Artykuł metodologiczny

Protokoły efektywnego hodowania i analizy funkcjonalnej endoparazitoida Asobara japonica oraz jego żywiciela Drosophila melanogaster

DOI:

10.3791/72035

⸱

24 lipca 2026

 ,  ,  ,  , 
1Degree Programs in Life and Earth Sciences, Graduate School of Science and Technology, University of Tsukuba, 2Life Science Center for Survival Dynamics, Tsukuba Advanced Research Alliance (TARA), University of Tsukuba, 3Doctoral Program in Humanics, School of Integrative and Global Majors, University of Tsukuba

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Celem tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcjonalnej interakcji parazytoid-gospodarz w Asobara japonica i Drosophila melanogaster poprzez zoptymalizowane metody chowu, pojedynczy test infekcji jajorodności i wyciszenia genu z wykorzystaniem RNAi.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pasożytnictwo to interakcja biologiczna, w której jeden organizm wykorzystuje ciało lub zasoby innego (żywiciela), powodując znaczne uszkodzenia lub śmierć żywiciela. Wśród pasożytniczych zwierząt, błonkoskrzydłe pasożytoidy są jednym z najbogatszych gatunkowo kladów, stanowiąc prawie 20% wszystkich gatunków owadów. W szczególności, błonkoskrzydłe pasożytoidy endoparazytyczne składają jaja bezpośrednio w ciałach żywicieli i uwalniają zróżnicowaną gamę czynników jadu w celu manipulacji rozwojem, odpornością i fizjologią żywiciela. W odpowiedzi na atak osy, żywiciele próbują eliminować jaja pasożytoidów poprzez wrodzone mechanizmy odpornościowe. Jednak mechanizmy molekularne i komórkowe, za pomocą których poszczególne składniki jadu modulują biologię żywiciela i sprzyjają pomyślnemu pasożytnictwu, pozostają słabo poznane. Przedstawiamy tu standaryzowany protokół laboratoryjny do hodowli pasożytoidowej osy Asobara japonica oraz jej żywiciela Drosophila melanogaster. Dostępne są zarówno szczepy partenogenetyczne, jak i płciowe A. japonica, a szczep partenogenetyczny wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa, umożliwiając stabilne utrzymanie szczepów laboratoryjnych do analizy genomu i badań pasożytnictwa. Dla analizy funkcjonalnej genów jadu zoptymalizowano pojedynczy test infekcji składaniem jaj oraz metodę wyciszenia genu opartą na podwójnie łańcuchowej RNK. Razem, te protokoły zapewniają praktyczną ramę eksperymentalną do analizy mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-żywiciel i ułatwią przyszłe badania w dziedzinie biologii rozwoju, immunologii i fizjologii.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Pasożytnictwo to sposób życia, w którym jeden organizm wykorzystuje zasoby pokarmowe innego i jest szeroko rozpowszechnione wśród różnych taksonów. Szacuje się, że aż do połowy wszystkich znanych organizmów wykazuje pasożytnictwo w swoim cyklu życia1. Wśród pasożytów, błonkoskrzydłe pasożytoidy są szczególnie zróżnicowaną grupą, stanowiącą około 20% wszystkich owadów2. Eksploatują one szeroki zakres gatunków stawonogów, takich jak owady, pająki i roztocza, i wykazują niezwykłą różnorodność w swoich historiach życia i strategiach pasożytniczych3. Te cechy sprawiają, że błonkoskrzydłe pasożytoidy są jedną z najbardziej ewolucyjnie i ekologicznie udanych grup owadów.

Interakcje między pasożytoidami a ich gospodarzami były szeroko badane jako modele ewolucyjnych "wyścigów zbrojeń". W szczególności błonkoskrzydłe pasożytoidy endoparazytoidalne wykorzystują zróżnicowaną gamę czynników, w tym jady, wirusy symbiotyczne i teracyty4,5. Czynniki te manipulują fizjologią i rozwojem gospodarza, zapewniając tym samym pomyślny rozwój wewnątrz gospodarza. Pomimo tych postępów, mechanizmy molekularne leżące u podstaw pasożytnictwa są słabo poznane w przypadku większości gatunków pasożytoidów. Jedną z głównych ograniczeń jest ich niewielki rozmiar ciała, co utrudnia biochemiczne identyfikowanie składników jadu. Ponadto, utrzymanie pasożytoidów i ich gospodarzy z zsynchronizowanymi etapami rozwojowymi w warunkach laboratoryjnych jest technicznie trudne.

Ostatnie postęp w sekwencjonowaniu nowej generacji i innych technologiach omicznych umożliwiają teraz analizy genomowe nawet u bardzo małych gatunków pasożytoidów. Podejścia te otworzyły nowe drogi do badania uprzednio niedostępnych mechanizmów molekularnych, pozwalając na badania interakcji pasożyt-gospodarz na bezprecedensowym poziomie rozdzielczości. W tym kontekście, nasze laboratorium koncentruje się na Asobara japonica Belokobylskij (Hymenoptera: Braconidae), gatunku pierwotnie zidentyfikowanym w Japonii6,7,8. A. japonica obejmuje partenogenetyczną odmianę telytokous, w której samice produkują potomstwo bez kopulacji. Ta cecha pozwala nam na zbieranie znacznych ilości genetycznie jednorodnego DNA genomowego do sekwencjonowania całego genomu9. Ponadto, ten gatunek pasożytuje na szerokim zakresie gatunków Drosophila, w tym na modelowym organizmie D. melanogaster, który oferuje duże zalety eksperymentalne ze względu na dobrze ustalone warunki hodowli i precyzyjnie określone etapy rozwoju, umożliwiające powtarzalne testy zakażeń i dokładną kontrolę rozwoju pasożytoidów10.

Podczas pasożytnictwa A. japonica, samica osy wstrzykuje jad wraz z pojedynczym jajem do larwy muchy, w której larwa osy rośnie obok swojego gospodarza. Warto zauważyć, że A. japonica wykazuje wysoką skuteczność pasożytnictwa na gospodarzu D. melanogaster, co sprawia, że ta para pasożytoid-gospodarz jest potężnym modelem eksperymentalnym. W tym artykule opisujemy protokoły dotyczące stabilnego hodowania, testu infekcji z pojedynczym złożeniem jaj i metody tłumienia genów opartej na podwójnie łańcuchowej RNA (dsRNA) w A. japonica. Te protokoły zapewniają niezawodną ramę do badania mechanizmów molekularnych leżących u podstaw interakcji pasożyt-gospodarz.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Schematyczne przedstawienie synchronizowanej metody hodowli D. melanogaster i A. japonica przedstawiono na Rysunku 1.

1. Hodowla gospodarza muszki owocowej Drosophila melanogaster w laboratorium

  1. Utrzymuj wszystkie zwierzęta eksperymentalne w temperaturze 25 °C i 50-60% wilgotności względnej w cyklu 12:12 h światło/ciemność. Użyj szczepu typu dzikiego Oregon-R (OR) jako gospodarza dla A. japonica (Rysunek 2A).
  2. Przenieś dorosłe muchy do nowego pojemnika z pokarmem zawierającego standardowy agar z mąki kukurydzianej i drożdży (0,55% agar, Tabela 1). Oznakuj pojemnik datą przeniesienia i nazwą szczepu „OR”.
  3. Wyczyść te dorosłe muszki jeden dzień po przeniesieniu, aby zapobiec nadmiernej liczbie jaj w pokarmie. Upewnij się, że larwy potomstwa żerują na powierzchni pokarmu.
    UWAGA: Jako wskazówka, utrzymuj około 200-250 jaj na pojemnik z pokarmem (φ30×100 mm). Wyższa gęstość jaj może zmniejszać sukces pasożytowania i zwiększać zmienność w rozwoju gospodarza i os.
  4. Cztery dni po Kroku 1.2 przenieś łyżkę larw muszek (4 dni po złożeniu jaj, dAEL) do nowego pojemnika z pokarmem. Trzymaj te larwy bez narażenia na pasożytników na następne pokolenie. Ta procedura pomaga również kontrolować gęstość larw gospodarza w pojemniku.

2. Hodowla wewnątrzorganizmowego owada pasożytniczego Asobara japonicaw laboratorium

  1. Użyj partenogenetycznego szczepu Tokyo (TK) i szczepu płciowego Iriomote-jima (IR) (Rysunek 2B). Pierwszy składa się z samic, podczas gdy drugi składa się z samic i samców. Samce lądują dwa-cztery dni wcześniej niż samice. Dlatego przed przeniesieniem potwierdź obecność samic za pomocą owłosienia.
  2. Przenieś 10-20 dorosłych os bezpośrednio z pojemnika zapasowego do pojemnika zawierającego larwy muszek w 4 dAEL. Oznakuj pojemnik datą przeniesienia i nazwą szczepu „TK” lub „IR”. Utrzymuj osy w tych samych warunkach jak w Kroku 1.1.
  3. Pozwól dorosłym osom składać jaja w larwach muszek. Wyczyść te osy jeden do dwóch dni później, aby zapobiec nadmiernej pasożytności, która może prowadzić do śmierci gospodarza. Usuń dorosłe muszki, które uciekły z pasożytnictwa 10 lub więcej dni po Kroku 2.2.
  4. Dwa tygodnie po Kroku 2.2 dorosłe osy zaczynają lądować z poczwarki muszki gospodarza. Przenieś te nowo wylądowanych dorosłych os do nowego pojemnika z pokarmem z filtrem papierowym zawierającym 25% glukozę i 50 mM roztwór witaminy C. Kawałki filtra papierowego powinny być sterylizowane w 130 °C przez 2 godziny. Dostarczenie roztworu na filtrze papierowym wspomaga zachowania składania jaj i wydłuża żywotność dorosłych os. Nasze podejście do użycia witaminy C w celu zwiększenia składania jaj zostało zainspirowane obserwacjami w badaniach nad Drosophila 11.

3. Test infekcji pojedynczego składania jaj

  1. Synchronizuj etapy rozwojowe larw muszek używanych do eksperymentu infekcyjnego.
    1. Umieść dorosłe muszki w 50-ml probówce zawierającej płytkę agarową z sokiem winogronowym (3% agar) nasmarowaną świeżym pastą drożdżową i pozwól im składać jaja przez 24 godziny.
    2. Zbierz nowo wylęgające się larwy pierwszego stadium na płytce agarowej z sokiem winogronowym i przenieś je do małej probówki (12 ml) zawierającej 2-3 g pasty z pokarmem dla muszek (pokarm dla muszek zmieszanych z odpowiednią ilością wody). Do probówki umieszcza się 20-30 larw. Larwy muszek są dopuszczone do wzrostu w temperaturze 25 °C.
  2. W odpowiednim momencie przygotuj 4 cm płytkę Petriego zawierającą cienką, równomiernie rozprowadzoną warstwę pasty z pokarmem dla muszek, pokrywającą obszar o średnicy około 1,5-2,0 cm (dalej nazywaną areną testu infekcji). Oprócz areny testu infekcji, przygotuj nową małą probówkę (12 ml) zawierającą odpowiednią ilość pasty z pokarmem dla muszek. Ta probówka jest używana do hodowli larw gospodarza po teście infekcji.
  3. Zbierz larwy w odpowiedniej fazie i przenieś je do naczynia zawierającego wodę dejonizowaną (rezystywność = 15 MΩ·cm, 25 °C). Płucz larwy w naczyniu z łagodnym mieszaniem, aby usunąć resztki pokarmu z ich ciała.
  4. Po przepłukaniu delikatnie usuń nadmiar wilgoci z larw za pomocą bezstrzępowych chusteczek papierowych, ponieważ nadmiar wody zakłóca zachowania składania jaj os na

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Szczepy bezpłciowe i płciowe Asobara japonica
A. japonica jest szeroko rozpowszechniona w całej Japonii. Szczepy partenogenetyczne telitokiczne przeważają na głównych wyspach, natomiast szczepy płciowe arrenotokiczne występują na wyspach subtropikalnych, w tym na wyspach Amami-Oshima i Iriomote-jima8,12. W szczepach płciowych samce wykluwają się o kilka dni wcześniej niż samice, przez co czas przeniesienia osobników dorosłyc...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

W niniejszym badaniu stworzyliśmy wszechstronny eksperymentalny system do badania interakcji pasożytoid-gospodarz na poziomie molekularnym. Poprzez optymalizację warunków chowu, pojedynczego testu infekcji jajorodowej oraz protokołu RNAi, zapewniliśmy solidny system do funkcjonalnych badań czynników pochodzących od pasożytoidów. Platforma ta ułatwi przyszłe badania mające na celu poznanie mechanizmów, za pomocą których osy pasożytoidy manipulują rozwojem gospodarza, a także może przyczynić się do rozwoju biologicznych st...

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mamy żadnego konfliktu interesów do ujawnienia.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy chcą podziękować Kanata Tachibana, Shion Kudo, Toshiya Makino, Shunta Yorimoto, Shuji Shigenobu, Akiko Kawamura, Ari Fujinoki i Masako Iida za pomoc techniczną. Dziękujemy również wszystkim pozostałym członkom naszego laboratorium.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
50 mL tubeGreiner Bio-One210261Ocena zakażenia
1 mL syringeTERUMOSS-01TWstrzyknięcie dsRNA
AgarDaisin, Ltd.P-700Hodowla
Asnol Petri Dish φ40×13.5mmAs One Corporation1-8549-01Ocena zakażenia
Asnol Petri Dish φ55×17mmAs One Corporation1-8549-02Wstrzyknięcie dsRNA
Blue dye (Erioglaucine disodium salt)Sigma-Aldrich Co. Llc.861146-25GWstrzyknięcie dsRNA
Butyl p-HydroxybenzoateNacalai Tesque, Inc.06327-15Hodowla
CO2 pressure regulatorYAMATOSANGYOYR-507F-2Ocena zakażenia
Confocal laser scanning microscopeZeissLSM700Analiza obrazów
Corn mealSunny Maize Co., Ltd.No.4MHodowla
DAPIThermo Fisher Scientific Inc.PI62247Barwienie jąder, 1:10000
Deionized waterMillipore Inc.ZLXEV030WWOcena zakażenia
Dual-Stage Glass Micropipette PullerNarishigePC-10Wstrzyknięcie dsRNA
FijiNAhttps://fiji.scAnaliza obrazów
Filter paperAdvantecITEM 526Hodowla
Fly food vialChiyoda Science Co., Ltd.KFB-3MHodowla
Fly food vial plugChiyoda Science Co., Ltd.AS-275Hodowla
ForcepsDumont Biologie11252-20Sekcja
Freezer, -20 °CNihon FreezerGS-3120HCPrzechowywanie próbek
Freezer, -80 °CNihon FreezerCLN-52UD2Przechowywanie próbek
Glass slidesMatsunami Glass Ind., LtdS7213Ocena zakażenia
GlucoseShowa Sangyo Co., Ltd. Not availavleHodowla
KOD Plus NeoToyoboKOD-401Synteza dsRNA
IncubatorPanasonicMIR-254-PJHodowla
Ligation high Ver.2ToyoboLGK-201Synteza dsRNA
Micropipette GrinderNarishigeEG-401Wstrzyknięcie dsRNA
Mineral oilNacalai Tesque, Inc.23306-84Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject IIIDrummond Scientific Company3-000-207Wstrzyknięcie dsRNA
Nanoject Glass CapillariesDrummond Scientific Company3-000-203-G/XWstrzyknięcie dsRNA
pBluescript KS (+) plasmidNot availavleNot availavleSynteza dsRNA
pBluescript SK (-) plasmidNot availavleNot availavleSynteza dsRNA
PrimeScript reverse TranscriptaseTakara2680ASynteza dsRNA
Propionic acidNacalai Tesque, Inc.29018-55Hodowla
PROWIPEDaio Paper Corporation2-2624-02Ocena zakażenia, wstrzyknięcie dsRNA.
ReverTra Ace qPCR RT Master Mix with gDNA RemoverToyoboFSQ-301qRT-PCR
RNAiso Plus reagentTakara9108qRT-PCR
Small vial (Test tube 12 mL)SarstedtREF 58.487Ocena zakażenia
Small vial plugChiyoda Science Co., ltd.QD-S4Ocena zakażenia
SpatulaAs One Corporation6-522-02Hodowla
Square petri dishEiken Chemical Co., Ltd.64-2192-55, AW2000Wstrzyknięcie dsRNA
StereomicroscopeLeica Microsystemslvesta3 (C-Mount)Ocena zakażenia
StereomicroscopeNikon Solutions Co., Ltd.SMZ1000Wstrzyknięcie dsRNA
T7 RiboMAX Express RNAi SystemPromegaP1700Synteza dsRNA
Thermal Cycler Dice Real Time SystemTakaraTP815qRT-PCR
Thermal Cycler GeneAtlasAstelG02Synteza dsRNA, qRT-PCR
THUNDERBIRD SYBR qPCR MixToyoboQPS-201qRT-PCR
TissueLyser IIQiagenNot availavleqRT-PCR
Vitamin C, L-Ascorbic AcidNacalai Tesque, Inc.03420-65Hodowla
Welch's grape 100 juiceAsahi Soft drinks Co., Ltd.32390Ocena zakażenia
YeastAsahi Group Foods, Ltd.HB-P02Hodowla

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Biologia rozwojowaNumer 233Numer 233Warto pustaNumerosa paso ytniczapaso ytnictwointerferencja RNAwarunki hodowlitest infekcji z pojedynczym sk adaniem jaj
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły