 116 901 całkowitych zdarzeń (IQR, 908 521–1 258 946) przed oczyszczeniem danych. Po sekwencyjnym wykluczeniu analitycznym szczątków, przypadkowych podwójnych oraz nieżywych komórek, strategia bramkowa osiągnęła medianę 907 325 żywych pojedynczych dodatnich na CD45 zdarzeń docelowych (IQR, 690 112–1 095 836), z medianowym czasem nabywania 11,9 min. Mediana wyników hemodilucji wynosiła 0,20 (IQR, 0,14–0,28). Po interpretacji uwzględniającej mianownik, 41 próbek (20,8%) zostało sklasyfikowanych jako MRD-dodatnich, a 156 próbek (79,2%) zostało sklasyfikowanych poniżej określonego dla próbki progu wykrywalności (LOD) (Tabela 1).

Walidacja analityczna: powtarzalność, liniowość i stabilność

Wydajność analityczna standaryzowanego przepływu oceniono poprzez powtarzalność, liniowość rozcieńczeń i badania krótkotrwałej stabilności (Rysunek 2). Potrójne alikwoty przygotowane z tych samych rozdrobnionych próbek wykazały dużą powtarzalność, z medianowym współczynnikiem zmienności (CV) potrójnym równym 0,101% oraz 95-percentylowym CV równym 0,222%.

Rysunek 2: Walidacja analityczna standaryzowanego wielokolorowego przepływu cytometrii MRD. (A) Rozkład żywotności próbek wśród analizowanych próbek. (B) Korelację między oczekiwanymi a obserwowanymi wartościami MRD wśród eksperymentów seryjnego rozcieńczania na analizie logarytmicznej. (C) Zgodność między niezależnymi analizami powtarzalności podczas oceny powtarzalności. (D) Stabilność pomiarów MRD po przechowywaniu w temperaturze pokojowej przez 0 godzin, 24 godziny i 48 godzin. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Aby ocenić zachowanie wykrywania na niskim poziomie, przeanalizowano 12 eksperymentów seryjnego rozcieńczania, obejmujących łącznie 72 obserwacje, w oczekiwanym zakresie niskich wartości MRD. Obserwowane wartości MRD wykazały silną zgodność z wartościami oczekiwanymi w analizie logarytmicznej (r = 0,999, skorygowana R² = 0,998, nachylenie = 1,009, przechwytywanie = 0,018), wskazując na zachowanie liniowości w zakresach niskiej częstotliwości zdarzeń.

Testowanie krótkotrwałej stabilności wykazało stopniowe zmniejszenie żywotności próbek w czasie, z medianowymi wartościami żywotności zmniejszającymi się z 89,1% po 0 godzinach do 84,9% po 24 godzinach i 80,6% po 48 godzinach. W porównaniu z tym, mediana bezwzględnej zmiany względnej w obciążeniu MRD pozostawała ograniczona po 24 godzinach (6,2%) i 48 godzinach (12,0%), co wspiera rutynowe przetwarzanie w ciągu 24 godzin po pobraniu.

Powtarzalność między operatorami i urządzeniami

Powtarzalność między operatorami i urządzeniami oceniono przy użyciu 24 próbek referencyjnych analizowanych przez wielu operatorów i zharmonizowanych cytometrów przepływowych, generując łącznie 96 ocenień. Mediana bezwzględna odchyłka

Dyskusja

Głównym celem niniejszej pracy było ustalenie znormalizowanego przepływu pracy dla wielobarwnej cytometrii przepływowej oceny choroby resztkowej (MRD) w ostrej białaczce. Niezawodna ocena MRD zależy nie tylko od wyboru panelu przeciwciał, ale również od spójnego postępowania z próbkami, parametrów nabywania i interpretacji danych¹¹. Wyniki tej pracy wykazują, że zharmonizowane przetwarzanie próbek, kontrolowana głębokość nabywania i kryteria raportowania dostosowane do mianownika mogą poprawić reprodukcyjność analityczną w rutynowych warunkach laboratorium klinicznego. Te wyniki są zgodne z ostatnimi wysiłkami na rzecz standaryzacji oceny MRD cytometrią przepływową w różnych instytucjach i u różnych operatorów¹².

Ważnym elementem tego przepływu pracy jest procedura lizy masowych czerwonych krwinek oparta na chlorku amonu. Wykrywanie rzadkich zdarzeń MRD wymaga nabywania dużej liczby komórek do osiągnięcia odpowiedniej wrażliwości analitycznej. Znormalizowana przygotka do lizy masowej umożliwiła spójne odzyskiwanie wystarczającej liczby komórek jądrzastych, często przekraczającej 1,0–1,5 miliona zarejestrowanych zdarzeń, przy zachowaniu akceptowalnej żywotności próbek. Poprzednie badania z Konsorcjum EuroFlow w podobny sposób podkreślały, że wysokie nabywanie zdarzeń jest niezbędne do wsparcia wrażliwej i powtarzalnej detekcji MRD¹³. W przypadku próbek o nieodpowiedniej wrażliwości analitycznej, procedura rozwiązywania problemów powinna obejmować ocenę objętości próbki, odzyskiwania komórek i głębokości nabywania.

Ten protokół obejmuje również rutynową ocenę hemodilucji przed interpretacją wyników MRD-negatywnych na niskim poziomie. Hemodilucja pozostaje głównym ograniczeniem przedanalizycznym w badaniach MRD opartych na szpiku kostnym, ponieważ zanieczyszczenie krwią obwodową może sztucznie zmniejszyć pozorną obciążenie białaczkowe. Włączenie półilościowej oceny hemodilucji bezpośrednio do przepływu raportowania zapewnia dodatkową ochronę przed błędną interpretacją jako fałszywie negatywną. Poprzednie badania wykazały, że hemodilucja znacząco wpływa na niezawodność cytometrii przepływowej MRD w ostrych białaczkach szpikowych⁷. Próbki wykazujące znaczną hemodilucję (≤0,40) powinny zatem być interpretowane ostrożnie, szczególnie gdy głębokość nabywania lub zachowanie prekursorów szpikowych jest nieodpowiednia.

Przeprowadzone w tej pracy ortogonalne porównanie wykazało silną ogólną zgodność między metodami oceny MRD cytometrią przepływową a metodami molekularnymi. Jednakże niespójne przypadki podkreślają również, że cytometria przepływowa i badania molekularne oceniają różne biologiczne aspekty choroby resztkowej. Poprzednie badania wykazały, że zmiany fenotypowe, ewolucja klonalna i regeneracyjna hematopoeza mogą przyczyniać się do rozbieżności między platformami analitycznymi¹⁴. W B-ALL, rozróżnienie pozostałych prekursorów białaczki od normalnych hematogonów pozostaje szczególnie trudne przy niskim obciążeniu chorobowym i wymaga zintegrowanej interpretacji wielowymiarowych wzorców immunofenotypowych, a nie izolowanych nieprawidłowości antygenowych¹⁵. Z tego powodu wszystkie przypadki graniczne i o niskim poziomie MRD w tym przepływie były niezależnie przeglądane przez drugiego analityka.

Niniejsza praca ma kilka ograniczeń. Po pierwsze, walidacja została przeprowadzona w jednym centrum przy użyciu ograniczonej liczby zharmonizowanych instrumentów. Po drugie, próbki krwi obwodowej były uwzględnione tylko w wybranych sytuacjach klinicznych, ponieważ nie mogą zastąpić szpiku w rutynowej ocenie MRD po leczeniu w większości przypadków ostrej białaczki. Ponadto niektóre parametry analityczne, w tym ocena hemodilucji i interpretacja zdarzeń na niskim poziomie, nadal wymagają przeglądu przez doświadczonego operatora, mimo znormalizowanego przepływu pracy. Niemniej jednak, protokół zapewnia praktyczny rama dla rutynowego wdrożenia w praktyce klinicznej znormalizowanej oceny MRD cytometrią przepływową wielobarwną^16,17. Integrując ocenę jakości przedanalizycznej, zharmonizowane strategie nabywania i kryteria interpretacji dostosowane do mianownika, ten przepływ pracy wspiera bardziej powtarzalne i klinicznie spójne raportowanie MRD w rutynowej praktyce laboratoryjnej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Bufor akwizycji	Przygotowane w laboratorium	PBS zawierające 0,5% BSA i 2 mM EDTA; końcowa objętość resuspendencji 500 µL	Ostatnia resuspendencja przed akwizycją cytometrią przepływową
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD117-APC	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Wczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD13-FITC	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Kotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD33-PE	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Kotwica linii mieloidowej
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Marker niedojrzałości
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD45-APC-H7	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Marker szkieletu leukocytów i definicja mianownika
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD56-V500	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: NCAM16.2; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Fenotypowanie aberracyjnych blastów
AML Rurka 1 przeciwciało anty-CD7-V450	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: M-T701; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Wykrywanie aberracji międzyliniowych
AML Rurka 1 przeciwciało anty-HLA-DR-PE-Cy7	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: G46-6; fluorochrom: PE-Cy7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Dyskryminacja dojrzewania i podtypów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD117-APC	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 104D2; fluorochrom: APC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Wczesne zidentyfikowanie mieloidów/blastów
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD11b-V450	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: ICRF44; fluorochrom: V450; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Ocenianie niespójności dojrzewania
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD13-FITC	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: L138; fluorochrom: FITC; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Kotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD15-V500	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: HI98; fluorochrom: V500; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Ocenianie wzorca mieloidowego różnego od normalnego
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD33-PE	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: P67.6; fluorochrom: PE; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Kotwica linii mieloidowej
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD34-PerCP-Cy5.5	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 8G12; fluorochrom: PerCP-Cy5.5; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytulacja przeciwciała jest różna	Marker niedojrzałości
AML Rurka 2 przeciwciało anty-CD45-APC-H7	BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ, USA) / Beckman Coulter (Brea, CA, USA)	Klon: 2D1; fluorochrom: APC-H7; objętość barwienia: 5 µL/test w rutynowym walidowanym panelu, chyba że tytula