Czułość rozproszenia Ramana wzmocniona powierzchniowo i odpowiadająca na redox do monitorowania reakcji akupunktury u szczurów z upośledzoną tolerancją na glukozę

Podsumowanie

To badania eksploracyjnego modelu na szczurach przedstawiają czuły na redoks powierzchniowo wzmocniony rozproszony Ramana (SERS) - aktywną mikroigłę do jednoczesnej interwencji akupunkturowej i śledzenia proporcjonalnego indeksów SERS związanych z lokalną zdolnością utleniania i potencjałem redoks u szczurów z upośledzoną tolerancją na glukozę.

Streszczenie

Upośledzona tolerancja glukozy (IGT) wiąże się z zaburzeniem równowagi redoks i zwiększonym stresem oksydacyjnym, ale dynamiczne in vivo śledzenie zmian związanych z redoks w czasie interwencji akupunkturowej pozostaje technicznie wyzwaniem. W niniejszym badaniu opracowano czuły na redoks system mikroigieł aktywowanych ramanowskim rozpraszaniem powierzchniowym (SERS) dla jednoczesnej interwencji akupunkturowej i względnego śledzenia wskaźników SERS związanych z zdolnością utleniania (OC) i potencjałem redoks (RP) u szczurów z IGT. Czułe na stres oksydacyjny i redoks sondy SERS zostały przygotowane przez funkcjonalizację nanoskorup ze złota (GNS) z p-fenylenodianiaminą (p-PDA) dla reaktywności OC i antrachinonem dla reaktywności RP, odpowiednio. Sondy zostały załadowane do dwóch wytrawionych rowków na igłach akupunkturowych, aby skonstruować aktywne ramanowo mikroigiełki. W badaniu eksploracyjnym użyto szczurów Sprague–Dawley, samców, wolnych od specyficznych patogenów. Trzy szczury służyły jako normalne grupy kontrolne, a 20 szczurów karmiono wysokoenergetyczną dietą i otrzymywało się streptozotocyna (STZ) w celu indukcji IGT. Po przesiewaniu, 18 kwalifikujących się szczurów z IGT zostało podzielonych na grupy wysokoenergetycznej diety i normalnej diety, po 9 szczurów w każdej grupie dietetycznej. Każda grupa dyiety została dalsze podzielona na punkty akupunkturowe skręcania, punkty nieakupunkturowe skręcania i bezpośredniego wprowadzania igły akupunkturowej, po 3 szczury w każdej podgrupie. Nakaływanie było wykonywane dwa razy dziennie przez 7 kolejnych dni, a zanotowano poziom glukozy na czczo (FPG), poziom glukozy 2 h po posiłku (2hPG) oraz wskaźniki SERS związane z OC i RP. Wyniki wykazały, że nakaływanie w punktach akupunkturowych z skręcaniem było związane z niższymi wartościami FPG i 2hPG oraz zmienionymi wskaźnikami SERS związanymi z OC i RP w tym modelu szczurów z IGT. Ponieważ nie zawierały one zewnętrznych krzywych kalibracyjnych, niezależnych biochemicznych testów stresu oksydacyjnego, testów wypłukiwania sond i testów biokompatybilności, proporcje SERS należy interpretować jako względne wskaźniki optyczne związane z redoks, a nie jako bezwzględne stężenia biochemiczne lub bezwzględne wartości potencjału redoks. Te wyniki wspierają wykonalność aktywowanych ramanowo mikroigieł jako eksploracyjnej platformy przedklinicznej dla łączenia interwencji akupunkturowej z lokalnym śledzeniem SERS w szczurach z IGT.

Wprowadzenie

Upośledzona tolerancja glukozy (IGT), zmniejszenie zdolności organizmu do tolerowania glukozy, reprezentuje przejściową fazę między normalnym poziomem glukozy we krwi a hiperglikemią cukrzycową¹. IGT jest zatem kluczowym wczesnym sygnałem ostrzegawczym i odwracalnym etapem w rozwoju cukrzycy typu 2². Dane kliniczne pokazują, że około 30% populacji z IGT przejdzie do cukrzycy typu 2 w ciągu 5–10 lat³; jednak, dzięki terminowej interwencji, ten procent może być zmniejszony do mniej niż 10%⁴.

IGT jest dynamicznym i złożonym procesem, a utrzymujące się środowisko o wysokim poziomie glukozy jest kluczowym wyzwalaczem zaburzeń metabolizmu oksydacyjnego⁵. Gdy organizm przebywa w przedłużonym stanie hiperglikemii, łańcuch oddechowy mitochondriów funkcjonuje nieprawidłowo, a wskaźnik wytwarzania reaktywnych form tlenu wzrasta o 30–50%, bezpośrednio zwiększając moc utleniającą w organizmie⁶; jednocześnie, wysoki poziom cukru hamuje aktywność kluczowych enzymów, takich jak glutation reduktaza, uniemożliwiając systemowi antyoksydacyjnemu usuwanie nadmiaru reaktywnych form tlenu w odpowiednim czasie i dalsze zakłócanie równowagi utleniania i redukcji. Ponadto, IGT jest towarzyszona przez zmiany patologiczne, w tym insulinoopornością i łagodnym upośledzeniem funkcji komórek beta, prowadząc do zakresu biologicznych i biochemicznych reakcji^7,8. Wraz z ewolucją stanu redoks, te zmiany dodatkowo pogarszają zaburzenia metabolizmu glukozy i podnoszą potencjalne ryzyko powikłań cukrzycowych, w tym retinopatii, nefropatii i choroby układu krążenia^9,10. Dlatego monitorowanie zdolności utleniania (OC) i potencjału redoks (RP) u osób lub modeli zwierzęcych z IGT powinno poprawić nasze zrozumienie mechanizmów leżących u podstaw rozwoju IGT i przewodzić projektowaniu ukierunkowanych strategii terapeutycznych.

Akupunktura ma ponad 3000-letnią historię i wykazała dobrą skuteczność kliniczną w leczeniu wielu chorób¹¹. Ponadto, liczne badania eksperymentalne na zwierzętach wykazały, że akupunktura wywiera korzystny wpływ na regulację stanów stresu oksydacyjnego w modelach zwierzęcych poprzez wzmocnienie układu enzymów antyoksydacyjnych i zmniejszenie peroksydacji lipidów¹². Jako tradycyjna chińska praktyka medyczna, akupunktura wykazała również znaczące korzyści w leczeniu cukrzycy i IGT. Stwierdzono, że punkty akupunktowe Guanyuan (CV4) i Sanyinjiao (SP6) aktywizują ścieżkę SIRT1/PGC-1α w mięśniach szkieletowych, zmniejszając insulinooporność u myszy z otyłością cukrzycową¹³. Ponadto, punkty akupunktowe Tianshu (ST25) modulują aktywność neuronów hamujących glukozę zlokalizowanych w bocznej hipotalamusie i przyczyniają się do regulacji metabolizmu glikolipidowego¹⁴. Jednak większość badań nad mechanizmami akupunktury dożylnej koncentruje się głównie na układach neuromodulacyjnych, immunomodulacyjnych i żołądkowo-jelitowych, w których akupunktura może wpływać na metabolizm glukozy poprzez modulacje funkcji układu autonomicznego lub pośrednio regulować poziom glukozy we krwi poprzez zwiększenie równowagi flory jelitowej^15,16. Specyficzny mechanizm wpływu akupunktury w leczeniu IGT oraz jej wpływ na stres oksydacyjny nie zostały jeszcze głęboko zbadane i nie posiadają wsparcia eksperymentalnego.

Wzmocniona rozproszona Ramana (SERS) zapewnia dużą czułość i swoistość, co umożliwia wykrywanie szerokiej gamy analitów. Nanosondy SERS oparte na nanowłóknach optycznych¹⁷, błonach chitozańowych¹⁸ oraz poprzednie badania wykazały, że igły akupunkturowe¹⁹ mogą być wykorzystywane do wykrywania biomarkerów, neuroprzekaźników i innych aspektów biochemii komórkowej in vivo. Igły akupunkturowe, w szczególności, reprezentują obiecujące narzędzia do badań głębokich tkanek, umożliwiając minimalnie inwazyjne monitorowanie in situ z następującą analizą ex vivo. Akupunktura, jako dobrze ugruntowana metoda terapeutyczna, ma niezwykle szerokie zastosowania kliniczne. Ostatnie badania wykazały, że włókna optyczne wspierane przez SERS, opatrunki ranne i urządzenia mikronigielkowe mogą wspierać in situ lub minimalnie inwazyjne śledzenie sygnałów związanych z redoksem w biologicznie istotnych ustawieniach^20,21. Równolegle, aktywne w SERS igły akupunkturowe i powiązane systemy mikronigielkowe pojawiły się jako obiecujące nośniki do integracji zdolności wykrywania z interwencją w tkankach¹⁹, co skutkuje mikronigielkami aktywnymi w SERS z in vivo odpowiedzią i moż

Protokół

Zwierzęta i modele IGT

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Komitet Etykę Zwierząt Instytutu Badawczego Uniwersytetu Południowo-Wschodniego w Suzhou (numer zgody SEU-IACUC-20250318007) i przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi wytycznymi dotyczącymi opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi. Szczury uzyskano i przetrzymywano w warunkach swobodnych od specyficznych patogenów (SPF) w temperaturze 25 °C z cyklem 12 h światła/12 h ciemności. W przypadku procedur wymagających znieczulenia, szczury były znieczulone za pomocą izofluranu dostarczanego w tlenie przez komorę indukcyjną i utrzymywane za pomocą maski nosowej. Izofluran był stosowany w stężeniu 3% do indukcji i 1% do podtrzymania znieczulenia, przy czym stężenie było dostosowywane według częstości oddechu i reakcji na procedurę.

Właściwą głębokość znieczulenia potwierdzono przed nakłuciem lub wstrzyknięciem poprzez utratę odruchu prawidłowego położenia ciała i brak reakcji na ściśnięcie palca. Podczas znieczulenia monitorowano wzorzec oddechu, pozycję ciała i odzyskiwanie, a zwierzęta umieszczano na podgrzewanej poduszce, aby utrzymać temperaturę ciała. Zwierzęta przetrzymywano po 2 w klatce z wolnym dostępem do pokarmu i wody, chyba że wymagano postu na potrzeby testu glukozy. Po przybyciu szczury były aklimatyzowane przez 1 tydzień przed indukcją modelu. Dobrostan zwierząt było monitorowane codziennie, w tym ogólną aktywność, pielęgnację, przyjmowanie pokarmu, wagę ciała, stan miejsca wstrzyknięcia i odzyskiwanie po znieczuleniu. Na koniec badania szczury zostały poddane eutanazji zgodnie z zatwierdzonym protokołem dotyczącym zwierząt. Eutanazję przeprowadzano poprzez stopniowe wypełnianie CO₂, po czym potwierdzono śmierć za pomocą metody dyslokacji szyjnej. Zwierzęta, które spełniały kryteria humanitarnego punktu końcowego, w tym ciężką utratę masy ciała, uporczywą nieruchomość, nieprawidłowe oddychanie, niemożność jedzenia lub picia lub ciężki dystres, były eutanatyzowane natychmiast, zamiast być utrzymywane do zaplanowanego punktu końcowego. W badaniu zastosowano samce szczurów Sprague'a-Dawleya o stopniu czystości swobodnej od specyficznych patogenów o wadze 200 ± 20 g. Po 1 tygodniu aklimatyzacji szczury losowo przydzielono do dwóch grup: trzy szczury w grupie normalnej karmiono normalnym pokarmem, podczas gdy 20 szczurów w grupie modelowej karmiono pokarmem wysokotłuszczowym (50% pokarmu podstawowego + 10% smalcu + 25% sacharozy + 15% proszku żółtkowego) przez 3 tygodnie. Zwierzęta w grupie modelowej otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie 20 mg/kg 2% roztworu STZ (rozpuszczonego w buforze cytrynowym 0,1 mol/L, pH 4,4) przez 12 h, po 12-godzinnym poście bez ograniczeń wodnych. Szczury w grupie normalnej otrzymały dootrzewnowe wstrzyknięcie odpowiedniej dawki buforu cytrynowego po karmieniu normalnym pokarmem. Test tolerancji glukozy dootrzewnowej (IPGTT) przeprowadzono 1 tydzień później. Reagenty i sprzęt użyty w badaniu są wymienione w Tabeli materiałów.

Glikemię na czczo (FPG) mierzono pobraniem krwi z końca ogona szczurów z każdej grupy po 12-godzinnym poście bez ograniczeń wodnych, a glikemię po 2 godzinach (2hPG) rejestrowano po dootrzewnym wstrzyknięciu 20% dekstryzy 2 g/kg. W grupie normalnej zakres FPG wynosił 5,1–6,6 mmol/l, a zakres 2hPG glukozy 7,3–9,4 mmol/l, w porównaniu z FPG ≤ 7,0 mmol/l i zakresem 2hPG 10–16 mmol/l w grupie modelowej. Wśród 20 szczurów przydzielonych do indukcji modelu IGT, 18 spełniło zdefiniowane kryteria IGT po IPGTT i zostało włączonych do dalszego eksperymentu interwencyjnego. Dwa szczury zostały wykluczone, ponieważ ich wartości FPG lub 2hPG wypadły poza zdefiniowany zakres IGT. 18 kwalifikujących się szczurów zostało następnie losowo przydzielonych do grupy z wysokotłuszczową dietą i grupy z dietą normalną, po 9 szczurów w każdej grupie. Każda grupa dietetyczna została następnie podzielona na trzy podgrupy: skręcanie punktu akupunkturowego, skręcanie punktu niebędącego punktem akupunkturowym i bezpośrednie wprowadzenie igły w punkt akupunkturowy, po 3 szczury w każdej podgrupie. Było to eksploracyjne badanie nad rozwojem metody, mające na celu ocenę wykonalności połączenia interwencji akupunkturowej z śledzeniem ratiometrycznym opartym na SERS w przedklinicznym modelu szczurów z IGT. Nie przeprowadzono formalnego obliczenia mocy statystycznej. Wielkość podgrupy trzech szczurów wybrano na podstawie wykonalności, wstępnych badań SERS-mikroigiełkowych i zasady ograniczenia liczby zwierząt. Szczury losowo przydzielano do grup eksperymentalnych; formalne ukrycie alokacji i zaślepienie nie zostały przeprowadzone.

Protokoły leczenia akupunkturą przesiewano w oparciu o dowody wskazujące na kliniczne praktyki w medycynie tradycyjnej chińskiej i wykonalność eksperymentów na zwierzętach²². Wybrane punkty akupunkturowe to Zhongwan (RN12/

Wyniki

Wytwarzanie mikroigieł aktywnych w SERS do detekcji OC i RP

W celu zidentyfikowania zmian w OC i RP wykonano mikroigły aktywne w SERS zawierające odpowiednie sondy. Reprezentatywne obrazy SEM potwierdziły dwukanalikową strukturę mikroigieł aktywnych w SERS. Rycina 2A przedstawia korpus igły do akupunktury z dwoma wytrawionymi kanalikami, Rycina 2B pokazuje kanalik wypełniony GNS, a Rycina 2C

Dyskusja

Upośledzona tolerancja glukozy reprezentuje odwracalny etap przejściowy przed cukrzycą typu 2 i jest ściśle związana z dysfunkcją metaboliczną, opornością na insulinę oraz dysregulacją związaną ze stresem oksydacyjnym. Interwencja w stylu życia i inne wczesne strategie terapeutyczne mogą zmniejszyć ryzyko progresji z upośledzoną tolerancją glukozy do cukrzycy, ale narzędzia do dynamicznego monitorowania lokalnych reakcji biochemicznych podczas interwencji pozostają ograniczone³⁰. Akupunktura była ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
3-Aminopropyltriethoxysilane (APTES, 98%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A800524
(3-Merkaptopropyl)trimetoksysilan (MPTES, 95%)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	M742544
Kwas askorbinowy	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CFAD310554
Glichometr	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe A03
Paski testowe do glukometrów	Cofoe Medical Technology Co., Ltd.	Cofoe-A03-C
Siarczan miedzi (CuSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	PHR1477
Alkohol etylowy (≥99,7%)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW00641752
Siarczan żelaza(II) (FeSO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	XW01772078701
Glukoza (Glu)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	D9434
Nadtlenek wodoru (H2O2)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	P-17-0500
Chlorku żelaza(III) (FeCl3)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	CP81015228
Metakrylan metylu (MMA)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	M109626
Mikroskop ramanowski	Renishaw	InVia Raman Microscope
p-Fenylenodiamina (p-PDA)	Shanghai TCI Chemical Industry Development Co., Ltd.	P128784
Polimetakrylan metylu (PMMA)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	P742581
Mikroskop elektronowy	Zeiss	ULTRA Plus
Boranek sodu (NaBH4)	Shanghai Adamas-beta Reagents Co., Ltd.	S432207
Siarczan sodu (Na2SO4)	Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd.	S572396
Igły akupunkturowych ze stali nierdzewnej	Suzhou Tianxie Acupuncture Instruments Co., Ltd.	X-20-03
Oprogramowanie do analizy statystycznej	International Business Machines Corporation	Wersja 2021
Streptozotocyna (STZ)	Shanghai Aladdin Bio-Chem Technology Co., Ltd.	S408311
Kwas tetrachlorozłotowy (HAuCl4)	Tianjin Heowns Bio-Chemical Technology Co., Ltd.	A124024
Oprogramowanie SPSS	International Business Machines Corporation, Armonk, Nowy Jork, USA	wersja 26.0
szczury	Jiangsu Qinglongshan Biotechnology Co., Ltd.	Specific-pathogen-free male Sprague-Dawley
karma podstawowa	Anuokang Biotech.	SY10001
Tłuszcz wieprzowy	MCE	HY-W127601
Sakcharoza	MCE	HY-B1779
Proszek żółtka	MCE	HY-B2235B
Cytrynian wodny	Sigma-Aldrich	C1909
Cytrynian trójnatronowy dwuwodorowy	Sigma-Aldrich	S4641
Bufor cytrynianowy	beyotime	P0086
Bufor fosforanowy	beyotime	ST448-1L
Izofluran	Bioss	D54468
System znieczulenia izofluranem dla małych zwierząt	RWD Life Science	R500
Izba indukcyjna i korek nosowy	RWD Life Science	R500compatible accessories
Podgrzewana podkładka	Shanghai Yuyan Life Science	Y69020
75% etanol	Boyu Bio.	YB60401
Komora do eutanazji CO2	Lab Animal Tec. Co.	LAT-10-0090
WPS	Beijing Kingsoft Office Software	WPS365