Skuteczny protokół hodowania i mikroiniekcji do modyfikacji genetycznej muchy stajniowej, Stomoxys calcitrans

Podsumowanie

Ten protokół opisuje niezawodną metodę mikroiniekcji embrionalnej do integracji obcego materiału genetycznego z genomem muchy, fluorescujący system przesiewowy do monitorowania rozwoju embrionalnego po iniekcji oraz podłoże do wychowu larw składające się z agaru z żółtkiem jaja wzbogaconego węglem aktywowanym, zaszczepione Escherichia coli, które wspiera rozwój od jaja do osobnika dorosłego.

Streszczenie

Muchy domowe są pasożytami żywiącymi się krwią bydła, zwierząt towarzyszących i ludzi, i występują na wszystkich kontynentach z wyjątkiem Antarktydy. Bolesne ukąszenia dorosłych samców i samic powodują zachowania związane ze stresem u zwierząt gospodarskich, prowadząc do utraty masy ciała i znacznych strat ekonomicznych dla producentów. Zarówno samce, jak i samice much domowych są obligatoryjnymi żywicielami krwi, co stanowi wyzwanie dla sterylnej techniki owadów i innych strategii zarządzania szkodnikami, które wymagają masowego uwolnienia samców. Obecne strategie zarządzania szkodnikami much domowych często nie pozwalają na odpowiednie kontrolowanie populacji much. Chociaż opracowano liczne metody manipulacji genetycznej wprowadzającej egzogenne materiały genetyczne lub indukujące wyłączenie genów dla komarów, Drosophila i innych modelowych grup owadów, metody genetycznej transformacji much domowych są nadal ograniczone. Ten protokół opisuje niezawodne i ulepszone podejście do wprowadzania obcego materiału genetycznego do much domowych przy użyciu hiperaktywnej warianty transpozytazy piggyBac i nowego stałego podłoża do hodowli larw, które wspiera odzyskiwanie larw, wylęganie, karmienie i fluorescencyjne przesiewanie po mikroiniekcji embrionalnej.

Wprowadzenie

Mucha stajniowa (Stomoxys calcitrans L., 1758) to ekonomicznie istotne szkodniki i wektory chorób zwierząt hodowlanianych^1,2,3i mają rozmieszczenie kosmopolityczne na całym świecie. Strategie zintegrowanego zarządzania szkodnikami (IPM) często nie udało się odpowiednio kontrolować populacji much stajniowych^2,3, co skutkuje roczną stratą szacowaną na ponad 2 miliardy dolarów w Stanach Zjednoczonych³. Ponadto, oporność na środki owadobójcze została udokumentowana w populacjach much stajniowych w Europie^4,5 i została również zgłoszona w Stanach Zjednoczonych⁶. W konsekwencji, podejścia do kontroli genetycznej, takie jak sterylna technika owadów (SIT) i systemy gene drive, stanowią pożądane uzupełnienie tradycyjnych programów IPM.

Poprzednie wysiłki na rzecz opracowania metod kontroli genetycznej u much stajniowych, w tym generowanie genetycznych szczepów płciowych dla SIT, opierały się na hodowli selektywnej i translokacji indukowanej promieniowaniem^7,8. Te podejścia są intensywne pod względem pracy i ograniczone do modyfikacji nietransgennych. Następnie, O'Brochta et al.⁹ wykazali, że zastosowanie systemu transpoazy Hermes było w stanie zintegrować transgeny do S. calcitrans; jednak, protokół przyniósł niską efektywność transformacji, z około 0,11% wstrzykniętych zarodków produkujących transgeniczne potomstwo, i wytwarzał słabe wyrażenie markera wzmocnionego zielonego białka fluorescencyjnego (eGFP) pod kontrolą egzogennego promotora⁹.

Inne podejścia do manipulacji genetycznej, w tym systemy CRISPR-Cas, nie zostały jeszcze szeroko zastosowane u much stajniowych, częściowo z powodu trudności w przeniknięciu odpornego chorionu zarodków much stajniowych. Twardy zewnętrzny chorion jest porównywalny z chorionem innych much muscid^10,11. Próby wstrzyknięcia przez chorion za pomocą igł kwarcowych lub usunięcia chorionu za pomocą dwustronnej taśmy klejącej nie powiodły się, co wymagało zastosowania leczenia roztworem utleniającym (3% hipochloryt sodu, NaOCl), co obniża współczynnik wylęgu jaj.

Muchy stajniowe mogą być utrzymywane długoterminowo w warunkach laboratoryjnych, a niedojrzałe stadia są zwykle hodowane w fermentowanych podłożach celulozowych, takich jak wiórki drewniane, otręby pszeniczne lub słoma uzupełnione źródłami azotu, w tym suplementami z białka cielęcego lub płatkami rybnymi¹². Jednak te podłoża mają kilka wad, gdy są używane do wychowywania zarodków wstrzykiwanych mikro. Ich nieprzezroczystość i wysokie autofluorescencja utrudniają identyfikację larw GFP-dodatnich po wylęgu i zakopywaniu się w podłożu. Ponadto, choć pewien obecność bakterii jest wymagana dla przeżycia larw¹³, fermentowane media wprowadzają nieprzewidywalne społeczności bakterii i grzybów, które mogą uszkodzić lub zjeść zarodki przed wylęgiem. Te ograniczenia uniemożliwiły odzyskanie transformowanych larw przy użyciu wcześniej opisanych metod wstrzykiwania i wychowu⁹, co podkreśla potrzebę bardziej niezawodnego protokołu wstrzykiwania, który również umożliwia fluorescijne przesiewanie przez cały okres rozwoju.

Przedstawiony tutaj jest powtarzalny protokół mikroiniekcji, który uwzględnia ulepszenia w selekcji transpoazy, metodologii wstrzykiwania oraz mediów do przesiewania i hodowli. Te modyfikacje ułatwiają rozwój genetycznie zmodyfikowanych much stajniowych do zastosowań, w tym genetyczne szczepy płciowe dla SIT, gene drive i nokautów genów pośredniczych przez CRISPR-Cas. Kluczowe ulepszenia obejmują zastosowanie hiperaktywnej transpoazy piggyBac¹⁴ pod kontrolą promotora białka skurczowego muchy stajniowej (hsp)83, suszenie zarodków, aby zminimalizować utratę ooplazmy po wstrzyknięciu oraz eliminację taśmy klejącej i oleju halokarbonowego podczas wstrzykiwania zarodków.

Odzyskanie wstrzykniętych zarodków został jeszcze bardziej ulepszony poprzez zastąpienie podstawowego podłoża hodowlanego płaskimi, barwionymi płytkami agar z pożywką odżywczą zaszczepionymi warstwą Escherichia coli. Ta formuła agaru zapewnia dwie główne zalety. Po pierwsze, dostarcza przewidywalnego monogenicznego źródła pokarmu bakterii dla rozwoju larw. Po drugie, zapewnia kontrastowe, nisko autofluorescencyjne tło, które ułatwia obserwację morfologii, rozwoju i ekspresji GFP w larw pierwszego pokolenia (G0). Muchy domowe i stajniowe normalnie rozwijają się i przepoczwarczają na agarowych płytkach z żółtka jaja zaszczepionych E. coli^13,15. Opisana tutaj formuła zawiera aktywowany proszek węglowy jako niereaktywny, bezpieczny dla żyw

Protokół

Wszystkie eksperymenty i operacje przeprowadzono za zgodą Instytucjonalnego Komitetu Biobezpieczeństwa Texas A&M (protokół IBC2019-081). Odczynniki, chemikalia i narzędzia wykorzystane w niniejszym protokole wymieniono w Tabeli materiałów.

1. Hodowla much w celu pozyskania jaj

1. Przygotowanie klatek dla osobników dorosłych
   1. Ustawić termostat w komorze inkubacyjnej na 28°C i zmieszać 3 kg chlorku sodu z ok. 5 L wody z kranu w pojemniku o pojemności 10 L, rozpuszczając ok. 50% soli.
   2. Umieścić ten nieprzykryty pojemnik z solanką na dnie komory inkubacyjnej, aby utrzymać wilgotność na poziomie około 80% RH. W komorze lub pomieszczeniu zachować cykl dobowy 16:8 (dzień-noc).
   3. Wyłożyć dno klatek dla owadów (stalowe/aluminiowe klatki o wymiarach 30 x 30 x 30 cm z siatką) dwiema warstwami ręczników papierowych i postawić na nich jednorazowy kubeczek do przypraw o pojemności 45 mL wypełniony granulowanym cukrem spożywczym (Rysunek 1A).
      UWAGA: Ręczniki papierowe pomagają absorbować odchody much, a cukier stanowi źródło pożywienia przed karmieniem krwią.
   4. Napełnić zlew Griffin o pojemności 250 mL około 100 mL wody z kranu w temperaturze pokojowej i włożyć do wody kwadrat czarnej bawełnianej tkaniny o wymiarach 20 cm x 20 cm (wycięty z gładkiej czarnej poszewki na poduszkę lub prześcieradła), aż tkanina zostanie zwilżona. Ułożyć czarną tkaninę tak, aby jej krawędzie wystawały 1-2 cm poza rant zlewka (Rysunek 1B).
      UWAGA: Ta wilgotna szmatka zapewnia zarówno wodę w postaci ciekłej, jak i powierzchnię do składania jaj dla dorosłych much. Śmierć osobników dorosłych może nastąpić szybko, jeśli nie będą one miały dostępu do źródła wilgoci.
   5. Przenieść 500-1500 poczwarek muchy rogatki do małej szalki lub zlewka i umieścić je w klatce dla owadów. Umieścić klatkę w wilgotnej komorze hodowlanej (krok 1.1.1) i codziennie monitorować proces wykluwania. Po pojawieniu się osobników dorosłych rozpocząć codzienne karmienie cytrynianą krwią bydlęcą (sekcja 1.2.).
2. Karmienie dorosłych much
   1. Przygotować cytrynianową krew bydlęcą, dodając do świeżo pobranej krwi bydlęcej cytrynian trysodowy dwuwodniany do stężenia końcowego 10,9 mM.
   2. W skrócie: zawiesić ok. 12,8 grama soli cytrynianowej w minimalnej objętości wody dejonizowanej i dodać do 4 litrów krwi pobranej w lokalnej rzeźni.
      UWAGA: Pojemniki na krew powinny mieć zakrętki (np. kwadratowe butelki z szeroką szyjką o pojemności 4 L) i być dokładnie czyszczone ciepłą wodą z mydłem przed użyciem. W rzeźni należy unikać pobierania pierwszego ok. 1 litra krwi bydlęcej z ubojonego zwierzęcia, aby zminimalizować zanieczyszczenie włosami, potem, brudem i innymi koagulantami.
   3. Zamrozić cytrynianową krew bydlęcą w alikwotach po 200 mL i rozmrażać w razie potrzeby, przechowując rozmrożone alikwoty w lodówce w temperaturze 4°C przez maksymalnie tydzień.
   4. Podawać ok. 40 mL krwi w temperaturze pokojowej na 600 much do każdej klatki z osobnikami dorosłymi.
   5. Krew można podawać w pojemniku na przyprawy lub zlewku; do naczynia należy włożyć złożony, niesterylny bawełniany gazik, który będzie służył jako knot do podciągania krwi. Agitować knot, aż bawełna zostanie w pełni nasycona, a następnie włożyć go do klatki.
      UWAGA: Krew należy wymieniać codziennie, zaczynając od 24 godzin po wykluciu.
3. Zbiór jaj
   1. Po zaobserwowaniu jaj na czarnej bawełnianej tkaninie, wyjąć tkaninę ze zlewka i wypłukać jaja do osobnego, płytkiego plastikowego pojemnika o pojemności ok. 700 mL za pomocą butelki myjącej (Rysunek 2A). Składanie jaj zazwyczaj następuje, gdy muchy mają 7-10 dni.
      UWAGA: Należy również sprawdzić kubeczki z krwią i zebrać wszelkie pojedyncze jaja, które mogły zostać tam złożone.
   2. Zebrać jaja na papierze filtracyjnym poprzez filtrację próżniową. Wykonuje się to poprzez umieszczenie czarnego papieru filtracyjnego w lejku Buchnera, zastosowanie próżni, a następnie wlanie jaj z kroku 1.3.1. na tak przygotowany zestaw.
   3. Następnie przenieść jaja do cylindra miarowego lub graduowanej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,7 mL za pomocą butelki myjącej i zapisać objętość zebranych jaj (Rysunek 2B).
      UWAGA: Należy unikać długotrwałego zanurzenia jaj w wodzie, ponieważ śmiertelność zaczyna wzrastać ok. 10 minut po zanurzeniu.
4. Przygotowanie masowej pożywki dla larw
   1. Zebrać materiały do masowej pożywki dla larw (Rysunek 3A), zgodnie z opisem w Tabeli 1.
   2. Do zlewka o pojemności 1000 mL dodać suplement białkowy z cielęcia i całą wodę z kranu. Pozostawić do rehydratacji przez noc w temperaturze pokojowej.
   3. Dodać otręby pszenne i wermikulit do osobnego, większego pojemnika do mieszania.
   4. Po nocnej rehydratacji dokładnie wymieszać zrehydratowany suplement z cielęcia, aby rozbić grudki, a następnie przelać mieszaninę do pojemnika z otrębami pszennymi i wermikulitem. Mieszać dokładnie aż do uzyskania homogennej masy i pokrycia wszystkich otrębów pszennych zawiesiną suplementu z cielęcia.
   5. Przenieść masową pożywkę do polipropylenowego pojemnika do przechowywania żywności w warstwie o głębokości ok. 8 cm, pokrywającej całe dno pojemnika (Rysunek 3B).
   6. Dodać ok. 1000 embrionów (około 0,2 mL jaj na 2,2 L masowej pożywki), zbierając embriony poprzez filtrację próżniową na okrągłym papierze filtracyjnym o średnicy 90 mm, a następnie kładąc papier filtracyjny z jajami stroną skierowaną w dół na środku pojemnika z pożywką (Rysunek 3B, C).
   7. Przykryć papier filtracyjny warstwą pożywki o grubości ok. 1 cm w celu zatrzymania wilgoci (Rysunek 3C), a następnie przykryć pojemnik dużym prostokątem czarnej bawełnianej tkaniny, tak aby 5 cm tkaniny zwisało poza krawędź pojemnika.
   8. Wyciąć duży otwór (ok. 12 cm średnicy) w pokrywce pojemnika na żywność, aby umożliwić wymianę gazową, i zatrzasnąć pokrywkę na pojemniku z pożywką, więżąc czarną bawełnianą tkaninę pomiędzy pojemnikiem a pokrywką (Rysunek 3D).
      UWAGA: Służy to jako uszczelka, zapobiegając uwięzieniu larw pierwszego stadium (1^st instar) w kroplach kondensatu w szczelinie między pokrywką a pojemnikiem.
   9. Umieścić gotowy pojemnik z pożywką w komorze hodowlanej dla osobników dorosłych aż do przepoczwarzenia i monitorować rozwój larw (Rysunek 4) (przepoczwarzenie następuje w ciągu ok. 10 dni, w zależności od temperatury pożywki i gęstości larw).
      UWAGA: Przykrycie z tkaniny powinno być na tyle gęste, aby zapobiec przechodzeniu larw pierwszego stadium, ale na tyle przepuszczalne, aby zapobiec tworzeniu się kondensacji na wewnętrznych ściankach pojemników z pożywką, co mogłoby uwięzić i utopić larwy.
5. Separacja poczwarek
   1. Zdjąć tkaninę z pojemników z poczwarkami i zebrać poczwarki za pomocą łyżki lub chochli.
      UWAGA: Poczwarki muchy rogatki wyglądają jak nieruchome, czerwono-brązowe cylindry o długości 4-7 mm, w przeciwieństwie do ruchliwych, żółto-białych larw. Poczwarki zazwyczaj gromadzą się na zewnętrznym obwodzie ścianek pojemnika lub w wilgotnych, wyniesionych miejscach w pojemniku z pożywką, gdy muchy rozpoczynają metamorfozę z larw w poczwarki, a następnie w osobniki dorosłe.
   2. Ułożyć 500-1500 poczwarek warstwą o grubości ok. 1 cm na szalce i umieścić w nowej czystej klatce, zgodnie z opisem w sekcji 1.1, aby rozmnożyć następne pokolenie.

Rysunek 1: Materiały do hodowli dorosłych much. (A) Klatka do hodowli dorosłych much z widocznym kubkiem z sacharozą (S) i kubkiem do składania jaj (O). (B) Kubek do składania jaj przygotowany z nasyconą wodą czarną tkaniną bawełnianą, wystającą nieco poza krawędź zlewki. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Zbieranie jaj. (A) Zbieranie jaj z tkaniny do składania jaj za pomocą butelki myjącej. (B) Odzyskiwanie jaj poprzez filtrację próżniową na papierze filtrującym o wysokim kontraście. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Materiały do przygotowania masowej pożywki dla larw
Odczynnik	Masa (g)
Woda	900
otręby pszenne	230
Suplement dla cieląt	100
Wermikulit (A4 gruby)	70
Materiały do roztworów do usuwania błony chorionowej
Roztwór	Skład
Kąpiel utleniająca	3% podchloryn sodu w wodzie dejonizowanej
Kąpiel płucząca	Roztwór Triton X-100 0,02% w wodzie dejonizowanej
Płukanie	Woda dejonizowana
Materiały do czarnych szalek agarowych do przesiewania i hodowli
Odczynnik	Masa (g)
Woda	500
Żółtka jaj w proszku	18
Węgiel aktywny	4
Chlorek sodu	1

Tabela 1: Odczynniki do seryjnego przygotowania pośrodka dla larw, roztworów do dechorionizacji oraz czarnych szalek agarowych. Odczynniki użyte do seryjnego przygotowania pośrodka dla larw do utrzymania kolonii, a także skład roztworów służących do osłabiania i usuwania chorionu z embrionów muchy stajennej oraz materiały niezbędne do przygotowania 500 mL czarnego pośrodka agarowego do przesiewania i hodowli.

Rysunek 3: Przygotowanie masowej pożywki dla larw. (A) Materiały użyte do przygotowania masowej pożywki dla larw: suplement białka cielęcego (CM), otręby pszenne (WB), wermikulit (VM), pojemnik do przechowywania (SC), pokrywka (L) i uszczelka z tkaniny (FG). (B) Dokładne wymieszanie składników pożywki. (C) Umieszczenie papieru filtrującego z jajami (EP) stroną skierowaną w dół na powierzchni pożywki i przykrycie dodatkową warstwą pożywki w celu zapobiegania wysychaniu. (D) Montaż uszczelki z tkaniny bawełnianej pomiędzy pojemnikiem a pokrywką. Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Rysunek 4: Rozwój larew w podłożu masowym. Przezroczyste pojemniki umożliwiają monitorowanie rozwoju larew i stanu podłoża. Larwy (L) są widoczne na ściankach pojemnika, pokrywce oraz wewnątrz podłoża. Prosimy kliknąć tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

2. Przygotowanie do wstrzykiwania: usuwanie otoczki chorionowej i wysuszanie

1. Umieścić zwilżoną czarną bawełnianą szmatkę w zlewce, zgodnie z opisem w kroku 1.1.4., a następnie przenieść ją do klatki z osobnikami dorosłymi na 25 min w celu zebrania jaj. Opłukać jaja na sito ze stali nierdzewnej o oczkach 106 µm, używając butelki myjnej.
   UWAGA: 25-minutowy okres zbierania zazwyczaj pozwala uzyskać około 400 jaj.
2. Pozostawić embriony w spokoju na sicie przez kolejne 30 min.
3. Podczas dojrzewania embrionów przygotować po 150 mL roztworu utleniającego, płuczącego i płuczącego końcowego, opisanych w sekcji „Materials for De-chorionation Solutions” w Tabeli 1 (Rycina 5). Należy użyć objętości wystarczającej do przykrycia embrionów warstwą roztworu o grubości około 1 cm.
4. Zanurzyć sito z embrionami w kąpieli utleniającej na 2 min i delikatnie mieszać embriony za pomocą pipety Pasteura (Rycina 6A).
   UWAGA: Powtarzalne odsysanie i dozowanie roztworu w celu wytworzenia wiru pomaga skoncentrować embriony w centrum sita i zapobiega przywieraniu świeżo odchorionowanych embrionów do ścianek sita.
5. Wyjąć sito z kąpieli utleniającej i odsączyć nadmiar roztworu. Przenieść sito do roztworu płuczącego i mieszać poprzez odsysanie i dozowanie przez 2 min.
6. Przenieść sito z embrionami do roztworu płuczącego końcowego i mieszać zgodnie z opisem w kroku 2.4. przez 2 min. Wyjąć sito z roztworu płuczącego i odsączyć nadmiar wody.
7. Położyć sterylną szkiełkę nakrywkową na sicie i, korzystając z mikroskopu sekcyjnego, za pomocą cienkiego nylonowego pędzelka przenieść embriony (Rycina 6B) z sita na krawędź szkiełka. Rozmieścić embriony blisko siebie, tak aby się nie stykały, z szerszym biegunem tylnym skierowanym ku krawędzi szkiełka. Unikać zginania, deformowania lub rozrywania embrionów podczas przenoszenia.
8. Przygotować komorę suszącą, pokrywając dno kolby o pojemności 1 L 100 mL osuszacza w postaci siarczanu wapnia i zamykając kolbę gumowym korkiem.
   UWAGA: Po 24 h wyrównywania, komora susząca zazwyczaj osiąga wilgotność względną <5% w temperaturze 23 °C.
9. Usunąć nadmiar wody ze szkiełka i położyć szkiełko z odchorionowanymi embrionami na osuszaczu. Ponownie zamknąć kolbę gumowym korkiem i suszyć embriony przez 8 min.
10. Wyjąć szkiełko z komory suszącej i umieścić je na stoliku mikroskopu pod obiektywem 20× w celu wykonania mikroiniekcji.

Rycina 5: Roztwory do dechoriacji. Od lewej do prawej: sito ze stali nierdzewnej, roztwór utleniający, roztwór piorący oraz roztwór płuczący stosowane do dechoriacji zarodków. Podchloran sodu jest przechowywany jako 6% roztwór stokowy chroniony przed światłem, a Triton X-100 jako 10× roztwór stokowy i rozcieczany do stężenia końcowego 0,02% przed użyciem. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Rycina 6: Dechorionacja zarodka. (A) Delikatne zasysanie i wydmuchiwanie roztworu generuje wir, który koncentruje zarodki w centrum sita i zmniejsza ich przyleganie do ścianek sita. (B) Zdechorionowany zarodek wydostający się z półprzezroczystego chorionu po płukaniu. Biegun przedni (węższy koniec) zazwyczaj wydostaje się przed biegun tylny. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

3. Mikrowstrzykiwanie

1. Wytnij kwarcowe igły do mikroiniekcji z kapilar szklanych o długości 100 mm (średnica wewnętrzna 0,7 mm, średnica zewnętrzna 1,0 mm), stosując parametry wymienione w Tabeli 2. Przechowuj igły w miejscu wolnym od kurzu do momentu użycia.
   UWAGA: Można również stosować igły borokrzemowe o podobnej geometrii.
2. Przygotuj bufor do iniekcji (0,1% w/v czerwieni fenolowej w soli fizjologicznej z buforem fosforanowym (PBS), pH 7,4) i wysterylizuj go poprzez filtrowanie za pomocą filtra strzykawkowego 0,22 µm.
3. Przygotuj 20 µL mieszaniny do iniekcji, łącząc po 10 µg plazmidu pomocniczego piggyBac oraz plazmidu donora, który zawiera ładunek genetyczny pomiędzy lewą i prawą odwróconą powtórką końcową piggyBac, z 4 µL buforu do iniekcji. Rozcieńcz do końcowego stężenia 500 ng/µL, używając wody wolnej od nukleaz.
   UWAGA: Plazmid pomocniczy obejmuje 3,1 kb sekwencję promotora hsp83 powyżej kodonu startowego hsp83 oraz kodującą sekwencję hiperaktywnej transpozazy piggyBac.
4. Przenieś mieszaninę do iniekcji do filtra PTFE 0,20 µm o małej objętości i umieść filtr w otworze probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,5 mL (Rysunek 7A). Wirować z prędkością ≥11 000 x g przez 10 minut lub do momentu, aż cała mieszanina do iniekcji przejdzie przez filtr. Niewykorzystaną mieszaninę do iniekcji przechowywać w temperaturze -20 °C.
5. Wypełnij igłę do mikroiniekcji od tyłu około 2 µL mieszaniny do iniekcji, używając mikropipety do nakładania żelu (Rysunek 7B). Unikaj wprowadzania pęcherzyków powietrza podczas napełniania.
   UWAGA: Ustaw igłę do mikroiniekcji równolegle do długiej osi embrionu i utrzymuj zerowe przesunięcie kątowe w płaszczyźnie poziomej i pionowej, aby zminimalizować rozdzieranie i ścinanie.
6. Delikatnie uderzaj końcówką igły o krawędź szkiełka przedmiotowego, aż mieszanina do iniekcji zacznie wypływać z końcówki igły (Rysunek 7C).
   UWAGA: Odłamuj końcówkę igły stopniowo, aby uzyskać najmniejszy i najostrzejszy otwór, który nadal umożliwia przepływ mieszaniny do iniekcji.
7. Wykonaj iniekcję embrionu przez biegun tylny natychmiast po wysuszeniu, stosując ciśnienie iniekcji około 700 hPa i ciśnienie wsteczne 300 hPa.
8. Delikatnie przebij embrion i wstrzyknij około jednej dziesiątej objętości embrionu mieszaniny do iniekcji (Rysunek 7D–F).
   UWAGA: Ogranicz penetrację igły do minimum, aby zredukować naruszenie błony witelinowej i zapobiec utracie ooplazmy podczas wycofywania igły.
9. Natychmiast po iniekcji przenieś szkiełko przykrywowe do szalki Petriego wyłożonej sterylnym, zwilżonym czarnym papierem filtracyjnym o średnicy 90 mm i inkubuj w temperaturze pokojowej przez 48 h.
   UWAGA: Wszystkie iniekcje należy przeprowadzić w ciągu 2 h od złożenia jaj, aby celować w embriony przed stadium syncytialnym.
10. Co 12–16 h sprawdzaj, czy embriony się wykluły. Przenieś nowo wyklute larwy oraz szkiełko przykrywowe na zaszczepioną i kondycjonowaną płytkę z agarem, przygotowaną zgodnie z opisem w sekcji 4.

Parametr	Ciepło	Filtr	Vel	Usuń	Pociągnij
Wartość	825	5	60	150	175

Tabela 2: Parametry wyciągania igieł. Parametry użyte do wytworzenia kwarcowych igieł do mikroiniekcji.

Rysunek 7: Mikroiniekcja embrionu. (A) Filtracja mieszaniny do iniekcji przy użyciu filtra strzykawkowego umieszczonego w probówce do mikrocentrifugowania o pojemności 0,5 mL. (B) Napełnianie igły do mikroiniekcji przefiltrowaną mieszaniną za pomocą końcówki pipety do nakładania żelu. (C) Geometria końcówki kwarcowej igły do mikroiniekcji. (D) Ustawienie igły względem bieguna tylnego embrionu. (E) Przebicie powierzchni embrionu przy minimalnym zaburzeniu błony witelińskiej. (F) Wstrzyknięcie około jednej dziesiątej objętości embrionu, a następnie wycofanie igły. Zwiększona przejrzystość wskazuje na przemieszczenie ooplazmy przez mieszaninę iniekcyjną. Pasek skali = 400 µm (D–F) Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

4. Przygotowanie płytek poddanych działaniu preparatów

1. Przygotowanie pożywki agarowej
   1. Przygotować pożywkę opisaną w sekcji „Materials for Black Agar Screening and Rearing Plates” w Tabeli 1 i wysterylizować w autoklawie przez 15 min w temperaturze 121 °C. Rozlać agar w temperaturze 40 °C lub przechowywać go w temperaturze pokojowej przed ponownym podgrzaniem i rozlaniem do szalek Petri o średnicy 90 mm.
      UWAGA: Przed rozlaniem energicznie zamieszać, aby resuspenderować stałe cząstki.
2. Inokulacja szalek
   1. 24-godzinną kulturę Escherichia coli szczepu K12 rozcieńczyć w bulionie Luria-Bertani do OD600 = 0.200 i nanieść 200 µL na schłodzoną, zestaloną płytkę agarową. Równomiernie rozprowadzić kulturę za pomocą sterylnych szklanych kulek lub rozprowadzacza szklanego i pozwolić płytce wchłonąć nadmiar wilgoci (Rycina 8A, B).
      UWAGA: Używać płytek agarowych w ciągu 1 miesiąca od rozlania lub je utylizować, aby zapewnić niezawodny wzrost bakterii i larw.
3. Kondycjonowanie szalek
   1. Złożyć kawałki czarnego papieru filtracyjnego o wymiarach 6 × 6 cm, tworząc 6-10 karbowanych grzbietów, a następnie wysterylizować poprzez wypalanie lub autoklawowanie. Aseptycznie umieścić jeden sterylny karbowany papier filtracyjny na zaszczepionej szalce Petri i nawilżyć go kilkoma kroplami sterylnej wody (Rycina 8C).
   2. Przeprowadzić sterylizację powierzchniową niepoddanych obróbce i nieiniekcyjnych larw pierwszego stadium (WT) i przenieść 10 larw na nawilżony papier filtracyjny.
      UWAGA: Sterylizować embriony WT poprzez zanurzenie ich w 10% wybielaczu (0.6% NaOCl) przez 1 min, a następnie płukanie w sterylnej wodzie dejonizowanej przez 2 min.
   3. Umieścić papier filtracyjny o średnicy 90 mm pomiędzy pokrywką a dnem szalki Petri, aby pełnił rolę uszczelki.
   4. Pozostawić larwy WT do kondycjonowania szalek przez 24 h przed dodaniem iniekcyjnych embrionów na szkiełkach nakrywkowych (Rycina 8C). Usunąć larwy WT po wykluciu się pierwszych iniekcyjnych embrionów.

Rysunek 8: Przygotowanie płytek agarowych i rekonwalescencja po wstrzyknięciu. (A) Inokulacja płytek agarowych kulturą Escherichia coli o OD600 = 0.2 przy użyciu sterylnych szklanych kulek. (B) Absorpcja nadmiaru wilgoci z powierzchni przed transferem zarodków. (C) Umieszczenie 90 mm uszczelki z papieru filtracyjnego pomiędzy pokrywką a korpusem szalki Petriego. (D) Przesiewanie larw pod kątem markerów fluorescencyjnych na kondycjonowanych płytkach agarowych. Wstrzyknięte zarodki są odzyskiwane na nasączonym wodą dejonizowaną 90 mm papierze filtracyjnym umieszczonym w pokrywce odwróconej szalki Petriego i inkubowane przez 48 h przed przeniesieniem na płytki do przesiewania. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Wyniki

Zgodnie z tym protokołem, 431 embrionów muszki octowej zostało poddanych dechorionizacji i wstrzyknięto im plazmid donora piggyBac-Hsp83 oraz plazmid pomocniczy Hsp83 w końcowym stężeniu 500 ng/µL. Z 431 wstrzykniętych embrionów, 18 larw ZsGreen-dodatnich (4,2%) oraz 8 larw ZsGreen-ujemnych (1,9%) wykluło się w czasie od 48 do 76 h po wstrzyknięciu, co stwierdzono podczas przesiewania na czarnych płytkach agarowych z węglem (Tabela 3). Łącznie wykluło się 26 z 431 wstrzykniętych embrionów (6,0%), a 16 z 26 wyklutych larw przeżyło do stadium dorosłego osobnika (61,5%).

Gatunki	Rodzaj iniekcji	Konstrukt	# wstrzyknięty	ZsGreen(+) L1	ZsGreen(-) L1	Poczwarki ZsGreen(+)	poczwarki ZsGreen(-)	Osobniki dorosłe ZsGreen(+)	Dorosłe osobniki ZsGreen(-)	# Osobniki dorosłe dające potomstwo ZsGreen(+)
Stomoxys calcitrans	Insercja transpozazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donora, 500 ng/uL)	226	5	8	5	6	3	6	1
Stomoxys calcitrans	Insercja transpozazy	Hsp83:hy-pBac (pomocniczy, 500 ng/uL) Hsp83: zsGreen (donor, 500 ng/uL)	205	13	0	7	0	7	0	5

Tabela 3: Statystyki wstrzykiwania. Wskaźniki przeżywalności, transformacji i odzysku po mikrowstrzykiwaniu do embrionów.

Z 18 larw G0 wykazujących pozytywny wynik dla ZsGreen, 12 przeżyło do stadium pocieczki (66,7%) i 10 z nich przejło w stadium dorosłe. Sześć osobników dorosłych z pozytywnym wynikiem dla ZsGreen (1,4% wstrzykniętych embrionów, 60% płodnych osobników G0, które przeżyły) dało potomstwo wykazujące pozytywny wynik dla ZsGreen. Potomstwo to (Rycina 9A–E) poddano samozapłodnieniu, a fluorescencja utrzymywała się przez sześć pokoleń w momencie sporządzania tekstu.

Spośród ośmiu larw negatywnych pod względem ZsGreen, sześć przeżyło do stadium dorosłego (75%). Żaden z niefluorescencyjnych osobników dorosłych nie wydał fluorescencyjnego potomstwa.

Rysunek 9: Przesiew fluorescencyjny much transgenicznych. (A) Porównanie larw F1 wykazujących ekspresję ZsGreen z larwami WT. (B) Fluorescencja widoczna przez kutykulę poczekoiny, umożliwiająca przesiew transgeniczny na etapie poczekoiny. (C,D) Porównanie trzech larw i poczekoinek wykazujących ekspresję ZsGreen (po lewej) z trzema larwami i poczekoinkami WT (po prawej) pod oświetleniem światłem białym (C) oraz fluorescencyjnym (D). (E) Dorosła transgeniczna mucha F1 wykazująca ekspresję ZsGreen (po lewej) w porównaniu z dorosłą muchą WT (po prawej). Paski skali = 1 mm (A), 2 mm (B,E) i 3 mm (C,D). Aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku, kliknij tutaj.

Dyskusja

Transformacja genetyczna gatunków owadów niebędących modelami pozostaje główną przeszkodą w rozwoju i ewaluacji strategii kontroli genetycznej dla szkodników i wektorów stawonogów.

W przypadku muchy gniady, opisany tu protokół zmniejsza czas, zasoby, wysiłek i zmienność związaną z wstrzyknięciem i wychowem much G0 po mikroiniekcji zarodków. Ponadto, użycie czarnych płytek agarowych do przesiewania umożliwia bezpośrednią obserwację rozwoju przez cały cykl życia, ułatwiając identyfikację i korekcję problemów, które pojawiają się podczas wstrzykiwania, regeneracji i wychowu larw. Przy użyciu konstrukcji plazmidowych ocenianych w niniejszym badaniu, protokół wygenerował transgeniczne linie much gniady z mniejszą liczbą zastrzykiwanych zarodków niż wcześniej opisane metody⁹. Chociaż poza zakresem tego artykułu, potwierdzenie i zlokalizowanie miejsc wstawienia transgenu można przeprowadzić za pomocą uznanych podejść, takich jak odwrotna PCR i splinkerette PCR.

Skuteczny protokół wstrzykiwania ułatwia również przyszłe badania w dziedzinie genomiki funkcjonalnej, w tym charakteryzację promotorów za pomocą reporterów fluorescencyjnych; kompetencję wektora poprzez analizy odwrotnej genetyki genów związanych z przenoszeniem patogenów; charakteryzację nukleaz, w tym ocenę CRISPR-Cas9 i innych programowalnych nukleaz w muchach gniady; badania nad odpornością na owadobójcze środki chemiczne poprzez modyfikację kandydujących alleli odporności; i badania podstawowej biologii, w tym genów zaangażowanych w pobieranie krwi, kopulacji i rozwoju. Nasz protokół eliminuje również potrzebę zanurzania zarodków w oleju i używania komór wilgotności z utlenianie dla regeneracji zarodków po wstrzyknięciu, jak to jest udokumentowane w poprzedniej literaturze na temat transformacji piggyBac Musca domestica i Lucilia cuprina^16,17.

Kilka parametrów jest kluczowych dla pomyślnej transgenozy. Wysuszanie zarodków i czas wstrzykiwania są szczególnie ważne, ponieważ DNA plazmidowe musi zostać wprowadzone przed komórkowym zorganizowaniem, aby zapewnić włączenie do komórek prekursorowych linii germinalnej. Jednakże, dokładny czas formowania się syncytium w zarodkach muchy gniady pozostaje nieznany. Dodatkowo, tempo rozwoju zarodków jest wpłynięte przez temperaturę, a harmonogram rozwoju zarodków muchy gniady w różnych warunkach środowiskowych nie został w pełni scharakteryzowany. Przyszłe badania nad szybkością rozwoju i embriogenezą laboratorium much gniady mogą dostarczyć wglądu w optymalizację protokołów mikroiniekcji i transformacji, a tym samym dalsze zwiększenie efektywności i powtarzalności protokołu. Jednakże, do momentu osiągnięcia tego, określenie optymalnego okna wstrzykiwania pozostaje ograniczeniem metodologicznym, które może wpłynąć na efektywność transformacji. Kiedy współczynnik przeżywalności jest niski, rozwiązywanie problemów można przeprowadzić poprzez porównanie wskaźników wylęgu i przeżywalności dorosłych much między nieleczonymi zarodkami, zarodkami pozbawionymi skorupy, zarodkami wstrzykniętymi sterylnym w filtrze PBS oraz zarodkami WT wychowanymi na płytkach agarowych. Poprzednia literatura opisująca transformację Musca domestica wykazała 14 zdarzeń integracji z 1668 wstrzyknięć (0,84% wstrzykniętych)¹⁶, a transformacja owada owcy Lucilia cuprina ustanowiła 3 linie transgeniczne z około 900 wstrzyknięć zarodków (0,33% wstrzykniętych)¹⁷, sugerując, że protokół transformacji muchy gniady opisany w tym protokole (6 zdarzeń integracji w 431 wstrzyknięciach, 1,4% wstrzykniętych) oferuje poprawę efektywności wstrzykiwań w porównaniu z innymi gatunkami muchówek z literatury.

Konstytutywny promotor hsp83 muchy gniady zapewniał trwałe wyrażenie ZsGreen na całym etapie rozwoju i wsparł wyrażenie hiperaktywnej transpozytazy piggyBac podczas wczesnej embriogenezy, poprawiając widoczność fluorescującego markera i efektywność transformacji w porównaniu z wcześniej opisanym protokołem transformacji muchy gniady⁹. Plasmida pomocnicza użyta w tym badaniu została wygenerowana przez subklonowanie 3,1 kb DNA genomowego bezpośrednio na początku kodonu startowego hsp83 do minimalnego wektora plazmidowego bezpośrednio przed sekwencją kodującą hiperaktywnej transpozytazy piggyBac. Stosunek pomocniczego plazmidu do plazmidu transportującego został empirycznie ustalony na 1:1 w masie i był stosowany przez całe badanie. Chociaż nie oceniono dodatkowych stosunków plazmidów, alternatywne proporcje mogą również okazać się skuteczne.

Opisane tu poprawki mogą być stosowane do protokołów transgenozy innych stawonogów. Ponadto, agarowy system przesiewania i wychowu jest obecnie stosowany do wstrzykiwania i przesiewania zarodków muchy żołnierz (Hermetia illucens). Protokół może być szczególnie przydatny dla wysiłków transgenozy w innych muscidy, w tym Musca domestica i Haematobia irritans, ze względu na podobną ekologię larw i rozwój w rozkładających się wrzosach włóknistych. Użycie płytek agarowych zaszczepionych Escherichia coli może zapew

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1 L flask with rubber stopper (desiccation chamber)	VWR	214-1134	Komora susząca
Bacto Agar	Difco	281230	Agar do czarnych płytek agarowych
Black pillowcases	Aisawate	3.45496E+11	Czarne bawełniane tkaniny do miseczek do zbierania jaj i uszczelki tkaninowej do wylęgarni larw
Calcium sulfate desiccant	Drierite	21001	Suszarka do komory suszącej
Calf Manna Performance Supplement	Manna Pro	095668940010	Środek masowy dla larw
Compound microscope	Leica Microsystems	DM750M	Mikroskop iniekcyjny
Dried Egg Yolks	Judee’s From Scratch	B098SP2LTV	Źródło składników odżywczych dla czarnych płytek agarowych
E. coli	New England Biolabs	C2987H	Bakteria używana na czarnych płytkach agarowych
Femtojet 4i microinjection pressure supply	Eppendorf	5252000021	Zasilacz ciśnieniowy do mikroiniekcji
Fine-tipped nylon paintbrush	Transon	7.42298E+11	Przenoszenie zarodków
Fire-polished quartz capillaries with filament, OD 1.0 mm, ID 0.70 mm, 10 cm length	World Precision Instruments	QF100-70-10	Kapilary do wyciągania igieł
Forceps	Fine Science tools	11251-20	Obsługa próbek
Full height seive, 3” dia, No. 140 ASTM-E11 Standard test sieve (106 μm)	Cole-Parmer	UX-59987-24	Utrzymywanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Germicidal Ultra Bleach (6% sodium hypochlorite)	Pure Bright	59647-21014	Roztwór wybielający do usuwania chrząstki
GladWare Family Size Food Storage Containers, XL 104 oz	Glad	012587701294	Kontener środka masowego dla larw
Grade 8613, 9cm Black qualitative filter papers	Ahlstrom	8613-0550	Zbieranie zarodków
LB Broth	BD Difco	DF0446-17-3	Bułka LB do hodowania E.coli
M60 zoom stereo dissecting microscope with Leica Ergo Tubes	Leica Microsystems	SP-M60-TS	Mikroskop do przemieszczania i układania zarodków
Microloader tips 0.5-20 uL 100mm	Calibre Scientific	EPE 930001007	Używane do ładowania mieszanki iniekcyjnej do igieł
Micromanipulator	Leica Microsystems	11520137	Mikromanipulator do iniekcji
Millex Syringe Filter, Hydrophilic PTFE, 0.2 μm	MilliporeSigma	SLLGR04NL	Używane do filtrowania mieszanki iniekcyjnej
Nuclease-free water	Corning	46-000-CM	Bufor do iniekcji
Organic coconut activated charcoal powder	Belle Chemical	B073BSNLJ3	Pigment dla czarnych płytek agarowych
P-2000 Laser-based pipette puller	Sutter Instruments	P-2000/G	Urządzenie do wyciągania igieł z kapilar
PBS, pH 7.4	Gibco	10-010-023	Bufor do iniekcji
Petri plates	VWR	391-0609	Petri na czarne płytki agarowe
Phenol red, CAS:143-74-8	Thermo scientific	B21710.09	Barwnik do iniekcji
Rubber stoppers	Stony Lab	NY-RubberStoppers-HI-5PK-#12	Zatyczka komory suszącej
Soft wheat bran (soft red winter wheat) 50 lb	Siemer	55600050500000	Środek masowy dla larw
Square Glass Coverslips, 18X18mm	Alkali Scientific	SM1818	Szklane pokrywy do mikroiniekcji
Stereo microscope fluorescent adapter	Nightsea	SFA-RB	Lampa fluorescencyjna i filtry do przesiewania larw
Sterile glass beads	VWR	1.04016.0500	Rozprowadzanie bakterii na płytkach
Transfer Pipette Disposable 5mL	LabAid	BP1200	Płukanie zarodków podczas usuwania chrząstki
Triton X-100	Sigma-Aldritch	T8787-50ML	Usuwanie chrząstki z zarodków
Wash bottle	Safetyware	Z423335	Płukanie zarodków z powierzchni