Artykuł metodologiczny

Analiza włókien elastycznych w tkankach płuc za pomocą ilościowych analiz obrazów

DOI:

10.3791/72114

⸱

4 sierpnia 2026

 ,  ,  ,  , 
1Institute for Molecular Medicine and Experimental Immunology Bonn, University of Bonn, University Hospital Bonn, 2Institute for General Pathology, University Medical Center of the Johannes Gutenberg University Mainz, 3TRON Translational Oncology Mainz

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Przedstawiamy protokół szczegółowo opisujący przygotowanie tkanki do wizualizacji włókien elastycznych i ilościowego profilowania w tkankach płuc mysich. Ta metoda umożliwia solidną ocenę architektury tkanki, przestrzennej organizacji włókien oraz remodelacji macierzy pozakomórkowej w warunkach fizjologicznych i patologicznych.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Remodeling macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) płuc jest kluczową cechą uszkodzenia i choroby płuc. Włókna elastyczne są centralnym składnikiem ECM płuc, zapewniając odporność i odrzut niezbędne do normalnego funkcjonowania układu oddechowego, a ich uszkodzenie przyczynia się do upośledzenia mechaniki tkanki. Protokół ten opisuje solidny, powtarzalny proces przygotowania i analizy tkanki płucnej myszy, ze szczególnym uwzględnieniem wizualizowania i ilościowego profilowania włókien elastycznych. Zawiera zoptymalizowane metody przetwarzania tkanki i barwienia histologicznego w celu zachowania i wykrycia struktur elastyny. Ponadto protokół szczegółowo opisuje przepływ analizy obrazów umożliwiającej ilościową ocenę obfitości, organizacji i rozmieszczenia przestrzennego włókien elastycznych w płucach. Przepływ pracy obejmuje także estymację wektora barwnika w QuPath, dekonwolucję kolorów w Fiji/ImageJ oraz analizę obrazów opartą na TWOMBLI, umożliwiającą ilościową ocenę obfitości, rozgałęziania i złożoności sieci włókien elastycznych. W protokole zawarte są strategie pozyskiwania obrazów, wybierania obszarów zainteresowania, optymalizacji parametrów i kontroli jakości, aby zapewnić powtarzalność i zminimalizować uzależnienie od użytkownika. Korzystając z tego procesu, z powodzeniem zidentyfikowaliśmy zmiany w organizacji i architekturze sieci włókien elastycznych w płucach myszy z otyłością, co wykazuje, że metoda ta nadaje się do wykrywania przemian związanych z chorobą w macierzy zewnątrzkomórkowej. Razem, te podejścia zapewniają kompleksową ramę do badania przemian włókien elastycznych i ich wkładu w architekturę tkanki w warunkach fizjologicznych i patologicznych. Metoda ta ułatwia badanie zmian strukturalnych wywołanych przez fibroblasty i wspiera mechanizmy związane z przemianami w macierzy zewnątrzkomórkowej leżącymi u podstaw choroby płuc.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Włókna elastyczne są podstawowymi składnikami zewnątrzkomórkowej matrycy płuc (ECM), składającymi się głównie z elastyny i powiązanych białek mikrofibrylarnych, które łączą się w wysoce zorganizowane, odporne sieci1. W płucach włókna elastyczne są ułożone wzdłuż przegród pęcherzyków i struktur okołooskrzelowych, gdzie zapewniają elastyczność i odprężanie wymagane do normalnej mechaniki oddychania1,2. Jako jeden z najbardziej obficie występujących składników strukturalnych ECM w tkankach takich jak płuca, aorta i macica, ich integralność jest krytyczna dla utrzymania elastyczności tkanek1,2. Zakłócenie organizacji włókien elastycznych obserwowano w różnych chorobach płuc, w tym w fibrozie, rozedmie i przewlekłych schorzeniach zapalnych, gdzie zmieniona architektura włókien przyczynia się do upośledzenia funkcji płuc i ich właściwości mechanicznych2,3.

Matrisome płuc został niedawno scharakteryzowany, ujawniając podstawowe białka ECM, takie jak kolageny i lamininy, wraz ze składnikami związanymi z matrisomem, w tym cytokinami, regulatorami ECM i związanymi z ECM białkami (np. ligandy integrin, galektyny)4,5. Poza zapewnieniem wsparcia strukturalnego, te składniki aktywnie regulują funkcję tkanki i tworzą specjalistyczne nisze, które wspierają komórki rezydentne i migrujące6,7. Warto zauważyć, że ostatnie badania wykazały, że warunki metaboliczne, takie jak otyłość, są związane ze znaczącymi zmianami w organizacji włókien elastycznych, łącząc ogólnoustrojowe zaburzenia metaboliczne ze zmianami w architekturę ECM płuc i funkcją fibroblastów3. Te odkrycia podkreślają znaczenie rozumienia remodelacji włókien elastycznych jako dynamicznego i istotnego z punktu widzenia choroby procesu.

Konwencjonalna ocena włókien elastycznych często opiera się na jakościowej ewaluacji histologicznej, półilościowych systemach punktacji lub pomiarach obfitości elastyny, które dostarczają ograniczonej informacji dotyczącej organizacji włókien, łączności i złożoności sieci8,9. Podczas gdy te podejścia są użyteczne do wykrywania ogólnych zmian w zawartości elastyny, mogą nie uchwycić subtelnych zmian architektonicznych związanych z remodelacją tkanki. Ilościowe analizy obrazu mają potencjał do pokonania tych ograniczeń poprzez umożliwienie obiektywnej i możliwej do powtórzenia charakteryzacji sieci włókien elastycznych i ułatwienie porównań między warunkami eksperymentalnymi i badaniami. W celu zajęcia się tym, opisany tutaj protokół umożliwia zintegrowaną analizę organizacji ECM płuc ze szczególnym skupieniem na architekturze włókien elastycznych. Oprócz uznanych podejść do charakteryzacji ECM4,5, ten przepływ pracy obejmuje barwienie Elasticą i optimizowaną dla architektury tkanki płuc linię analizy obrazów opartą na TWOMBLI10. Łącząc barwienie Elasticą z ilościową analizą sieci, ten przepływ pracy wykracza poza konwencjonalną ocenę histologiczną i umożliwia szczegółową charakteryzację obfitości włókien, fragmentacji, organizacji przestrzennej i złożoności strukturalnej. Protokół jest szczególnie dobrze przystosowany do badań dotyczących fibrozy, rozedmy, remodelacji płuc związanej z otyłością, zapalnych chorób płuc, starzenia się i innych stanów charakteryzujących się remodelacją matrycy pozakomórkowej w płucach.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie eksperymenty na myszach opisane tutaj zostały przeprowadzone zgodnie z zatwierdzeniem Komitetu Etykiety Zwierząt w Nadrenii Północnej-Westfalii, Niemcy (AZ: 81-02.04.2021.A221).

UWAGA: Podczas całej procedury należy nosić odpowiednią odzież ochronną (fartuch laboratoryjny, rękawiczki, okulary ochronne).

1. Pobieranie próbek i przygotowanie tkanki płucnej myszy

UWAGA: Myszy zostały uśpione przedawkowaniem izofluranu zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi i rządowymi przed pobraniem tkanki.

  1. Ostrożnie otworzyć jamę piersiową za pomocą nacięcia środkowego, następnie przeciąć przeponę wzdłuż jej przyczepu i delikatnie ujawnić płuca.
  2. Usunąć całe płuco przez przecięcie płatów prawego i lewego razem, dbając o zachowanie całokształtu wszystkich płatów.
  3. Umieścić płaty płuc pojedynczo w 5 mL probówce zawierającej 2 mL 10% neutralnego buforowanego formalinu i inkubować przez 15–20 h w temperaturze 4 °C.
    UWAGA: Fiksacja zachowuje architekturę tkanki dla kolejnych analiz histologicznych i włókien elastycznych. Ponieważ głównym celem tego procesu było wizualizowanie i ilościowa ocena organizacji włókien elastycznych, a nie morfometryczna analiza pęcherzyków, płuca nie zostały inflacji-fiksowane przed przetwarzaniem tkanki.
    OSTRZEŻENIE: Neutralny buforowany formalin zawiera formaldehyd, który jest toksyczny, rakotwórczy i może powodować podrażnienie skóry, oczu i dróg oddechowych. Obsługiwać formalin w certyfikowanym koczu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną, w tym rękawice, fartuch laboratoryjny i okulary ochronne.
  4. Zatopić fiksowane tkanki płuc w parafinie zgodnie ze standardowym protokołem osadzania histologicznego11.
    UWAGA: Upewnić się, że doszło do całkowitego odwodnienia i infiltrowaniu parafiny, aby zachować morfologię tkanki dla kolejnych barwień. Aby zminimalizować różnorodność między próbkami i zapewnić kompatybilność w warunkach eksperymentalnych, zawsze należy używać tych samych płatów płuc dla każdej analizy. Zaleca się używanie lewego płata do histologii.
  5. Wyciąć tkankę płucną FFEP na 5–7 μm cienkie sekcje za pomocą mikrotonu i nałożyć je na standardowe szkielety szklane. Piec szkielety w temperaturze 60 °C przez 1 h przed przejściem do dalszych zastosowań. Szkielety można przechowywać w temperaturze pokojowej w wolnym od kurzu środowisku przez kilka tygodni lub w temperaturze 4 °C na dłużej.
    UWAGA: Unikać narażenia na wilgoć podczas przechowywania, ponieważ wilgotność może powodować utlenianie się parafiny i kompromitację jakości barwienia. Przechowywać szkielety w szczelnym plastikowym pudełku ze szkłami z suszarką, jeśli wymagane jest długotrwałe przechowywanie.
    Punkt przerwy: Przechowywać szkielety w temperaturze pokojowej lub 4 °C do barwienia.

2. Barwienie włókien elastycznych

  1. Wykonać barwienie Elastica (rezorcyno-fuchsynowe) na 5–7 μm osadzonych w parafinie sekcjach tkanki płucnej, aby uwidocznić włókna elastyczne wewnątrz struktur pęcherzykowych i naczyniowych.
    UWAGA: Barwić tylko tyle szkieletów, ile można obsłużyć jednocześnie, aby zapewnić spójną intensywność barwienia i powtarzalność wśród próbek.
    1. Odparafinować szkielety poprzez zanurzenie szkieletów w xylinie (zmieszane izomery) dwa razy po 5 min każdy.
      OSTRZEŻENIE: Xylin jest toksyczny i łatwopalny. Obsługiwać w kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną.
    2. Rehydratować szkielety w malejącej serii etanolu aż do 80% etanolu.
      1. Inkubować szkielet przez 3 min w temperaturze pokojowej w komorze barwnikowej wypełnionej 100% etanolem.
      2. Przenieść szkielet do świeżego 100% etanolu i inkubować 3 min w temperaturze pokojowej.
      3. Przenieść szkielet do 95% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
      4. Przenieść szkielet do 80% etanolu i inkubować przez 3 min w temperaturze pokojowej.
    3. Przenieść szkielet do nowej komory barwnikowej zawierającej roztwór resorcyn-fuchsynowy i inkubować przez 20–30 min w temperaturze pokojowej.
      UWAGA: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego można wielokrotnie wykorzystywać i jest stabilny w temperaturze pokojowej.
      OSTRZEŻENIE: Roztwór barwnika resorcyn-fuchsynowego zawiera potencjalnie niebezpieczne chemikalia, w tym stężone kwasy i barwniki, które mogą powodować podrażnienie skóry i oczu. Obsługiwać roztwór w dobrze wentylowanym obszarze lub kocu chemicznym i nosić odpowiednią odzież ochronną zgodnie z wytycznymi bezpieczeństwa instytucjonalnego.
    4. Umieścić szkielet w komorze barwnikowej pod bieżącą wodą destylowaną i myć przez 1 min.
    5. Różnicować w 95–96% etanolu:

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To protokół zapewnia ilościowe parametry sieci włókien elastycznych w różnych regionach płuc i warunkach eksperymentalnych. Analiza TWOMBLI, jak wcześniej opisano, daje parametry takie jak długość włókien, gęstość rozgałęzień, lukarnność i wymiar fraktalny do oceny macierzy pozakomórkowej10. Budując na tej podstawie, nasze podejście umożliwia kompleksową charakterystykę organizacji włókien elastycznych, pozwalając na ocenę zmian w obfitości włókien, łączności, jednolitości i złożoności strukturalnej zarówno w fizjologicznych, jak i patologicznych tkankach płuc.

W zdrowym tkance płuc włókna elastyczne tworzą długie, ciągłe i dobrze wyrównane sieci wzdłuż przegród pęcherzykowych i struktur perybroniowych. W przeciwieństwie do tego, patologiczne lub metabolicznie zmienione płuca, takie jak te u myszy otyłych, często wykazują zwiększone rozgałęzienia i większą złożoność sieci, co odzwierciedla zmiany w organizacji włókien elastycznych3. Reprezentatywne wyniki, w tym maski binarne i parametry ilościowe, są przedstawione w Rysunek 1A, B. Te wyniki mogą być zintegrowane z analizami histologicznymi i molekularnymi aby ocenić integralność ECM i stopień remodelacji3. Lukarnność i wypełnianie luk są przykładami w zdrowym tkance płuc, aby wizualizować różnice w organizacji ECM (Rysunek 1C). W połączeniu z innymi metrykami ilościowymi, te parametry uchwytują złożoność sieci i ujawniają zmiany w architekturę tkanki napędzane przez reorganizację ECM, dostarczając wgląd w odrębne wzorce remodelacji strukturalnej w obrębie sieci włókien elastycznych.

Dokładna interpretacja tych ilościowych wyników zależy krytycznie od wysokiej jakości akwizycji i przetwarzania obrazów. Optymalne warunki akwizycji lub przetwarzania, w tym słaby fokus, niejednolita iluminacja lub niedokładna ocena wektora barwnika, mogą prowadzić do rozdrobnionych lub zakłóconych masek i, w konsekwencji, niewiarygodnych ilościowych wyników (Rysunek 1D). Dlatego staranne wizualne sprawdzenie surowych obrazów i wyników segmentacji jest istotne, aby zapewnić jakość danych przed interpretacją. Optymalne maski można zazwyczaj rozpoznać przez nadmierną fragmentację ciągłych włókien, nieciągłą lub niekompletną segmentację, uwzględnienie szumu tła jako struktur włókna lub słabe nakładanie się między oryginalnym wzorem barwienia a wygenerowaną maską, wskazując na to, że akwizycja obrazu, ocena wektora barwnika lub parametry segmentacji powinny być ponownie oceniane. Aby zilustrować te cechy, sekcje z kontrabarwieniem zostały celowo przeanalizowane, co interferuje z identyfikacją włókien elastycznych i prowadzi do nieoptymalnej segmentacji. Przykład takiej maski niskiej jakości jest przedstawiony na Rysunku 1E. Aby dalej ocenić wytrzymałość i powtarzalność przepływu pracy, zestawy obrazów zostały niezależnie przeanalizowane przez dwóch badaczy przy użyciu tych samych zoptymalizowanych parametrów analizy (Rysunek 2A). Dodatkowo, próbki pochodzące od niezależnych zwierząt zostały włączone, aby ocenić zmienność biologiczną (Rysunek 2B). Porównywalne ilościowe wyniki zostały uzyskane przez różnych operatorów i replikaty biologiczne, wspierając powtarzalność i niezależność użytkownika zaproponowanego potoku analizy obrazów. Razem, te analizy pokazują, że przepływ pracy umożliwia solidną ocenę organizacji włókien elastycznych i ułatwia porównania między warunkami fizjologicznymi i patologicznymi.

figure-results-1
Rysunek 1. Przepłyk analizy barwienia Elastica. (A) Reprezentatywny surowy obraz, odizolowany sygnał włókien elastycznych uzyskany przez dekonwolucję obrazu, maska binarna wygenerowana przy użyciu TWOMBLI i nałożenie oryginalnych włókien elastycznych na odpowiadającą maskę, demonstrując dokładną segmentację. (B) Reprezentatywne parametry ilościowe wygenerowane przez analizę TWOMBLI. (C) Przykłady analiz lukarnności i wypełniania luk w zdrowym tkankach płuc myszy, aby zilustrować różnice w organizacji macierzy pozakomórkowej. (D) Ilustracja rozdrobnionej i zakłóconej maski wynikającej z nieoptymalnej akwizycji obrazu lub przetwarzania obrazu. (E) Sekcja tkanki kontrastowana hematoxyliną i eozyną, demonstrując upośledzoną identyfikację włókien elastycznych i nieoptymalne generowanie maski. Obszary pokazujące słabe nakładanie się między oryginalnym wzorem barwienia a wygenerowaną maską są zaznaczone. Skala liniowa A, D = 100 µm, E = 50 µm. Proszę kliknąć tutaj, aby zobaczyć większą wersję tego rysunku.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

To protokoll zapewnia solidny, powtarzalny proces badania architektury pozakomórkowej matrycy płucnej (ECM) u myszy, ze szczególnym skupieniem na remodelacji włókien elastycznych wywołanej przez fibroblasty. Włókna elastyczne są niezbędne dla utrzymania rozciągliwości i sprężystości płuc, a ich uszkodzenie jest charakterystyczne dla wielu chorób płuc, w tym dla zwłóknienia, uszkodzenia płuc, starzenia się i zaburzeń metabolicznych2. Pomimo ich centralnej roli funkcjonalnej, ilościowa ocena organizacji i składu włókien elastycznych pozostawała ograniczona. Proces badawczy wypełnia tę lukę, umożliwiając systematyczną i ilościową charakterystykę architektoniczną sieci włókien elastycznych.

Główną zaletą tej metody jest integracja ilościowego przepływu obrazowania z analizą histologiczną struktury. Podczas gdy konwencjonalne podejścia często oceniają skład ECM lub cechy histologiczne oddzielnie, ten protokół umożliwia obiektywne ilościowe określenie organizacji włókien elastycznych, w tym długości włókien, ich rozgałęzienia i złożoność sieci. Umożliwia to bezpośrednie porównanie między warunkami fizjologicznymi a patologicznymi i dostarcza wglądu w remodelację ECM wywołaną przez fibroblasty3.

Jednakże kilka aspektów technicznych jest kluczowych dla zapewnienia spójności eksperymentu i jakości danych. Barwienie resorcyną-fuksyną jest wrażliwe na zmienne takie jak czas fiksacji, grubość przekroju i spójność odczynników, co sprawia, że standaryzacja jest niezbędna dla powtarzalności. Ilościowe wyniki z TWOMBLI zależą od jakości obrazu, rozdzielczości i spójnego doboru regionu zainteresowania, a zatem muszą być interpretowane równolegle z oceną histologiczną i zweryfikowane na wielu próbkach. Ponadto gęstość i morfologia włókien różnią się między regionami pęcherzykowymi i okołooskrzelowymi, co wymaga optymalizacji specyficznej dla regionu. To podejście uchwytuje globalną organizację sieci włókien elastycznych w dwóch wymiarach i nie rozwiązuje cech ultrastrukturalnych, które wymagają technik wyższej rozdzielczości, takich jak mikroskopia elektronowa. Trójwymiarowe metody obrazowania, w tym mikroskopię konfokalną lub wielofotonową, mogą dodatkowo poprawić analizę geometrii i połączeń włókien.

Kilka kroków w procesie badawczym jest szczególnie kluczowych dla zapewnienia niezawodnych i powtarzalnych wyników. Fiksacja tkanki, jakość przekrojów i spójne barwienie resorcyną-fuksyną znacząco wpływają na wizualizacje włókien elastycznych i dlatego powinny być starannie standaryzowane.  Słaba intensywność barwienia, nierównomierne barwienie lub wysokie tło mogą wynikać z zmiennej jakości odczynników, niekonsekwentnych warunków barwienia lub nieodpowiedniej konserwacji tkanki. Ponadto zaleca się włączenie zdrowych i chorych tkanek płuc, kontroli technicznych barwienia oraz próbek referencyjnych przetworzonych w różnych partiach eksperymentalnych, aby monitorować spójność barwienia i solidność analityczną. Tkanki bogate we włókna elastyczne mogą ponadto służyć jako dodatnie kontrole, aby zweryfikować procedury akwizycji i segmentacji obrazów. Dokładna estymacja wektora barwnika podczas dekonwolucji obrazu jest kolejnym kluczowy krokiem, ponieważ niewłaściwy dobór wektora może prowadzić do niekompletnego wyodrębnienia włókien i fragmentarycznych masek. W zależności od pytania eksperymentalnego, proces badawczy może być zmodyfikowany przez dostosowanie wielkości i liczby ROI, adaptację parametrów przetwarzania obrazu lub integrację trójwymiarowych podejść do obrazowania, aby dalsze badać organizację włókien elastycznych.

Ogólnie rzecz biorąc, ta metoda stanowi wszechstronną platformę do badania remodelacji ECM zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych. Ponieważ integralność włókien elastycznych jest bezpośrednio związana z rozciągliwością i funkcją mechaniczną płuc, to podejście jest szczególnie ważne dla zrozumienia, jak zmiany strukturalne w ECM przekładają się na zmiany w funkcji płuc. Jest dobrze przystosowany do badania zmian strukturalnych wywołanych przez fibroblasty i zapewnia nowe możliwości lepszego zrozumienia remodelacji ECM i jej wkładu w progresję choroby i funkcję tkanki. Podejście to może również być rozszerzone na inne tkanki, w tym tkanki układu krążenia, skórę, macicę, zaburzenia tkanki łącznej, zwłknione narządy oraz ludzkie próbki, lub połączone z zaawansowanymi technikami obrazowania przestrzennego i wysokiej rozdzielczości, aby jeszcze bardziej poszerzyć jego zastosowanie.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chcielibyśmy podziękować Zakładowi Histologii Wydziału Medycznego Uniwersytetu w Bonn. Dodatkowo, wyrażamy uznanie za wsparcie dla pracy Danieli Kraus oraz całej ekipy w obiekcie badań na zwierzętach iFET. V.L.K. jest finansowany przez Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Niemiecki Fundusz Badań Naukowych) w ramach niemieckiej Strategii Doskonałości – EXC 2151 – 390873048.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Axio CS2 Slide Scanner Carl Zeiss
Coplin Glass Staining jarSigma-AldrichS6016
DPX MountantSigma-Aldrich6522
Ethanol (100%) for histologyCarl Roth9065.4
Fijihttps://imagej.net/software/fiji/wersja 1.54t
Formalin solution, neutral buffered 10%SigmaHT501128
HISTOSETTE I Tissue Processing/Embedding CassettesSigma-AldrichH0542
microtomeThermo Fischer ScietificHM355S
Micrsocope SlidesVWR631-0108
Mouse: C57BL/6JThe Jackson LaboratoryRRID: IMSR_JAX:000664Strain #:000664 
paraffin embedding systemEpredia HistoStar embedding module
Prismhttps://www.graphpad.com wersja 11
Qupathhttps://qupath.github.iowersja 0.7.0
Resorcin-FuchsinWaldeck2.00E-30
TWOMBLI pluginhttps://github.com/wershofe/TWOMBLI
XyleneApplichem GmBH14020172

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

MedycynaWydanie 234Wydanie 234Wydaniematryzom
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły