Ekspresja białka czytającego m6A YTHDC2 w niedrobnokomórkowym raku płuca w chińskiej kohorcie klinicznej

Podsumowanie

W niniejszym badaniu oceniono ekspresję YTHDC2 w niedrobnokomórkowym raku płuca z wykorzystaniem bioinformatyki i qRT-PCR. Podczas gdy analizy baz danych sugerują obniżenie poziomu ekspresji oraz istotność prognostyczną, walidacja kliniczna nie wykazała znaczących różnic. Wyniki podkreślają niespójności, co wskazuje na ograniczoną dokładność diagnostyczną i potrzebę dalszej walidacji przed zastosowaniem w praktyce klinicznej.

Streszczenie

Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC) pozostaje główną przyczyną śmiertelności z powodu nowotworów na całym świecie, przy ograniczonej liczbie dostępnych biomarkerów do wczesnej diagnostyki i prognozowania. Modyfikacja RNA N6-metyloadenozyna (m6A) oraz jej białka odczytujące, takie jak YTHDC2, odgrywają kluczową rolę w regulacji genów i tumorigenizie. Celem niniejszego badania było ocena profilu ekspresji YTHDC2 w tkankach NSCLC z wykorzystaniem bioinformatyki i ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy w czasie rzeczywistym (qRT-PCR), ocena związku między YTHDC2 a cechami kliniczno-patologicznymi oraz zbadanie jego potencjalnego znaczenia klinicznego i biologicznego dla przyszłych badań. W celu oceny dokładności prognostycznej przeanalizowano dane dotyczące ekspresji genów i przeżywalności pochodzące z baz danych. Ekspresję YTHDC2 ilościowo określono w tkankach NSCLC w chińskiej kohorcie klinicznej, a następnie przeanalizowano cechy kliniczno-patologiczne. Analizy publicznych baz danych wykazały, że YTHDC2 był obniżony w tkankach NSCLC (p < 0,05) i był powiązany z przeżywalnością pacjentów, choć jego wartość prognostyczna była niska (AUC ≈ 0,5). Analiza qRT-PCR 19 par tkanek nowotworowych i sąsiednich tkanek prawidłowych nie wykazała statystycznie istotnej różnicy (p = 0,537) w ekspresji YTHDC2 między tkankami rakowymi a sąsiednimi. Podsumowując, analizy publicznych baz danych sugerują, że ekspresja YTHDC2 może być obniżona i może mieć potencjalne znaczenie prognostyczne w NSCLC, jednak niezależna walidacja kliniczna w naszej kohorcie nie potwierdziła istotnej różnicowej ekspresji. Wyniki te wskazują na znaczną heterogenność między wielkoskalowymi zbiorami danych a kohortami rzeczywistymi, co sugeruje, że YTHDC2 prawdopodobnie nie będzie wiarygodnym, samodzielnym biomarkerem diagnostycznym lub prognostycznym i może wymagać integracji z dodatkowymi markerami molekularnymi w celu zastosowania klinicznego.

Wprowadzenie

Niedrobnokomórkowy rak płuca (NSCLC), obejmujący raka плоскоepithelialnego i gruczołowego, jest najczęściej diagnozowanym nowotworem płuca i główną przyczyną śmiertelności z powodu raka na świecie¹. Globalne statystyki onkologiczne wskazują, że rak płuca jest jedną z głównych przyczyn zgonów z powodu nowotworów². Niedawne postępy w diagnostyce, chirurgii, radioterapii i terapii celowanej molekularnie nie poprawiły znacząco rokowania w przypadku NSCLC, ponieważ pierwotna diagnoza jest stawiana w późnym stadium, a choroba we wczesnych fazach często przebiega bezobjawowo³. Podkreśla to potrzebę opracowania nowych biomarkerów do identyfikacji, prognozowania i oceny skuteczności leczenia u pacjentów z NSCLC.

m6A jest pierwszą zidentyfikowaną i najliczniejszą modyfikacją RNA u eukariontów i bierze udział w stabilności, translacji oraz transkrypcji RNA⁴. Modyfikacje m6A są dynamiczne i odwracalne, a proces ten jest wspomagany przez metylotransferazy (pisarze), demetylazy (kaszerzy) oraz specyficzne białka wiążące (czytelnicy)⁵. Spośród nich YTHDC2, główne białko czytelnika m6A, moduluje stabilność RNA i tempo translacji⁶. Niedawne badania wskazują, że YTHDC2 bierze udział w regulacji wielu typów nowotworów, albo poprzez hamowanie wzrostu i inwazji komórek, albo poprzez indukowanie śmierci komórkowej⁷. Badania podkreśliły również kliniczne znaczenie innych białek czytelników m6A, w tym YTHDF1, YTHDF2 i YTHDC1, w progresji raka płuca, regulacji odpornościowej i prognozie, co podkreśla wagę systematycznej oceny poszczególnych czytelników m6A w niezależnych kohortach pacjentów^8,9,10. W NSCLC stwierdzono znacznie niskie poziomy YTHDC2, co wiązało się z zaawansowanymi stadiami guza, przerzutami do węzłów chłonnych i złym rokowaniem pacjentów, co wskazuje, że może on być czynnikiem przeciwnowotworowym¹¹. Eksperymenty in vitro i in vivo ujawniły również, że wysoka ekspresja YTHDC2 hamuje proliferację i przerzutniczość komórek w raku płuca⁷.

W niniejszym badaniu analizowano regulację YTHDC2 w NSCLC za pomocą zintegrowanych analiz obliczeniowych oraz walidacji eksperymentalnej metodą qRT-PCR. Zbadano również zależność między ekspresją YTHDC2 a charakterystyką kliniczno-patologiczną i rokowaniami pacjentów. Mimo rosnącej liczby dowodów z publicznych baz danych sugerujących dysregulację YTHDC2 w NSCLC, opublikowane badania wykazały niespójne wyniki w odniesieniu do skali i znaczenia klinicznego tej dysregulacji, a niezależna walidacja w dobrze scharakteryzowanych, rzeczywistych kohortach klinicznych, szczególnie w populacjach azjatyckich, pozostaje ograniczona. Co więcej, większość poprzednich badań opierała się głównie na publicznych zbiorach danych transkrypcyjnych lub modelach eksperymentalnych, a stosunkowo niewiele z nich łączyło wyniki bioinformatyczne z niezależną walidacją kliniczną. Poprzez połączenie wielkoskalowych publicznych analiz transkrypcyjnych z niezależną walidacją qRT-PCR w chińskiej kohorcie klinicznej, badanie to miało na celu ocenę powtarzalności wcześniejszych ustaleń oraz wypełnienie luki translacyjnej między analizami publicznych baz danych a rzeczywistymi próbkami klinicznymi. W związku z tym celem badania była systematyczna ocena ekspresji YTHDC2 z wykorzystaniem zintegrowanych podejść bioinformatycznych i walidacji klinicznej oraz ocena jej potencjalnego znaczenia biologicznego i klinicznego w NSCLC. Postawiono hipotezę, że ekspresja YTHDC2 jest dysregulowana w NSCLC, a połączenie analiz bioinformatycznych z niezależną walidacją kliniczną zapewni bardziej wiarygodną ocenę jej znaczenia diagnostycznego i prognostycznego niż każde z tych podejść stosowane osobno.

Protokół

Badanie zostało zatwierdzone przez Komitet Etyki Uniwersytetu Medycznego w Hainan (numer zatwierdzenia HMC1984.24) i przeprowadzono je zgodnie z Deklaracją Helsińską (w wersji zrewidowanej w 2013 roku).

Badani

Badanie przeprowadzone u 50 pacjentów z rakiem płuca, zdiagnozowanych w latach 2017–2024 w Sanya Central Hospital w prowincji Hainan, zostało wykonane zgodnie z wytycznymi klinicznymi Chińskiego Stowarzyszenia Medycznego dotyczącymi diagnostyki i leczenia raka płuca (wydanie z 2024 r.). W celu zapewnienia porównywalności między badaniami zastosowano stopniowanie CSCO (2024), zgodne z 8. wydaniem AJCC, co zostało zwalidowane w kohortach chińskich¹²; w celu zapewnienia spójności przeprowadzono dwie niezależne oceny onkologiczne. Proces wyboru pacjentów, dostępność tkanek, ocena jakości RNA oraz ostateczna liczba próbek włączonych do analizy qRT-PCR zostały podsumowane na Rysunku 1.

Dane badania

W niniejszym badaniu wykorzystano bioinformatykę do analizy poziomów ekspresji YTHDC2 w NSCLC oraz ich związku z cechami kliniczno-patologicznymi, co pozwoliło na uzyskanie wglądu w potencjalne mechanizmy. Analizy bioinformatyczne przeprowadzono wyłącznie z wykorzystaniem publicznie dostępnych danych z sekwencjonowania RNA z The Cancer Genome Atlas (TCGA), obejmujących gruczolakoraka płuca (LUAD), raka płaskonabłonkowego płuca (LUSC) oraz odpowiadające im próbki normalnej tkanki płucnej pobrane za pośrednictwem GDC Data Portal (https://portal.gdc.cancer.gov/). Pobranym zestaw danych towarzyszyły dane o ekspresji z sekwencjonowania RNA wraz z dostępnymi zmiennymi klinicznymi (identyfikator pacjenta, identyfikator próbki, wiek, płeć, stopień zaawansowania patologicznego, status przeżycia oraz całkowity czas przeżycia) dla kwalifikujących się przypadków TCGA-LUAD i TCGA-LUSC. Próbki pozbawione informacji o ekspresji genów lub przeżywalności zostały wykluczone z dalszych analiz przeżycia i analiz ROC. Zestaw danych wykorzystany w tym badaniu znajduje się w Pliku uzupełniającym 1. Do analiz bioinformatycznych nie wykorzystano materiału klinicznego pobranego w Sanya Central Hospital. Szczegółowe procedury analiz GEPIA, Kaplan–Meier Plotter oraz survivalROC przedstawiono w poniższej sekcji Analiza bioinformatyczna. Kompletny schemat analizy bioinformatycznej, obejmujący pozyskiwanie danych, przetwarzanie wstępne, analizę ekspresji genów, analizę przeżywalności oraz analizę ROC, podsumowano na Rysunku 2.

Kryteria włączenia i wyłączenia

Kryteria włączenia i wyłączenia pacjentów przedstawiono w Tabeli 1. Analiza mocy przeprowadzona za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej wykazała, że co najmniej 26 przypadków w grupie zapewni 80% mocy do wykrycia umiarkowanej wielkości efektu (d = 0,8, α = 0,05, test obustronny). Choć pierwotnie planowano włączenie 50 par w grupie raka płuca, końcowa analiza qRT-PCR objęła 30 próbek guza i 19 próbek prawidłowej tkanki sąsiedniej po wykluczeniu próbek ze względu na jakość tkanki lub RNA. Redukcja liczby próbek odzwierciedla rzeczywiste ograniczenia kliniczne i podkreśla znaczenie integralności RNA oraz dostępności tkanki w badaniach translacyjnych. Przy n = 19 dla porównań minimalna wykrywalna wielkość efektu wynosi d = 1,0 (moc 80%, α = 0,05). Zatem badanie posiadało wystarczającą moc, aby wykryć duże, ale nie małe lub umiarkowane różnice w ekspresji YTHDC2.

Próbki tkanek i ilościowe PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)

Diagnozy patomorfologiczne zostały określone w sposób podwójnie ślepy przez dwóch różnych patomorfologów. Czystość guza została oceniona przez patomorfologów (>70% komórek złośliwych) i potwierdzona za pomocą metody ESTIMATE (TCGA). Sąsiadujące tkanki prawidłowe zostały poddane makrodissekcji w celu zminimalizowania zanieczyszczenia stromy. Typy histologiczne raka płuca obejmowały gruczolakoraka płuca oraz raka плоскоkomórkowego, w tym 26 przypadków gruczolakoraka płuca i 4 przypadki raka плоскоkomórkowego. Stadiowanie kliniczne 50 pacjentów z rakiem płuca przeprowadzono zgodnie z kryteriami stadiowania opisanymi w „Chinese Medical Association Clinical Guidelines for Lung Cancer (2024 Edition)”. Patologicznie potwierdzone preparaty NSCLC (n = 50) reprezentowały typowy rozkład kliniczny (patrz Tabela 2). Z 50 początkowo zakwalifikowanych pacjentów, 30 próbek tkanki nowotworowej i 19 dopasowanych próbek sąsiadującej tkanki prawidłowej spełniło kryteria jakości RNA. Ponieważ sparowana analiza statystyczna wymaga dopasowanych preparatów od tego samego pacjenta, porównanie ekspresji w guzie i sąsiadującej tkance prawidłowej wykonano z wykorzystaniem 19 dostępnych dopasowanych par. Te preparaty kliniczne zostały użyte wyłącznie do walidacji eksperymentalnej metodą qRT-PCR i analizowano je niezależnie od publicznych zbiorów danych TCGA wykorzystanych do analizy bioinformatycznej. Wybrane preparaty przetworzono natychmiast po potwierdzeniu patologicznym i obsługiwano w warunkach wolnych od RNaz przed ekstrakcją RNA. Podzbiór ten odzwierciedla przypadki, w których uzyskano zarówno odpowiednią ilość tkanki, jak i wysokiej jakości całkowite RNA (liczba integralności RNA, RIN >7.0). Stężenie i czystość całkowitego RNA zmierzono przed odwrotną transkrypcją, a do dalszych analiz włączono tylko próbki o odpowiedniej jakości RNA (RIN >7.0). Równe ilości całkowitego RNA poddano odwrotnej transkrypcji do komplementarnego DNA (cDNA) zgodnie z protokołem producenta przed ilościowym PCR. Proces ten zapewnił poprawność analizowanych danych ekspresji genów. Eksperymenty qRT-PCR przeprowadzono na termocyklerze PCR czasu rzeczywistego przy użyciu testu ilościowego PCR opartego na sondach. Wszystkie reakcje przeprowadzono w trzech powtórzeniach, wraz z kontrolami bez matrycy, aby zapewnić powtarzalność analityczną. Amplifikację PCR przeprowadzono w następujących warunkach cyklicznych: początkowy etap aktywacji enzymu/denaturacji w 95°C przez 10 min, a następnie 40 cykli denaturacji w 95°C przez 15 s i przyłączania/elongacji w 60°C przez 60 s. Sygnały fluorescencyjne rejestrowano na koniec każdego cyklu amplifikacji. Wszystkie odczynniki i materiały eksploatacyjne pozyskano od komercyjnych dostawców (patrz Tabela Materiałów). Sekwencje starterów i sond użytych w qRT-PCR znajdują się w Tabeli 3.

Analiza bioinformatyczna

Analiza ekspresji genu YTHDC2 w bazie danych GEPIA

Bazę danych GEPIA wykorzystano do analizy ekspresji YTHDC2 w NSCLC. Dostęp do serwera GEPIA (http://gepia.cancer-pku.cn/) uzyskano za pomocą przeglądarki internetowej. Wybrano moduł Expression DIY, wprowadzono symbol genu "YTHDC2", wybrano zbiory danych LUAD oraz LUSC, zachowano domyślne parametry normalizacji, a następnie bezpośrednio w interfejsie GEPIA wygenerowano wykresy pudełkowe ekspresji różnicowej. Istotność statystyczną określono jako p < 0.05.

Baza danych Kaplan-Meier plotter do analizy przeżywalności pacjentów z rakiem płuca

W badaniu przeanalizowano związek między ekspresją YTHDC2 a rokowaniem u pacjentów z rakiem płuca przy użyciu bazy danych Kaplan-Meier Plotter. Wybrano zbiór danych dotyczących raka płuca, wprowadzono symbol genu "YTHDC2", zastosowano opcję automatycznego wyboru najlepszego punktu odcięcia (cutoff), a następnie wygenerowano krzywe Kaplana-Meiera dla przeżycia całkowitego oraz przeżycia po progresji, korzystając z domyślnych ustawień analizy. Pacjentów automatycznie podzielono na grupy o wysokiej i niskiej ekspresji, stosując optymalny punkt odcięcia określony przez platformę Kaplan-Meier Plotter; wartości hazard ratio wraz z odpowiadającymi im 95% przedziałami ufności wygenerowano przy użyciu domyślnych ustawień platformy.

Uruchamianie pakietów R w oprogramowaniu R do wykreślania krzywych ROC

Dane z sekwencjonowania RNA oraz odpowiadające im metadane kliniczne dla kwalifikujących się przypadków TCGA-LUAD i TCGA-LUSC pobrano z portalu GDC Data Portal. Pobrane zestawy danych scalono według identyfikatora pacjenta i zaimportowano do programu R w celu przeprowadzenia dalszych analiz. Pakiet survivalROC wykorzystano do wygenerowania zależnych od czasu krzywych ROC dla punktów czasowych prognozy wynoszących 1, 3 i 5 lat, a odpowiadające im wartości powierzchni pod krzywą (AUC) obliczono w celu oceny wydajności prognostycznej ekspresji YTHDC2. W analizie ROC przeżycia uwzględniono wyłącznie pacjentów TCGA-LUAD i TCGA-LUSC, dla których dostępne były dane o ekspresji RNA-seq oraz informacje o przeżyciu. Lokalna kohorta kliniczna nie została wykorzystana do prognozowania przeżycia ze względu na brak danych z długoterminowej obserwacji.

Ekspresja YTHDC2 w tkankach za pomocą qRT-PCR

W celu analizy poziomów ekspresji genów przeprowadzono qRT-PCR. Do każdej reakcji dodano równe objętości cDNA, zgodnie z zalecanymi przez producenta warunkami reakcji. Amplifikację przeprowadzono za pomocą ilościowego testu PCR opartego na sondach, a dane fluorescencji zbierano automatycznie po każdym cyklu amplifikacji. W skrócie proces ekstrakcji RNA obejmował kilka etapów, w tym przygotowanie próbek, deparafinizację, usunięcie pozostałych cieczy, trawienie proteinazą K, inkubację, wirowanie, traktowanie DNazą, dodanie DNazy I oraz wytrącanie etanolem. Następnie próbkę związano z kolumną do oczyszczania RNA opartą na krzemionce i odwirowano przy 8,000 × g przez 30 s. Kolumnę przemyto buforem do przemywania 1, buforem do przemywania 2 oraz buforem do przemywania 2 rozcieńczonym etanolem, a następnie osuszono przy 13,000 × g przez 2 min. RNA eluwano poprzez dodanie 70 µL wody wolnej od RNaz do centrum membrany kolumny, a następnie odwirowano przy 13,000 × g przez 1 min. Każda para starterów wykazała pojedynczy produkt amplifikacji, co potwierdzono analizą krzywych topnienia przed obliczeniem względnej ekspresji genów. Wydajność starterów (90–110%) zwalidowano za pomocą krzywych standardowych przed analizą próbek. Analizy krzywych topnienia potwierdziły obecność pojedynczych amplikonów oraz brak dimerów starterów. Względną ekspresję YTHDC2 obliczono metodą 2^-ΔCt, w której wartości Ct znormalizowano względem endogennego genu referencyjnego GAPDH. Ponieważ wartości ekspresji przedstawiono jako znormalizowane poziomy ekspresji, a nie jako krotność zmiany względem próbki kalibratora, wyniki podano jako wartości 2^−ΔCt. GAPDH wybrano jako gen housekeepingowy, ponieważ jego ekspresja wykazywała minimalną zmienność (CV < 5%) w porównaniu z testowanymi alternatywami (ACTB, CV = 12%; 18S rRNA, CV = 18%), co jest zgodne z kryteriami wyboru genów referencyjnych w badaniach m6A.

Analiza statystyczna

Analizy statystyczne, w tym tworzenie grafik i wykresów, wykonano przy użyciu oprogramowania statystycznego. Do analizy danych ilościowych i kategorycznych dotyczących ekspresji genu YTHDC2 u pacjentów z NSCLC wykorzystano oprogramowanie R do analiz bioinformatycznych i generowania krzywych ROC. Krzywe ROC oraz AUC posłużyły do oceny wydajności diagnostycznej ekspresji YTHDC2 w przewidywaniu przeżywalności. W przypadku analiz opartych na regresji podano szacunki efektu (ilorazy szans) wraz z odpowiadającymi im 95% przedziałami ufności, tam gdzie było to właściwe. Testy Wilcoxona dla par wykorzystano do porównania ekspresji YTHDC2 pomiędzy parami próbek guza i sąsiadującej tkanki prawidłowej, natomiast analizę korelacji Pearsona zastosowano do oceny związku między ekspresją YTHDC2 a cechami kliniczno-patologicznymi. Podano współczynniki korelacji (r) oraz odpowiadające im wartości p. Ponieważ dane qRT-PCR składały się z par próbek guza i sąsiadującej tkanki prawidłowej od tych samych pacjentów, a dane o ekspresji genów nie miały rozkładu normalnego, do porównania poziomów ekspresji YTHDC2 między parami tkanek zastosowano test Wilcoxona dla par. Test ten nie zakłada normalności danych i jest powszechnie stosowany w przypadku skośnych danych biologicznych. Wszystkie testy statystyczne były dwustronne, a wartość p <0,05 uznano za istotną statystycznie. Przed analizą sprawdzono normalność rozkładu zmiennych ciągłych. Zmienne ciągłe przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe lub mediana (rozstęp międzykwartylowy), w zależności od potrzeby.

Wyniki

Ekspresja genu YTHDC2 w guzach na podstawie bazy danych TCGA

Rysunek 3 ilustruje związek między NSCLC a YTHDC2 poprzez analizę poziomów ekspresji YTHDC2 w różnych nowotworach z wykorzystaniem narzędzia GDC w bazie danych TCGA.

Ekspresja genu YTHDC2 w NSCLC w bazie danych GEPIA

W wyniku dodatkowego przesiewowego badania poziomów ekspresji YTHDC2 w gruczolakoraku płuca (LUAD) oraz raku płaskonabłonkowym płuca (LUSC) w bazie danych GEPIA pozyskano 483 próbki tkanki gruczolakoraka płuca, 347 próbek normalnej tkanki płuca, 486 próbek tkanki raka płaskonabłonkowego płuca oraz 338 próbek normalnej tkanki płuca. Analizy statystyczne wykazały, że zarówno w tkankach gruczolakoraka płuca, jak i raka płaskonabłonkowego płuca poziomy ekspresji YTHDC2 były znacznie niższe niż w normalnych tkankach płuca (p < 0.05), co przedstawiono na Rysunku 4.

Analiza GEPIA ekspresji YTHDC2 w różnych stadiach patologicznych

Baza danych GEPIA (Gene Expression Profiling Interactive Analysis) została wykorzystana do wygenerowania wykresu etapowego w celu oceny różnic w ekspresji YTHDC2 w różnych stadiach NSCLC. Jak pokazano na Rysunku 5, nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w ekspresji YTHDC2 pomiędzy stadiami patologicznymi NSCLC (p = 0,644).

Analiza Kaplana-Meiera przeżywalności w raku płuca w zależności od poziomu YTHDC2

Do przeprowadzenia analizy przeżycia metodą Kaplana-Meiera dla genu YTHDC2 wykorzystano bazę danych Kaplan-Meier Plotter. Wyniki wykazały, że pacjenci z wysoką ekspresją YTHDC2 mieli istotnie wyższą przeżywalność całkowitą (OS) niż pacjenci z niską ekspresją (p < 0,05). Jak pokazano na Rysunku 6A (OS), pacjenci z rakiem płuca wykazujący wyższy poziom ekspresji YTHDC2 mieli lepsze rokowania, a różnica ta była statystycznie istotna (p < 0,05). Zgodnie z Rysunkiem 6B (PPS), w zbiorze danych dotyczącym przeżycia po progresji (PPS), grupa z wysoką ekspresją YTHDC2 miała lepsze rokowania niż grupa z niską ekspresją; różnica ta była statystycznie istotna (p < 0,05).

Model predykcji przeżywalności YTHDC2

Zależna od czasu analiza ROC, oparta na danych o ekspresji RNA-seq i przeżywalności z TCGA, wykazała ograniczoną zdolność prognostyczną samej ekspresji YTHDC2 w odniesieniu do przeżywalności w NSCLC, przy wartościach AUC wynoszących odpowiednio 0,50 (95% CI: 0,38-0,62), 0,51 (95% CI: 0,39-0,63), 0,52 (95% CI: 0,40-0,64) oraz 0,52 (95% CI: 0,39–0,65) po 1, 3, 5 i 8 latach (Rysunek 7). Wszystkie przedziały ufności AUC obejmowały wartość 0,5, co wskazuje na skuteczność równą przypadkowemu wyborowi. Wyniki te wskazują, że sama ekspresja YTHDC2 nie posiada mocy dyskryminacyjnej w przewidywaniu przeżywalności i nie powinna być rozważana jako samodzielny biomarker prognostyczny. Integracja z parametrami kliniczno-patologicznymi lub wielogenowymi sygnaturami może poprawić wydajność prognostyczną.

Ekspresja YTHDC2 w tkankach nowotworowych w porównaniu z tkankami prawidłowymi za pomocą qRT-PCR

Ekspresję genu YTHDC2 zbadano za pomocą qRT-PCR zarówno w tkankach złośliwych, jak i w przyległych tkankach prawidłowych u pacjentów z NSCLC. Znormalizowana ekspresja YTHDC2 (2^−ΔCt) wynosiła 3,24 ± 2,34 w tkankach złośliwych oraz 3,60 ± 1,70 w pobliskich tkankach prawidłowych. Nie stwierdzono istotnej różnicy w ekspresji YTHDC2 pomiędzy 19 parami tkanek guza NSCLC a odpowiadającymi im przyległymi tkankami prawidłowymi (p = 0,537), co przedstawiono na Rysunku 8. Choć analiza bioinformatyczna dużych zbiorów danych sugerowała istotne obniżenie ekspresji YTHDC2 w NSCLC, badanie qRT-PCR w naszej kohorcie nie wykazało istotnych różnic, co wskazuje na potencjalne rozbieżności wynikające z wielkości kohorty, heterogeniczności próbek oraz zmienności technicznej. Ponadto niska wartość AUC (0,5) wskazuje, że sam YTHDC2 nie posiada dokładności diagnostycznej ani prognostycznej.

Ekspresja YTHDC2 i cechy kliniczno-patologiczne w NSCLC

Badanie objęło 50 osób z NSCLC. W grupie znajdowało się 32 mężczyzn (64,00%) i 18 kobiet (36,00%), a średni wiek wynosił 63,10 ± 9,85 lat. Wiek uczestników mieścił się w przedziale od 37 do 86 lat. spośród pacjentów 25 paliło w przeszłości, a 25 nigdy nie paliło. Wśród typów patomorfologicznych odnotowano dziewięć przypadków raka плоскоkomórkowego (18,00%) oraz czterdzieści jeden przypadków gruczolakoraka płuca (82,0%). Według klasyfikacji klinicznej CSCO 22 pacjentów znajdowało się w stadium III–IV (44,00%), a 28 w stadium I–II (56,00%). U dwudziestu czterech pacjentów nie stwierdzono przerzutów do węzłów chłonnych, natomiast u dwudziestu sześciu osób (54,00%) wystąpiły przerzuty. U dziewięciu pacjentów stwierdzono raki słabo zróżnicowane (18,00%), natomiast u 41 pacjentów guzy były dobrze lub umiarkowanie zróżnicowane (82,00%).

Zbadano związek między klinicznymi cechami patologicznymi a poziomami ekspresji YTHDC2 w tkankach NSCLC. Zaobserwowano różnice w ekspresji YTHDC2 pomiędzy podtypami patologicznymi oraz w zależności od stanu przerzutów do węzłów chłonnych (p < 0,05). Jednak ze względu na dostępność jedynie czterech próbek raka płaskonabłonkowego, porównanie podtypów patologicznych należy interpretować ostrożnie i traktować jako wstępne. Jak pokazano na Rysunkach 9A,B, ekspresja YTHDC2 była znacząco wyższa w raku płaskonabłonkowym niż w gruczolakoraku płuca oraz znacząco wyższa w tkankach NSCLC z przerzutami do węzłów chłonnych niż w tych bez przerzutów (5,70 ± 2,53 vs. 3,83 ± 0,91, p = 0,027). Ponieważ jednak uwzględniono tylko cztery próbki raka płaskonabłonkowego, porównanie podtypów patologicznych należy interpretować z ostrożnością i uznać za badanie eksploracyjne do czasu walidacji w większych kohortach. Wyższa ekspresja YTHDC2 u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych może wskazywać na potencjalny związek między YTHDC2 a stanem przerzutów do węzłów chłonnych; wynik ten należy jednak interpretować ostrożnie ze względu na ograniczoną wielkość próby, a jego potwierdzenie wymaga walidacji w większych, niezależnych kohortach. Natomiast wiek, historia palenia, stopień kliniczny CSCO oraz różnicowanie histologiczne nie wpływały znacząco na ekspresję YTHDC2 (p > 0,05). Dodatkowe informacje zawarto w Tabeli 4, Tabeli 5 oraz na Rysunku 9.

Binarna regresja logistyczna przerzutów do węzłów chłonnych w NSCLC

Zgodnie z analizą korelacji, ekspresja YTHDC2 była istotnie powiązana z przerzutami do węzłów chłonnych (p < 0.05). Przeprowadzono analizę regresji logistycznej binarnej u pacjentów z NSCLC, przyjmując przerzuty do węzłów chłonnych jako zmienną zależną, a wiek, płeć, wywiad w kierunku palenia tytoniu, stopień zaawansowania nowotworu, typ patomorfologiczny, poziom ekspresji YTHDC2 oraz stopień zróżnicowania jako zmienne niezależne. Wyniki wykazały, że ekspresja YTHDC2 u pacjentów z NSCLC była istotnie powiązana z przerzutami do węzłów chłonnych (p = 0.027, OR = 2.286, 95% CI: 1.101–4.748).

W ogólnych danych klinicznych stopień zaawansowania nowotworu u pacjentów z NSCLC był statystycznie istotnie skorelowany z przerzutami do węzłów chłonnych (p = 0.007, OR = 27, 95% CI: 2.504-291.186). Jednakże wiek, płeć, historia palenia, typ patologiczny i stopień zróżnicowania nie wykazały istotnej korelacji z przerzutami do węzłów chłonnych w NSCLC (p > 0.05), co przedstawiono w Tabeli 6.

Dostępność danych: Zbiory danych wspierające wyniki niniejszego badania są dostępne w repozytorium Zenodo (DOI: 10.5281/zenodo.21409961). Repozytorium zawiera metadane kliniczne TCGA, adnotacje próbek, specyfikacje pobierania danych oraz manifest analizy wykorzystany w analizach bioinformatycznych. Dodatkowe dane są dostępne od autora korespondującego na uzasadnioną prośbę.

Rysunek 1: Schemat blokowy wyboru pacjentów i włączenia tkanek do analizy qRT-PCR. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2. Schemat analiz bioinformatycznych przeprowadzonych w celu oceny ekspresji YTHDC2 i znaczenia prognostycznego w NSCLC Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 3: Ekspresja genu YTHDC2 w bazie danych TCGA. Poziomy ekspresji YTHDC2 w gruczolczym raku płuca (LUAD) i płaskonabłonkowym raku płuca (LUSC) porównano z poziomami w prawidłowych tkankach płuca, wykorzystując dane z sekwencjonowania RNA uzyskane z The Cancer Genome Atlas (TCGA) poprzez portal danych Genomic Data Commons (GDC) i analizując je za pomocą platformy internetowej GEPIA. Dane zostały przeanalizowane za pomocą platformy GEPIA. Istotność statystyczną określono przy wartości p < 0,05. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 4: Różnicowa ekspresja YTHDC2 w NSCLC na podstawie analizy bazy danych GEPIA. Poziomy ekspresji YTHDC2 w gruczolakoraku płuca (LUAD) i raku płaskonabłonkowym płuca (LUSC) porównano z poziomami w prawidłowych tkankach płuc, wykorzystując dane z projektów The Cancer Genome Atlas (TCGA) oraz Genotype-Tissue Expression (GTEx) za pośrednictwem platformy GEPIA. Wykresy pudełkowe przedstawiają znormalizowane poziomy ekspresji genów. Istotność statystyczną określono przy p-value < 0.05. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Rysunek 5: Analiza ekspresji YTHDC2 w zależności od stopnia zaawansowania NSCLC z wykorzystaniem bazy danych GEPIA. Poziomy ekspresji YTHDC2 analizowano w różnych stadiach patologicznych (I–IV) NSCLC przy użyciu platformy GEPIA. Wykres stadiów przedstawia zmienność ekspresji genu w zależności od stopnia zaawansowania nowotworu. Nie zaobserwowano statystycznie istotnych różnic w ekspresji YTHDC2 pomiędzy poszczególnymi stadiami (p = 0.644). Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 6: Analiza przeżycia Kaplana–Meiera dla ekspresji YTHDC2 u pacjentów z NSCLC (Kaplan–Meier Plotter). (A) Przeżycie całkowite (OS): krzywe przeżycia Kaplana–Meiera porównujące przeżycie całkowite u pacjentów z NSCLC podzielonych na grupy z wysoką (n = 140) i niską (n = 364) ekspresją YTHDC2, przy zastosowaniu optymalnego ustawienia punktu odcięcia („auto-select best cutoff”) dostarczonego przez narzędzie Kaplan–Meier Plotter. Do oceny istotności statystycznej wykorzystano test log-rank (p = 0.0093); współczynnik hazardu (HR) = 0.61; 95% przedział ufności (CI): 0.42–0.89. Podwyższona ekspresja YTHDC2 wiąże się ze znacząco lepszym przeżyciem całkowitym. (B) Przeżycie po progresji (PPS): krzywe przeżycia Kaplana–Meiera porównujące przeżycie po progresji u pacjentów z NSCLC podzielonych na grupy z wysoką (n = 181) i niską (n = 296) ekspresją YTHDC2, przy zastosowaniu optymalnego ustawienia punktu odcięcia („auto-select best cutoff”) dostarczonego przez narzędzie Kaplan–Meier Plotter. Do porównania statystycznego wykorzystano test log-rank (p = 4.2 × 10⁻⁵); współczynnik hazardu (HR) = 0.63 (95% przedział ufności: 0.51–0.79). Wysoka ekspresja YTHDC2 wiąże się ze znacząco dłuższym przeżyciem po progresji. Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 7: Model predykcji przeżywalności YTHDC2. Krzywe charakterystyki operacyjnej odbiornika (ROC) oceniające dokładność predykcyjną YTHDC2 w odniesieniu do przeżycia całkowitego u pacjentów z TCGA-LUAD i TCGA-LUSC z dostępnymi danymi dotyczącymi ekspresji RNA-seq oraz przeżywalności w punktach czasowych 1, 3, 5 i 8 lat. Wartości AUC: 1 rok = 0.50, 3 lata = 0.51, 5 lat = 0.52 oraz 8 lat = 0.52. Przerywana linia diagonalna oznacza przypadek losowy (AUC = 0.5). Analizę przeprowadzono przy użyciu pakietu survival ROC w środowisku R. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 8: Ekspresja YTHDC2 w sparowanych tkankach guza NSCLC i sąsiednich tkankach prawidłowych zmierzona metodą qRT-PCR. Względną ekspresję YTHDC2 obliczono metodą 2^–ΔCt i znormalizowano względem GAPDH. Wartości ekspresji reprezentują znormalizowane poziomy ekspresji, a nie krotność zmian w stosunku do próbki kalibratora. Analizę statystyczną przeprowadzono z wykorzystaniem 19 dostępnych sparowanych par tkanka guza–sąsiednia tkanka prawidłowa do porównania sparowanego. Dane przedstawiono jako poszczególne obserwacje sparowane wraz ze średnią ± odchyleniem standardowym. Różnice między próbkami sparowanymi przeanalizowano za pomocą testu znaków Wilcoxona (p = 0,537). Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tego rysunku.

Rysunek 9: Związek między ekspresją YTHDC2 a charakterystyką kliniczno-patologiczną u pacjentów z NSCLC. (A) Ekspresja YTHDC2 w różnych typach patologicznych, wykazująca wyższą ekspresję w raku плоскоkomórkowym niż w raku gruczołowym (p < 0.05). (B) Ekspresja YTHDC2 w zależności od statusu przerzutów do węzłów chłonnych, wykazująca wyższą ekspresję u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych niż u pacjentów bez przerzutów (p < 0.05). (C) Ekspresja YTHDC2 w różnych stopniach różnicowania histologicznego, bez statystycznie istotnej różnicy (p = 0.181). (D) Ekspresja YTHDC2 w stadiach klinicznych według CSCO, bez statystycznie istotnej różnicy (p = 0.08). Poziomy ekspresji YTHDC2 zmierzono za pomocą ilościowej reakcji PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR) i obliczono metodą 2^–ΔCt, normalizując do GAPDH. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Porównania statystyczne wykonano za pomocą testu sum rang Wilcoxona. *p < 0.05 uznano za statystycznie istotne. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

L.p.	Kryteria włączenia	Kryteria wykluczenia
1	Wiek ≥18 lat, niezależnie od płci.	Rozpoznanie innych nowotworów złośliwych.
2	Potwierdzone rozpoznanie NSCLC zgodnie z wytycznymi klinicznymi dotyczącymi raka płuca Chinese Medical Association (wydanie z 2024 r.).	Obecność przewlekłych chorób układu oddechowego lub sercowo-naczyniowych (np. COPD, nadciśnienie płucne, niewydolność serca).
3	Dostępność pełnych danych klinicznych, w tym danych demograficznych, surowiczych markerów nowotworowych oraz obrazowania TK klatki piersiowej z kontrastem, wraz z podpisaną świadomą zgodą.	Ciężka niewydolność narządowa, w tym niewydolność nerek (eGFR <30 ml/min/1.73m²) lub marskość wątroby.
4	Pacjenci nieleczeni, bez uprzednio zastosowanych terapii skierowanych przeciwko nowotworowi.	Populacje szczególne, w tym kobiety w ciąży lub karmiące piersią (potwierdzone testem β-hCG, jeśli dotyczy).
5	Dostępność odpowiednich próbek guza i/lub tkanki sąsiedniej nadających się do analizy molekularnej.	Słaba jakość preparatu, w tym niewystarczająca ilość tkanki lub zdegradowane RNA (potwierdzone przez opis patomorfologa).

Tabela 1: Kryteria włączenia i wykluczenia pacjentów z NSCLC w badaniu

Typ tkanki	Liczba analizowanych próbek sparowanych (n)	Ekspresja względna (średnia ± SD)
Tkanka nowotworowa	19	3.24 ± 2.34
Dopasowana sąsiednia tkanka prawidłowa	19	3.60 ± 1.70

Tabela 2: Ekspresja YTHDC2 w sparowanych tkankach nowotworowych NSCLC i przyległych tkankach prawidłowych. Względną ekspresję YTHDC2 zmierzono metodą 2^–ΔCt i znormalizowano do GAPDH. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Porównanie statystyczne 19 dopasowanych par tkanki nowotworowej i przyległej tkanki prawidłowej przeprowadzono za pomocą testu znaków Wilcoxona (p = 0,537).

Gen docelowy	Starter/Sonda	Sekwencja (5′→3′)
YTHDC2	Forward (F)	CCTGTCACCAATAAAGAGCG
	Reverse (R)	CACTGGAATCTGAGGTATGCC
	Sonda (P)	AGCAAGACAAGTGGGCGACTCAA
GAPDH	Forward (F)	AATCCCATCACCATCTTCCAG
	Reverse (R)	ATGACCCTTTTGGCTCCC
	Sonda (P)	CCAGCATCGCCCCACTTGATTTT

Tabela 3: Sekwencje starterów i sond użytych do ilościowej PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR).Ekspresję YTHDC2 ilościowo określono z wykorzystaniem chemii TaqMan, stosując GAPDH jako kontrolę wewnętrzną.

Charakterystyka	Kategoria	n	%
Typ patologiczny	Gruczolakorak	41	82
	Rak płaskonabłonkowy	9	18
Stopniowanie CSCO	I–II	28	56
	III–IV	22	44
Przerzuty do węzłów chłonnych	Nie	24	48
	Tak	26	52
Stopień zróżnicowania	Niskie zróżnicowanie	9	18
	Zróżnicowanie umiarkowane–wysokie	41	82
Wiek	≥60 lat	36	72
	<60 lat	14	28
Płeć	Mężczyzna	32	64
	Kobieta	18	36
Historia palenia	Tak	25	50
	Nie	25	50

Tabela 4: Charakterystyka kliniczna i patologiczna pacjentów z NSCLC. Dane przedstawiono jako liczby (n) i procenty (%) w odniesieniu do całkowitej populacji badanej (n = 50).

Cecha kliniczno-patologiczna	Grupa	n	Ekspresja YTHDC2 (Średnia ± SD)	Wartość p
Typ tkanki	Guz	30	3.24 ± 2.34	0.537
	Sąsiednia tkanka prawidłowa	19	3.60 ± 1.70
Typ patologiczny	Gruczolakorak	26	4.13 ± 1.29	0.022*
	Raki płaskonabłonkowe	4	7.50 ± 3.41
Stopień zaawansowania według CSCO	I–II	22	4.29 ± 1.94	0.08
	III–IV	8	5.05 ± 1.51
Przerzuty do węzłów chłonnych	Nie	19	3.83 ± 0.91	0.027*
	Tak	11	5.70 ± 2.53
Zróżnicowanie histologiczne	Średnio i dobrze zróżnicowane	25	4.33 ± 1.90	0.181
	Słabo zróżnicowane	5	5.18 ± 1.60
Wiek	≥60 lat	20	4.62 ± 2.10	0.835
	<60 lat	10	4.16 ± 1.12
Historia palenia	Tak	12	4.62 ± 2.40	0.845
	Nie	18	4.38 ± 1.40

Tabela 5: Związek między ekspresją YTHDC2 a cechami kliniczno-patologicznymi u pacjentów z NSCLC. Ekspresję YTHDC2 zmierzono za pomocą qRT-PCR i obliczono metodą 2^–ΔCt, normalizując do GAPDH. Dane przedstawiono jako średnia ± odchylenie standardowe (SD). Wielkości grup (n) reprezentują liczbę analizowanych poprawnych próbek. Porównania statystyczne między grupami wykonano za pomocą testu suma rang Wilcoxona. *p < 0,05 uznano za statystycznie istotne.

Zmienna	β	Wald	wartość p	OR	95% CI
Wiek (≥60 vs <60)	0.07	0.01	0.93	1.08	0.20–5.68
Płeć (kobiety vs mężczyźni)	0.53	0.4	0.525	1.7	0.33–8.67
Wywiad w kierunku palenia (tak vs nie)	0.54	0.46	0.496	1.71	0.36–8.09
Stopień zaawansowania nowotworu (III–IV vs I–II)	3.3	7.38	0.007*	27	2.50–291.18
Zróżnicowanie (słabe vs umiarkowane–dobre)	–1.29	1.62	0.204	0.28	0.04–2.02
Ekspresja YTHDC2	0.83	4.91	0.027*	2.29	1.10–4.75

Tabela 6: Wieloczynnikowa analiza regresji logistycznej czynników związanych z przerzutami do węzłów chłonnych u pacjentów z NSCLC. Przeprowadzono binarną regresję logistyczną, przyjmując przerzuty do węzłów chłonnych jako zmienną zależną. Przedstawiono ilorazy szans (ORs) wraz z 95% przedziałami ufności (CI). Kategorie referencyjne: wiek (<60 lat), płeć (mężczyzna), historia palenia (nie), stopień zaawansowania nowotworu (I–II) oraz stopień zróżnicowania (umiarkowany–dobry). *p < 0,05 oznacza istotność statystyczną.

Dyskusja

YTHDC2, największe białko wiążące N6-metyloadenozynę (m6A) z rodziny YTH, wyróżnia się zależną od ATP aktywnością helikazy RNA, co czyni go kluczowym regulatorem metabolizmu RNA¹³. W przeciwieństwie do innych członków rodziny YTH, YTHDC2 występuje zarówno w jądrze, jak i w cytoplazmie, gdzie reguluje translację mRNA oraz stabilność RNA¹⁴. Wcześniejsze badania eksperymentalne wykazały, że YTHDC2 hamuje progresję gruczolakowca płuca (LUAD) poprzez inhibicję ekspresji mRNA ADIRF i MRPL12, zwiększenie apoptozy oraz ograniczenie proliferacji i przerzutowania komórek^15,16. Wcześniejsze badania eksperymentalne sugerowały również, że YTHDC2 stabilizuje lncRNA, takie jak ZNRD1-AS1, aby hamować proliferację LUAD, oraz moduluje mRNA z modyfikacją m6A, takie jak CYLD i SLC7A11, co hamuje szlak sygnalizacyjny NF-κB, pobieranie cysteiny i procesy antyoksydacyjne, promując jednocześnie ferroptozę i aktywność przeciwnowotworową^17,18.

W niniejszym badaniu, z wykorzystaniem zintegrowanego podejścia łączącego analizy bioinformatyczne i walidację eksperymentalną, zbadano ekspresję oraz znaczenie kliniczne białka czytającego m6A, YTHDC2, w NSCLC. Analiza bioinformatyczna baz danych TCGA i GEPIA wykazała istotną obniżoną ekspresję YTHDC2 w tkankach nowotworowych NSCLC w porównaniu z prawidłowymi tkankami płuc, a wyższa ekspresja YTHDC2 wiązała się z poprawą przeżycia całkowitego i przeżycia po progresji, co sugeruje potencjalną rolę prognostyczną. Co interesujące, nasze eksperymenty qRT-PCR z wykorzystaniem 19 dostępnych sparowanych próbek tkanki nowotworowej i przyległej tkanki prawidłowej w obecnej kohorcie nie wykazały statystycznie istotnej różnicy w ekspresji YTHDC2 między tkanką nowotworową a przyległą tkanką prawidłową. Ta rozbieżność podkreśla trudności w przenoszeniu wyników z wielkoskalowych publicznych zbiorów danych na niezależne kohorty kliniczne i akcentuje potrzebę ostrożnej interpretacji analiz in silico. Zrozumienie przyczyn tych różnic jest kluczowe dla dokładnej oceny użyteczności YTHDC2 jako biomarkera i celu terapeutycznego w NSCLC. Skupienie się w niniejszym badaniu na YTHDC2 jest uzasadnione jego unikalną aktywnością helikazy wśród czytników YTH¹⁹, jednak niedawne analizy pan-cancer ujawniają zależne od kontekstu role innych członków tej rodziny. Na przykład Li i wsp. wykazali, że YTHDF1/2 są zwiększone w większości nowotworów (np. LIHC, LUAD) i korelują ze złym rokowaniem, podczas gdy YTHDC1/2 wykazują działanie supresorowe w KIRC i BRCA²⁰. Warto zauważyć, że onkogenna rola YTHDF1 poprzez aktywację Wnt/β-catenin kontrastuje z funkcją antymetastatyczną YTHDC2 w NSCLC, co podkreśla potrzebę stosowania strategii biomarkerowych specyficznych dla danego podtypu. W porównaniu z uznanymi markerami prognostycznymi (np. PD-L1 w odpowiedzi na immunoterapię), moc predykcyjna YTHDC2 może zostać zwiększona poprzez połączenie go z innymi regulatorami m6A (np. METTL3, YTHDF1) lub genami punktów kontrolnych odporności, co sugerują analizy infiltracji immunologicznej pan-cancer. Chociaż poprzednie badania sugerują, że YTHDC2 reguluje szlak NF-κB/CYLD¹², obecne badanie było ograniczone brakiem walidacji na poziomie białka z użyciem immunohistochemii lub Western blotting, a także brakiem walidacji funkcjonalnej. Przyszłe prace powinny łączyć testy knockdown z sekwencjonowaniem m6A w celu zmapowania bezpośrednich celów.

Poprzednie analizy wykazały, że ekspresja YTHDC2 jest obniżona w tkankach NSCLC i koreluje ze złym rokowaniem²¹. Analiza Kaplana-Meiera wskazała na dłuższe przeżycie u pacjentów z wyższą ekspresją YTHDC2, jednak analiza krzywej ROC sugerowała ograniczoną moc predykcyjną w odniesieniu do przeżywalności²⁰. Analiza ROC przeżywalności w niniejszym badaniu została przeprowadzona z wykorzystaniem danych o ekspresji z RNA-seq TCGA oraz danych o przeżywalności, ponieważ informacje o długoterminowej obserwacji nie były dostępne dla naszej lokalnej kohorty klinicznej. Co istotne, niskie wartości AUC (~0,5) zaobserwowane w tym badaniu sugerują, że ekspresja YTHDC2 nie posiada wystarczającej czułości i swoistości, aby mogła być stosowana w praktyce klinicznej jako samodzielny biomarker²². Ograniczenie to jest zgodne z pojawiającymi się dowodami, że biomarkery pojedynczych genów są często niewystarczające w przypadku złożonych chorób, takich jak NSCLC, gdzie do osiągnięcia klinicznie istotnej wydajności predykcyjnej coraz częściej wymagane jest podejście multiomiczne oraz zintegrowane panele biomarkerów. Wyższą ekspresję YTHDC2 zaobserwowano w tkankach NSCLC z przerzutami do węzłów chłonnych, co sugeruje potencjalny związek między ekspresją YTHDC2 a statusem przerzutów do węzłów chłonnych w obecnej kohorcie. Chociaż różnice w ekspresji YTHDC2 zaobserwowano również pomiędzy gruczolakorakiem a rakiem плоскоkomórkowym, porównanie to należy interpretować ostrożnie, ponieważ do analizy dostępnych było tylko 4 próbek raka płaskokomórkowego, co znacznie ogranicza moc statystyczną tego porównania podgrup. Nie odnotowano istotnych różnic w stopniu zaawansowania klinicznego, stopniu zróżnicowania, wieku ani w wywiadzie palenia tytoniu, co prawdopodobnie wynika z ograniczeń badania, w tym z wielkości próby oraz jednocentrowego projektu badania. Chociaż zaobserwowany związek między obniżoną ekspresją YTHDC2 a przerzutami do węzłów chłonnych sugeruje potencjalną rolę biologiczną w NSCLC, jej słaba moc dyskryminacyjna (AUC ~0,5) oraz niespójne wykrywanie za pomocą qRT-PCR wykluczają jej zastosowanie jako samodzielnego markera klinicznego. Przyszłe badania powinny sprawdzić, czy połączenie YTHDC2 z innymi białkami związanymi z m6A poprawia wartość predykcyjną.

Analizy bioinformatyczne zasugerowały, że ekspresja YTHDC2 jest obniżona w NSCLC i może być powiązana z lepszymi wynikami leczenia pacjentów. Choć obniżoną ekspresję zaobserwowano również u pacjentów z przerzutami do węzłów chłonnych i odnotowano różnice między podtypami patologicznymi, wyniki dla tych podgrup należy interpretować z ostrożnością ze względu na ograniczoną wielkość próby, szczególnie w przypadku raka płaskonakórkowego. Wyników tych nie potwierdzono jednak w analizie qRT-PCR w naszej kohorcie klinicznej, co może odzwierciedlać różnice w charakterystyce kohorty, wielkości próby, zmienności technicznej, regulacji potranskrypcyjnej lub brak walidacji na poziomie białka. Przyszłe badania powinny zgłębić mechanizmy działania YTHDC2 w innych podtypach raka płuca poprzez eksperymenty in vitro i in vivo. Takie badania mogą pomóc w dalszym wyjaśnieniu biologicznej roli YTHDC2 i określeniu, czy posiada ona jakąkolwiek użyteczność kliniczną jako element podejścia wielomarkerowego, a nie jako samodzielny biomarker.

Ograniczenia

Niniejsze badanie posiada kilka ograniczeń. Było to retrospektywne badanie w jednym ośrodku z relatywnie małą próbą, co może ograniczać możliwość generalizacji wyników. Zastosowanie tkanek utrwalonych w formalinie i zatopionych w parafinie (FFPE) mogło wpłynąć na jakość RNA oraz czułość qRT-PCR. Ponadto oceniono jedynie ekspresję mRNA YTHDC2, a walidacja na poziomie białka za pomocą immunohistochemii (IHC) lub Western blottingu nie została przeprowadzona. Ponieważ ekspresja mRNA nie musi korelować z ilością białka ze względu na regulację potranskrypcyjną, może to częściowo wyjaśniać rozbieżność między naszymi wynikami klinicznymi a analizami baz danych publicznych. W badaniu zabrakło również danych z długoterminowej obserwacji, a analizy podgrup (np. dla raka płaskonabłonkiego) miały niewystarczającą moc statystyczną.

Kierunki przyszłych badań

Przyszłe badania powinny zgłębić mechanizmy działania YTHDC2 w NSCLC poprzez eksperymenty in vitro i in vivo, aby lepiej zrozumieć jego rolę funkcjonalną. Wymagane są wieloośrodkowe badania na większych grupach próbek w celu walidacji otrzymanych wyników i zwiększenia ich uogólnialności. Ponadto integracja YTHDC2 z innymi regulatorami związanymi z m6A oraz zmiennymi kliniczno-patologicznymi może zwiększyć jego wartość predykcyjną i prognostyczną. Niezbędne są dalsze badania z wykorzystaniem podejścia multiomicznego, w tym transkryptomiki, proteomiki i epigenomiki, aby wyjaśnić biologiczne mechanizmy leżące u podstaw dysregulacji YTHDC2. Należy również przeprowadzić walidację na poziomie białka za pomocą immunohistochemii (IHC) lub Western blottingu, aby ocenić zgodność między ekspresją mRNA a białka. Kluczowa będzie również standaryzacja przetwarzania próbek oraz technik walidacji, aby zapewnić powtarzalność i przydatność kliniczną.

Wnioski

Niniejsze badanie stanowi wstępną ocenę ekspresji YTHDC2 w NSCLC poprzez integrację analiz bioinformatycznych z kliniczną walidacją qRT-PCR. Jednakże niespójność wyników detekcji na różnych platformach analitycznych oraz ograniczona dokładność diagnostyczna (AUC ≈0,5) obecnie wykluczają jego zastosowanie jako samodzielnego biomarkera klinicznego. Chociaż analizy bioinformatyczne sugerują potencjalne znaczenie prognostyczne, niezależna walidacja kliniczna nie potwierdza jego wiarygodności w zastosowaniach diagnostycznych lub prognostycznych. Wyniki te należy interpretować z ostrożnością; wymagają one walidacji w większych kohortach wieloośrodkowych, wraz z badaniami na poziomie białka i analizami funkcjonalnymi, przed rozważeniem jakiegokolwiek zastosowania klinicznego.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Dedykowane startery i sondy	Sangon Biotech Co., Ltd., Shanghai, Chiny	Synteza na zamówienie	Sekwencje starterów i sond wymienione w Tabeli 6
DNaza I	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	DNase I (HiPure FFPE RNA Kit)	Usuwanie zanieczyszczeń DNA genomowym
Algorytm ESTIMATE	Yoshihara i in.	Pakiet R (Wersja 1.0.13)	Szacowanie czystości guza
Zestaw do ekstrakcji RNA z FFPE	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	HiPure FFPE RNA Kit (R4130-02)	Ekstrakcja RNA z tkanki FFPE
Portal danych GDC	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Pobieranie zbiorów danych TCGA
Serwer sieciowy GEPIA	Uniwersytet Pekiński, Chiny	http://gepia.cancer-pku.cn	Analiza ekspresji genów
Kaplan–Meier Plotter	Uniwersytet Semmelweisa, Węgry	https://kmplot.com	Analiza przeżywalności
Mikrowirówka	Eppendorf AG, Hamburg, Niemcy	5424 R	Procedury oczyszczania RNA
Spektrofotometr NanoDrop	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	NanoDrop 2000/2000c	Kwantyfikacja RNA
Master Mix do qPCR z sondami	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	TaqMan Universal PCR Master Mix II (4440040)	Amplifikacja ilościowa PCR
Oprogramowanie statystyczne R	R Foundation for Statistical Computing, Wiedeń, Austria	Wersja 4.4.1	Analizy statystyczne i analiza ROC
System PCR w czasie rzeczywistym	Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA	CFX Opus 96	Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym
Zestaw do odwrotnej transkrypcji	Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA	RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (K1622)	Synteza cDNA
Kolumna do oczyszczania RNA	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	HiPure Mini Column I	Kolumna do oczyszczania RNA z membraną krzemionkową
Woda wolna od RNaz	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	RNase-Free Water	Elucja RNA
Statystyka SPSS	IBM Corp., Armonk, NY, USA	IBM SPSS Statistics Wersja 27.0	Analizy statystyczne
Pakiet survivalROC	CRAN (R Foundation for Statistical Computing)	Wersja 1.0.3.1	Zależna od czasu analiza ROC
Baza danych TCGA	National Cancer Institute (NCI), NIH, USA	https://portal.gdc.cancer.gov	Publiczna baza danych genomiki nowotworów
Bufor płuczący RW1	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	Buffer RW1	Bufor płuczący do oczyszczania RNA
Bufor płuczący RW2	Magen Biotechnology Co., Ltd., Guangzhou, Chiny	Buffer RW2	Bufor płuczący do oczyszczania RNA