Zintegrowana farmakologia sieciowa i analiza dokowania molekularnego dekocji Sishen identyfikuje potencjalne cele i ścieżki w dnie moczanowej

Podsumowanie

Ten protokół opisuje pracę farmakologii sieciowej i dokowania molekularnego w celu zidentyfikowania potencjalnych celów, szlaków sygnałowych i interakcji związek–cel Dekokcji Sishen w dnie moczanowej.

Streszczenie

Dną moczanową jest choroba charakteryzująca się hiperurykemia i osadzaniem się kryształów moczanowych w stawach i tkankach miękkich, prowadząca do nawracającego ostrego zapalenia stawów. Jej rosnąca częstość występowania nakłada znaczne obciążenie kliniczne i społeczno-ekonomiczne. Sishen Decoction (SSD) był stosowany w leczeniu dny moczanowej, ale jego potencjalne mechanizmy molekularne pozostają niejasne. W niniejszym badaniu zastosowano zintegrowane podejście farmakologii sieciowej i dokowania molekularnego w celu zidentyfikowania potencjalnych docelowych białek i ścieżek sygnałowych związanych z SSD w dnie moczanowej. Aktywne związki i odpowiadające im cele SSD pobrano z bazy danych Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database (TCMSP), podczas gdy cele związane z dną moczanową zebrano z baz GeneCards i Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM). Zidentyfikowano nakładające się cele i wykorzystano je do zbudowania sieci lekarstwo–składnik–cel–choroba. Sieć interakcji białko–białko (PPI) została ustanowiona przy użyciu bazy danych Search Tool for the Retrieval of Interacting Genes/Proteins (STRING). Przeprowadzono analizy wzbogacenia Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), po których nastąpiło dokowanie molekularne przy użyciu modułu analizy serwera dokowania. Łącznie 37 bioaktywnych związków było powiązanych z 116 nakładającymi się celami związanymi z dną moczanową. Najważniejszymi celami były TP53, IL6, IL1B, TNF, AKT1, EGFR, CASP3, JUN, BCL2 i MMP9. Analiza GO sugerowała, że te cele są zaangażowane w regulację ekspresji genów i przekaźnictwo sygnałów. Analiza wzbogacenia KEGG wskazała istotne powiązania ze ścieżkami sygnałowymi białek aktywowanej mitogenami (MAPK), fosfoinozytydylo 3-kinazy/białka kinazy B (PI3K-Akt), interleukiny-17 (IL-17) i czynnika nekrozującego guzów (TNF). Dokowanie molekularne przewidywało korzystne interakcje między kluczowymi związkami a celami centralnymi, przy czym wszystkie energie wiązań wynosiły ≤−5 kcal/mol. Te znaleziska obliczeniowe dostarczają potencjalnych hipotez mechanizmów działania SSD w dnie moczanowej i mogą wspierać przyszłe eksperymentalne walidacje.

Wprowadzenie

Dna dna jest chorobą charakteryzującą się hiperurykemia i osadzaniem kryształków kwasu moczowego w stawach i tkankach miękkich, prowadzącą do nawracających ostrych zapaleń stawów¹. Jej charakterystyczne objawy to nawracające epizody silnego bólu, zaczerwienienie, obrzęk i upośledzona czynność stawów^2,3. Choroba jest napędzana głównymi czynnikami ryzyka dietetycznego, takimi jak wysoki poziom puryn i cukru, a także nadmiernym spożyciem alkoholu, co skutkuje znacznym wzrostem częstości występowania choroby, co czyni ją poważnym problemem zdrowia publicznego, który nie tylko pogarsza jakość życia pacjentów, ale także nakłada znaczne obciążenia socjoekonomiczne^4,5,6. Skuteczne leczenie dny ma na celu zarówno usuwanie ostrych wzmożeń stanu zapalnego, jak i osiągnięcie długoterminowej redukcji poziomu kwasu moczowego w surowicy^7,8. Stosowanie niesteroidowych leków przeciwzapalnych, kolchicyny lub glikokortykoidów w celu kontroli ostrej stanu zapalnego dny często wiąże się z szeregiem działań niepożądanych, najczęściej zaburzeniami żołądkowo-jelitowymi^9,10. Ponadto leki obniżające poziom kwasu moczowego, takie jak benzbromaron, allopurinol i febuksostat, niosą ryzyko hepatotoksyczności i nadwrażliwości, co ogranicza ich szersze zastosowanie kliniczne^11,12. Dlatego też, poszukiwanie nowych strategii terapeutycznych, które są bezpieczne, skuteczne i wspierane przez jasno określone mechanizmy, pozostaje ważne klinicznie.

Kliniczna praktyka Tradycyjnej Chińskiej Medycyny (TCM) w zapobieganiu i leczeniu dny ma długą historię. Lekarze przez kolejne dynastie gromadzili szerokie doświadczenie w stosowaniu TCM w leczeniu tej choroby, z dobrze udokumentowanym skutecznym działaniem terapeutycznym. Poprzez całościową regulację i wielościeżkową interwencję w procesach patologicznych, TCM wykazuje wyraźne zalety terapeutyczne¹³. Sishen Decoction (SSD), pochodzący z tekstu z czasów dynastii Qing Nowo skompilowane sprawdzone formuły, składa się z pięciu ziół leczniczych: Astragalus membranaceus (Huangqi), Polygala tenuifolia (Yuanzhi), Achyranthes bidentata (Huainiuxi), Dendrobium nobile (Shihu) i Lonicera japonica (Jinyinhua). Zgłoszono, że SSD obniża poziom kwasu moczowego i poprawia jakość życia pacjentów z dną poprzez wzmacnianie witalnej qi, wypieranie czynników patogennych i odblokowanie torów energetycznych, aby złagodzić ból^14,15. Te działania terapeutyczne są zgodne z zasadami całościowej regulacji TCM. Jego potencjalne działanie może polegać na modulacjach złożonej sieci immunologiczno-metaboliczno-neuroendokrynnej, wpływając w ten sposób na patologiczne środowisko związane z dną¹⁶. Jednakże, podstawy molekularne leczniczych działań SSD w dnie pozostają niejasne. Co więcej, pomimo wcześniejszych badań dotyczących SSD w innych chorobach zapalnych, jego potencjalne cele i ścieżki w dnie nie zostały jeszcze systematycznie zbadane za pomocą zintegrowanego podejścia komputerowego.

Farmakologia sieciowa, nowa dyscyplina integrująca biologię systemową i polifarmakologię, przyjmuje całościową strategię „choroba-gen-cel-lek”, która naturalnie pasuje do wieloskładnikowych i wielocelowych cech formuł TCM^17,18. Dokowanie molekularne uzupełnia to podejście, przewidując tryby i powinności wiązania między aktywnymi związkami a białkami-celach na poziomie molekularnym, dostarczając w ten sposób wsparcia dla przewidzianych interakcji¹⁹. Połączenie globalnego przesiewania opartego na farmakologii sieciowej i oceny celów na podstawie dokowania molekularnego może poprawić wiarygodność przewidywania celów i zmniejszyć prawdopodobieństwo fałszywie dodatnich wyników związanych z pojedynczą metodą analityczną²⁰. Co ważne, wyniki uzyskane z tych podejść komputerowych dostarczają hipotez, które wymagają późniejszej eksperymentalnej weryfikacji. Biorąc pod uwagę, że mechanizmy molekularne działania SSD w dnie są słabo poznane, niniejsze badanie zastosowało zintegrowane podejście łączące farmakologię sieciową i dokowanie molekularne w celu zidentyfikowania potencjalnych celów, ścieżek sygnałowych i interakcji związek-cel związanych z SSD w dnie.

Protokół

Niniejsze oparte na bazie danych badania komputerowego nie wymaga udziału ludzkich uczestników, eksperymentów na zwierzętach ani próbek klinicznych. Zgodnie z art. 32 Chińskich środków dotyczących etycznej oceny badań nauk przyrodniczych i medycznych z udziałem ludzkich podmiotów, badania wykorzystujące legalnie uzyskane dane publicznie dostępne, nie powodujące szkody dla ludzkich podmiotów, nie zawierające delikatnych informacji osobistych i nie mające interesów komercyjnych kwalifikują się do zwolnienia z oceny etycznej. Dlatego też na niniejsze badania nie jest wymagana aprobata etyczna.

Projekt eksperymentu oraz analityczna ścieżka badania zostały przedstawione na poniższym schemacie (Rysunek 1).

Rysunek 1: Ogólny przepływ badań. Schemat przedstawia sekwencyjny przepływ analizy farmakologii sieciowej oraz analizy dokowania molekularnego, w tym pozyskanie aktywnych składników i docelowych białek Decokcji Sishen (SSD), zebranie docelowych białek związanych z dną moczanową, identyfikację pokrywających się docelowych białek, konstrukcję sieci leki-składnik-białko-choroba i sieci interakcji białko-białko (PPI), analizy wzbogacania Gene Ontology (GO) i Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG), oraz symulacje dokowania molekularnego. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Pozyskiwanie aktywnych składników i białek docelowych SSD
2 stycznia 2026 roku, aktywne składniki chemiczne pięciu ziół składających się na SSD, a mianowicie Huangqi, Yuanzhi, Huainiuxi, Shihu i Jinyinhua, zostały pozyskane z bazy danych Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology (TCMSP)²¹. Zastosowano kryteria selekcji oparte na właściwościach farmakokinetycznych: biodostępność doustna (OB) ≥30% i podobieństwo do leków (DL) ≥0,1822. Składniki spełniające te kryteria zostały uznane za potencjalne aktywne składniki. Następnie zebrano odpowiednie białka docelowe dla każdego składnika. Ponieważ TCMSP nie posiadało pełnych danych dla Yuanzhi i Shihu, chemiczne składniki tych dwóch ziół zostały dodatkowo pozyskane z bazy Herb 2.0 tego samego dnia. Po uzyskaniu nazw składników, przeprowadzono odwrotne wyszukiwanie w TCMSP, używając nazw składników i odpowiednich numerów CAS jako słów kluczowych, aby uzyskać informacje o celach. Dla związków uzyskanych z bazy Herb, tylko te, które zostały pomyślnie dopasowane do wpisów w TCMSP, albo na podstawie nazwy składnika, albo numeru CAS, zostały zachowane. Dopasowane związki były następnie poddawane tym samym kryteriom selekcji farmakokinetycznej (OB ≥ 30% i DL ≥ 0,18) przy użyciu danych TCMSP, a związki, którym brakowało pełnych informacji o OB lub DL, zostały wykluczone. Wszystkie dopasowane i przefiltrowane związki zostały ręcznie zweryfikowane względem oryginalnych zapisów z Herb 2.0, aby zapobiec błędnej identyfikacji. Następnie informacje o celach pochodzące z bazy Herb zostały połączone z informacjami o pozostałych ziołach, aby wygenerować pełny zestaw docelowych aktywnych składników dla SSD.

Wszystkie pozyskane białka docelowe zostały standaryzowane do oficjalnych symboli genów przy użyciu bazy danych UniProt. Poprzez zachowanie tylko przeglądanych przez ludzi (Swiss-Prot) wpisów i wykluczenie nieprzeglądanych (TrEMBL) wpisów, ustanowiono jednoznaczną korespondencję. Gdy wiele izoform odpowiadało temu samemu symbolowi genu, wybierano kanoniczną izoformę. Standaryzowany zestaw danych docelowych został zachowany do dalszej analizy przecinających się genów.

Zbieranie docelowych białek związanych z dną moczanową
2 stycznia 2026 roku, przeprowadzono systematyczne wyszukiwania w bazie danych GeneCards i bazie danych OMIM używając "dna moczanu" jako słowa kluczowego dotyczącego choroby, aby uzyskać białka docelowe związane z dną moczanową. Uzyskano białka docelowe z obu baz danych, które zostały wyeksportowane do arkuszy WPS (wersja 12.1.0). Kolumna Gene Symbol z OMIM została umieszczona obok kolumny Gene Symbol z GeneCards, a duplikatowe białka docelowe zostały usunięte za pomocą funkcji "Usuń duplikaty" na podstawie dokładnego dopasowania oficjalnych symboli genów w sposób niewrażliwy na wielkość liter. Następnie białka docelowe z obu baz danych zostały połączone, aby skonstruować kompleksowy zestaw białek docelowych związanych z dną moczanową.

Identyfikacja pokrywających się docelowych białek leku i choroby
Zestaw docelowych białek leku uzyskany z selekcji aktywnych składników i zestaw docelowych białek choroby związanej z dną moczanową zostały umieszczone w tym samym folderze projektu (D:\Venn). Uruchomiona została oprogramowanie R (wersja 4.4.0), a za pomocą pakietu readxl zaimportowano pliki Excel (.xlsx) zawierające listy docelowych białek. Pakiet dplyr został użyty do manipulacji danymi, w tym filtrowania i zmieniania nazw kol

Wyniki

Celowe cele leczenia dny szczawiowej SSD
W bazie TCMSP odnaleziono 62 aktywne składniki SSD spełniające kryteria selekcji, odpowiadające 3634 celom. Cele związane z dną zakupiono z GeneCards i OMIM, a po usunięciu duplikatów łącznie zebrano 3691 celów. Przecięcie celów związanych z aktywnymi składnikami SSD i celami związanymi z dną dało 116 wspólnych celów, które uznano za potencjalne cele terapeutyczne SSD w leczeniu dny (Rysunek 2).

Dyskusja

Dysuryczna artretyt to krystalopaticja wywołana osadzeniem kryształków kwasu moczowego w stawach jako konsekwencja hiperurykemii. Kryształki kwasu monosodiumowego (MSU) w jamie stawowej są rozpoznawane przez receptory rozpoznawania wzorców na powierzchni makrofagów i neutrofili, co prowadzi do aktywacji inflammasomu rodziny receptorów NOD-podobnych zawierających domenę piryny 3 (NLRP3) i następczego uwolnienia IL-1β²³. Ten proces dalej wyzwala ścieżki sygnałowe, w tym ścieżki MAPK, NF-κB, receptor...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
AutoDock Vina	The Scripps Research Institute	Wersja zintegrowana z serwerem internetowym CB-Dock 2	Silnik dokowania używany do obliczeń dokowania molekularnego i punktacji energii wiązania
CB-Dock 2	Liu et al. (Nucleic Acids Research, 2022)	Wersja internetowa (wydana w maju 2022); dostęp 23 stycznia 2026; URL: https://cadd.labshare.cn/cb-dock2	Używany do symulacji dokowania molekularnego między aktywnymi związkami a białkami docelowymi
ChimeraX	UCSF Resource for Biocomputing, Visualization, and Informatics	Wersja 1.5	Używany do trójwymiarowej wizualizacji kompleksów dokowania
clusterProfiler	Bioconductor	Wersja 4.21.0	Używany do analiz wzbogacania GO i KEGG
Cytoscape	Cytoscape Consortium / Institute for Systems Biology	Wersja 3.7.2	Używany do budowy sieci, wizualizacji i analizy PPI
dplyr	CRAN	Wersja 1.2.1	Używany do manipulacji danymi i generowania zestawów danych sieciowych
enrichplot	Bioconductor	Wersja 1.24.0	Używany do wizualizacji wyników wzbogacania GO i KEGG
GeneCards	Crown Human Genome Center, Weizmann Institute of Science	Wersja 5.26; dostęp 2 stycznia 2026; URL: https://www.genecards.org	Używany do pobierania danych dotyczących celów związanych z dną
ggplot2	CRAN	Wersja 3.5.1	Używany do wizualizacji wyników wzbogacania GO
Herb Database	Fang et al. (Nucleic Acids Research, 2024)	Wersja 2.0 (wydana 15 marca 2023); dostęp 2 stycznia 2026; URL: http://herb.ac.cn/v2	Używany do uzupełnienia informacji o aktywnych związkach dla Yuanzhi i Shihu
LigPlot+	European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI)	Wersja 2.2	Używany do generowania dwuwymiarowych diagramów interakcji białko-ligand
OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man)	McKusick-Nathans Institute of Genetic Medicine, Johns Hopkins University School of Medicine	Dostęp 2 stycznia 2026; URL: https://omim.org	Używany do pobierania danych dotyczących celów związanych z dną
openxlsx	CRAN	Wersja 4.2.8.1	Używany do eksportu i przetwarzania arkuszy kalkulacyjnych
org.Hs.eg.db	Bioconductor	Wersja 3.20.0	Pakiet adnotacji genomu ludzkiego używany do konwersji i adnotacji identyfikatorów genów
Protein Data Bank (RCSB PDB)	RCSB PDB	Dostęp 23 stycznia 2026; URL: https://www.rcsb.org	Używany do uzyskiwania struktur krystalicznych białek
R (The R Project for Statistical Computing)	R Foundation for Statistical Computing	Wersja 4.4.0	Używany do przetwarzania danych, analizy wzbogacania i generowania sieci
readxl	CRAN	Wersja 1.5.0	Używany do importu arkuszy kalkulacyjnych i przetwarzania danych
STRING Database	EMBL / Szklarczyk et al.	Wersja 12.0 (dostęp 2 stycznia 2026); URL: https://string-db.org	Używany do budowy sieci PPI
Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP)	Center for Bioinformatics, Northwest A&F University / Dalian University of Technology	Wersja 2.3 (dostęp 2 stycznia 2026); URL: https://tcmsp-e.com	Używany do pobierania aktywnych związków i odpowiadających im celów
UniProt (Universal Protein Resource)	UniProt Consortium (EMBL-EBI / SIB / PIR)	Wersja 202504 (dostęp 2 stycznia 2026); URL: https://www.uniprot.org	Używany do standardyzacji celów i adnotacji symboli genów
VennDiagram	CRAN	Wersja 1.7.3	Używany do identyfikacji nakładających się celów leków i chorób
Weishengxin Online Plotting Platform	Shanghai NewCore Biotechnology Co., Ltd.	Dostęp 23 stycznia 2026; URL: https://www.bioinformatics.com.cn	Używany do generowania map ciepła i wizualizacji wzbogacania
WPS Spreadsheets	Kingsoft Office	Wersja 12.1.0	Używany do usuwania duplikatów, zarządzania arkuszami kalkulacyjnymi i przetwarzania danych