Zoptymalizowany protokół modelu stenozy zastawki aortalnej indukowanej prowadnicą u myszy

Podsumowanie

Niniejszy protokół szczegółowo opisuje zoptymalizowany model stenozy zastawki aortalnej indukowanej drutem prowadzącym u myszy C57BL/6. Specjalistyczna, wydrukowana w technologii 3D platforma wspierająca naczynia umożliwia precyzyjną kontrolę krwotoku, co przekłada się na 95% przeżywalność w ciągu 24 godzin (19/20) oraz 90% ogólnej skuteczności modelu po 4 tygodniach (18/20).

Streszczenie

Stenoza zastawki aortalnej (AVS) jest istotną chorobą układu sercowo-naczyniowego o rosnącej rozpowszechnieniu w starzejących się populacjach, jednak niedobór tkanek chorobowo zmienionych zastawek poważnie ogranicza badania nad mechanizmami choroby oraz rozwój terapii. Niniejszy protokół ustanawia i optymalizuje powtarzalny model AVS u myszy, udoskonalając metodę uszkodzenia zastawki indukowanego drutem prowadzącym według Hondy poprzez kontrolowane zarządzanie krwotokiem. Samce i samice myszy C57BL/6 zostają poddane procedurze uszkodzenia zastawki aortalnej drutem prowadzącym; procedura ta została ulepszona dzięki zastosowaniu specjalnie wydrukowanej w technologii 3D platformy wspierającej naczynia, która zapewnia precyzyjną kontrolę krwotoku podczas wprowadzania i wycofywania drutu. Mierniki wyników obejmują przeżywalność po 24 h, ocenę echokardiograficzną po 4 tygodniach oraz walidację histopatologiczną. Zoptymalizowany protokół pozwala osiągnąć 95% przeżywalność po 24 h (19 z 20 zwierząt); wśród osobników, które przeżyły, 94,7% (18 z 19) spełnia zdefiniowane kryterium sukcesu hemodynamicznego po 4 tygodniach, co daje ogólną skuteczność modelu na poziomie 90% (18 z 20 zwierząt), potwierdzoną badaniem echokardiograficznym i analizą histologiczną. Ten zstandaryzowany model stanowi niezawodną i powtarzalną platformę do badania mechanizmów degeneracji zastawek oraz oceny potencjalnych interwencji terapeutycznych.

Wprowadzenie

Choroby zastawek serca pozostają znacznym obciążeniem dla systemów opieki zdrowotnej zarówno w krajach rozwiniętych, jak i rozwijających się, a ich rozpowszechnienie rośnie równolegle ze starzeniem się populacji¹. Chociaż przezcewnikowa implantacja zastawki aortalnej (TAVI) odmieniła leczenie ciężkiej stenozy aortalnej^2,3, mechanizmy komórkowe i molekularne napędzające degenerację zastawek są wciąż nie w pełni zrozumiane, a nie istnieje żadna zatwierdzona terapia farmakologiczna pozwalająca spowolnić lub odwrócić postęp choroby^4,5. Główną przeszkodą w badaniach nad chorobami zastawek jest ograniczona dostępność zmienionej chorobowo tkanki do analiz^6,7. Próbki ludzkich zastawek aortalnych są trudne do pozyskania w wystarczającej ilości, a modele zwierzęce, które wiarygodnie odtwarzają patologiczne zmiany w zastawkach, są równie rzadkie⁸. Ta luka skłoniła do podjęcia trwałych wysiłków w celu opracowania modeli zwierzęcych, które odtwarzają hemodynamiczne i histologiczne cechy stenozy zastawki aortalnej (AVS).

Konwencjonalne podejścia dietetyczne, takie jak długotrwałe podawanie diety wysokotłuszczowej myszom ApoE⁻/⁻, wymagają 20–24 tygodni i charakteryzują się niską skutecznością, gdyż tylko u niewielkiej części zwierząt rozwija się wyraźny fenotyp stenozy^9,10,11,12. Model uszkodzenia zastawki indukowany drutem prowadzącym, opisany przez Hondę i współpracowników, rozwiązał wiele z tych problemów poprzez mechaniczne uszkodzenie płatków zastawki drogą dostępu przez tętnicę szyjną¹³. Oryginalna technika obejmuje preparację tętnicy szyjnej, wsteczne wprowadzenie drutu prowadzącego do zastawki aortalnej, wielokrotne drapanie płatków oraz rotację drutu — co powoduje szybkie zmiany hemodynamiczne w ciągu kilku dni i wytworzenie stabilnego fenotypu stenozy do 4 tygodnia^13,14,15,16. Ze względu na relatywną szybkość i bezpośredniość, metoda Hondy została szeroko przyjęta w aktualnych badaniach nad zastawkami. Niemniej jednak nadal istnieją pewne istotne luki. Pełne szczegóły procedury nie zostały w pełni udokumentowane w literaturze, brakuje standaryzacji między laboratoriami, a rola kontroli krwotoków — główny czynnik determinujący zachorowalność okołooperacyjną w tym modelu — nigdy nie została systematycznie omówiona. Niespójności te obniżają powtarzalność i ograniczają możliwości translacji klinicznej.

Postawiono hipotezę, że systematyczna optymalizacja kontroli krwotoku może znacząco poprawić przeżywalność okołoperacyjną i niezawodność modelu. Niniejszy protokół przedstawia dopracowane i ustandaryzowane podejście, rozwijające metodę Hondy poprzez wprowadzenie specjalnie zaprojektowanej, wydrukowanej w technologii 3D platformy wsparcia naczyniowego. Urządzenie to umożliwia regulację napięcia podłużnego tętnicy szyjnej, zapewniając całkowitą tymczasową hemostazę podczas wprowadzania i wycofywania drutu prowadzącego, bez zmiażdżenia naczynia. Dzięki temu podejściu zoptymalizowany protokół pozwala osiągnąć 95% przeżywalność po 24 h (19 z 20 zwierząt); wśród osobników przeżyłych 94,7% (18 z 19) spełnia zdefiniowane wcześniej kryterium sukcesu hemodynamicznego w 4 tygodniu, co daje ogólną skuteczność modelu na poziomie 90% (18 z 20 zwierząt). Szczegółowa dokumentacja procedury krok po kroku została udostępniona w celu ułatwienia powtarzalności badań w różnych laboratoriach.

Protokół

UWAGA: Wszystkie procedury z udziałem zwierząt opisane w niniejszym protokole zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Guide for the Care and Use of Laboratory Animals i zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) szpitala West China Hospital (protokół nr 20240311055). W całym badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; około 22–25 g) oraz samice myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; około 18–20 g). Wszystkie materiały, odczynniki, instrumenty, oprogramowanie i urządzenia specjalistyczne użyte w tym protokole, w tym customowa platforma do podtrzymywania naczyń wydrukowana w technologii 3D, wyszczególniono w Tabeli Materiałów.

1. Przygotowanie przedoperacyjne i cięcie chirurgiczne

1. Zanestezuj mysz izofluranem (3% do indukcji, 1,5–2% do podtrzymania) odparowanym w 100% tlenie. Potwierdź odpowiednią głębokość znieczulenia, weryfikując brak odruchów wycofania kończyny (ścisknięcie palca).
   UWAGA: Izofluran jest anestetykiem lotnym. Stosuj go przy aktywnym odsysaniu gazów lub w dobrze wentylowanym pomieszczeniu, używaj odpowiednich środków ochrony osobistej i przestrzegaj instytucjonalnych procedur bezpieczeństwa.
2. Nałóż maść okulistyczną do obu oczu. Umieść mysz w pozycji na plecach na platformie chirurgicznej z regulacją temperatury utrzymywaną na poziomie 37 °C.
3. Przygotuj pole operacyjne, usuwając włosy z przedniego odcinka szyi za pomocą chemicznego kremu do depilacji.
4. Zdezynfekuj skórę, wykonując trzy naprzemienne cykle przemywania povidone-jodem (lub chlorheksydyną) i 70% alkoholem (lub ciepłą jałową solą fizjologiczną), kończąc działanie środkiem antyseptycznym.
5. Wprowadź podskórnie 0,5% lidokainę wzdłuż planowanej linii nacięcia w celu wyprzedzającego znieczulenia miejscowego.
6. Następnie, używając mikronożyczek, wykonaj podłużne nacięcie skóry w linii środkowej (około 1,0–1,5 cm) na przedniej części szyi, przesunięte lekko na prawo od linii środkowej tchawicy.
   UWAGA: Mikronożyczki, igły, prowadnice i inne narzędzia ostre mogą spowodować obrażenia. Należy z nimi obchodzić się ostrożnie i utylizować zużyte materiały ostrymi w zatwierdzonych pojemnikach na odpady medyczne.

2. Izolacja naczynia i umieszczenie szwów

1. Pod chirurgicznym stereomikroskopem odsłoń prawą wspólną tętnicę szyjną (RCCA) poprzez tępe rozczłonkowanie nadkładających warstw powięzi i mięśni. Ostrożnie oddziel RCCA od sąsiedniego nerwu błędnego i otaczającej tkanki łącznej, dbając o to, aby uniknąć mechanicznego podrażnienia nerwu błędnego.
   UWAGA: Przez cały czas trwania procedury utrzymuj ślinianki i odsłonięte tkanki w wilgotności, przemywając je ciepłą sterylną solą fizjologiczną, aby zapobiec wysychaniu.
2. Podwiąż trwale dystalny koniec RCCA za pomocą nici jedwabnej 6-0, wiążąc ją w bezpieczny, nieprzesuwający się węzeł.
3. Załóż luźny pętelkowy węzeł z nici jedwabnej 6-0 wokół proksymalnego odcinka RCCA, pozostawiając go niezaciśniętym do późniejszego użycia podczas wprowadzania drutu prowadzącego.

3. Aplikacja platformy i arteriotomia

UWAGA: Przed operacją należy wysterylizować platformę wydrukowaną w technologii 3D za pomocą tlenku etylenu (EtO), a następnie odpowiednio ją napowietrzyć, natomiast wszystkie metalowe narzędzia chirurgiczne należy wysterylizować w autoklawie.

OSTROŻNIE: Tlenek etylenu jest toksyczny, łatwopalny i rakotwórczy. Sterylizację EtO należy przeprowadzać wyłącznie w zatwierdzonych placówkach, zapewniając odpowiednie napowietrzanie i przestrzegając instytucjonalnych procedur utylizacji odpadów.

1. Ostrożnie wprowadź wydrukowaną w technologii 3D platformę wspierającą naczynia pod izolowany odcinek RCCA, pozycjonując odwrócony wierzchołek w kształcie litery V bezpośrednio pod naczyniem.
2. Powoli dostosuj położenie platformy, aby zwiększyć napięcie podłużne RCCA, zapinając wcześniej umieszczone szwy w progresywnie wyższych wycięciach bocznych.
   UWAGA: Odwrócony wierzchołek w kształcie litery V został zaprojektowany pod kątem 120°, aby dopasować się do krzywizny naczynia bez miażdżenia jego ściany. Zaprzestań zwiększania napięcia w momencie, gdy pulsacja tętnicza przestanie być widoczna. Ten krytyczny punkt końcowy zapewnia tymczasową hemostazę bez nadmiernego uszkodzenia naczynia.
3. Za pomocą mikronoopcinek wykonaj małą poprzeczną arteriotomię (około połowy obwodu naczynia) na ustabilizowanym odcinku RCCA. Jeśli napięcie zostało prawidłowo ustawione, nie powinno dojść do krwawienia lub powinno być ono minimalne.

4. Wprowadzenie drutu prowadzącego i uszkodzenie zastawki

1. Pod kontrolą mikroskopową wprowadzić drut prowadzący (średnica 0,014 inch / 0,36 mm) do światła tętnicy poprzez poprzeczną arteriotomię w kierunku wstecznym, w stronę korzenia aorty.
   UWAGA: Kaliber ten jest standardowy dla opublikowanych modeli uszkodzeń drutem prowadzącym i odpowiada średnicy światła mysiej RCCA (~0,4–0,5 mm), co daje stosunek drutu do naczynia na poziomie około 0,7–0,9.
   OSTRZEŻENIE: Drut prowadzący może przebić naczynia lub otaczające tkanki. Przesuwać go powoli pod kontrolą wizualną, a zużyte druty utylizować jako odpady ostry lub skażone odpady chirurgiczne.
2. Zaciągnąć wcześniej umieszczony proksymalny węzeł poślizgowy wokół naczynia i drutu prowadzącego, aby uzyskać pełną hemostazę w miejscu wprowadzenia. Po zabezpieczeniu węzła poślizgowego ostrożnie usunąć platformę wydrukowaną w 3D spod naczynia.
   UWAGA: W przypadku wystąpienia nieoczekiwanego krwawienia podczas wprowadzania lub jeśli średnica drutu powoduje nadmierne tarcie, tymczasowo przywrócić pozycję platformy, aby wspomóc hemostazę, lub lekko zmniejszyć napięcie platformy, aby pozwolić na rozszerzenie światła naczynia przed ponowną próbą wprowadzenia.
3. Ostrożnie przesunąć drut prowadzący w kierunku wstecznym przez RCCA, poza łuk aorty i w stronę zastawki aortalnej. Pod kontrolą echokardiograficzną w czasie rzeczywistym potwierdzić, że końcówka drutu prowadzącego przeszła przez zastawkę aortalną i weszła do lewej komory.
4. Przy całkowicie zaciągniętym proksymalnym węźle poślizgowym w celu utrzymania hemostazy, przeprowadzić mechaniczne uszkodzenie zastawki, wykonując 100 ruchów posuwisto-zwrotnych przez zastawkę aortalną, a następnie 100 ruchów obrotowych drutu prowadzącego przeciwko płatkom zastawki.
   UWAGA: Wykonanie 100 ruchów posuwisto-zwrotnych i 100 ruchów obrotowych ustalono w drodze szerokiej optymalizacji wewnętrznej jako liczbę najlepiej balansującą czas procedury z niezawodną indukcją hemodynamicznie istotnej stenozy.

5. Wycofanie drutu prowadzącego i zamknięcie rany

1. Po zakończeniu uszkodzenia zastawki powoli wycofaj drut prowadzący z naczynia.
2. Bezzwłocznie przekształć proksymalny supeł przesuwny w trwały węzeł nieprzesuwny, aby podwiązać proksymalną prawą wspólną tętnicę szyjną (RCCA) i zapobiec krwawieniu po zabiegu.
3. Zamknij nacięcie skóry za pomocą przerywanych szwów nylonowych 5-0 lub chirurgicznych klipsów do ran.
4. Nie podawaj pooperacyjnych niesteroidowych leków przeciwzapalnych (NLPZ). Nie podawaj antybiotyków okołooperacyjnych, ponieważ procedura jest wykonywana w warunkach aseptycznych.
5. Przenieś zwierzę do czystej, ogrzewanej klatki pooperacyjnej i monitoruj je w sposób ciągły aż do pełnego powrotu zdolności poruszania się.

6. Echokardiograficzna ocena hemodynamiki przezwalwularnej

1. Przeprowadzić oceny echokardiograficzne u wszystkich przeżyłych myszy w 4. tygodniu po operacji w celu oceny stopnia stenozy zastawki aortalnej.
2. Zindukować znieczulenie, umieszczając zwierzę w komorze indukcyjnej z 3% izofluranem w 100% tlenie. Potwierdzić głębokość znieczulenia poprzez weryfikację utraty odruchów wycofywania łapy. Wyepilować przednią ścianę klatki piersiowej za pomocą chemicznego kremu do usuwania włosów. Nałożyć maść oftalmiczną do obu oczu, aby zapobiec wysychaniu rogówki.
3. Przenieść znieczuloną mysz w pozycji grzbietnej na platformę obrazującą z regulacją temperatury.
4. Przymocować łapy do powierzchniowych elektrod elektrokardiograficznych (ECG) w celu ciągłego monitorowania częstości akcji serca. Titrować stężenie izofluranu (zazwyczaj 1,0–1,5%), aby utrzymać stabilną fizjologiczną częstość akcji serca na poziomie 450–550 uderzeń na min.
5. Oczyścić przednią ścianę klatki piersiowej i nałożyć obfitą warstwę uprzednio podgrzanego żelu sprzęgającego.
6. Nabywanie obrazów w trybie B
   1. Używając systemu ultradźwiękowego Vevo 3100 z przetwornikiem MX550D (40 MHz), nacisnąć przycisk B-Mode, aby rozpocząć dwuwymiarowe obrazowanie w czasie rzeczywistym.
   2. Ustawić przetwornik w pozycji lewostronnej przymostkowej, aby uzyskać widok długiej osi przymostkowej lewej komory, zastawki aortalnej i aorty wstępującej. Zoptymalizować głębokość, szerokość i wzmocnienie 2D.
7. Nabywanie obrazów w trybie M i pomiary lewej komory
   1. Z widoku długiej osi przymostkowej nacisnąć przycisk M-Mode. Ustawić linię próbkowania w poprzek lewej komory na poziomie mięśni brodawkowatych.
   2. Nacisnąć Start, aby rozpocząć akwizycję. Po uzyskaniu stabilnego zapisu obejmującego co najmniej trzy cykle kardiologiczne, nacisnąć Save.
   3. W programie Vevo LAB użyć narzędzia LV Trace do obrysowania wsierdzia w końcowej rozkurcz i końcowej skurczu, a następnie zapisać wewnętrzne wymiary lewej komory, grubość ściany przedniej i tylnej (LVAWd, LVPWd) oraz masę lewej komory.
8. Zmienić położenie i kąt przetwornika, aby uzyskać dedykowany widok łuku aorty.
   ​UWAGA: Uzyskanie tego konkretnego widoku łuku aorty jest niezbędne do dokładnych pomiarów prędkości przezwalwularnej, ponieważ zapewnia optymalne wyrównanie wiązki ultradźwięków z kierunkiem przepływu krwi przez zastawkę aortalną.
9. Ocena w trybie kolorowego Dopplera
   1. Z widoku łuku aorty nacisnąć przycisk Color. Ustawić pole kolorów nad zastawką aortalną i proksymalną częścią aorty wstępującej.
   2. Dostosować skalę kolorów i wzmocnienie tak, aby jet skurczowy był wyraźnie widoczny bez aliasingu. Nacisnąć Start, a następnie Save.
10. Pomiar prędkości w trybie Dopplera impulsowego
    1. Nacisnąć przycisk PW Doppler. Ustawić bramkę objętości próbkowania w najwęższym punkcie jetu (vena contracta) i zastosować korekcję kąta (<60°).
    2. Nacisnąć Start, aby rozpocząć zapis spektralny; po zarejestrowaniu co najmniej trzech cykli kardiologicznych nacisnąć Save. W programie Vevo LAB zmierzyć szczytową prędkość przezwalwularną za pomocą narzędzia Peak Velocity, wyliczając średnią z co najmniej trzech cykli.

7. Przetwarzanie histologiczne i barwienie korzenia aorty

1. Po ocenie echokardiograficznej należy potwierdzić głęboką anestezję, weryfikując całkowity brak odruchu wycofania kończyny dolnej. Przeprowadzić zwichnięcie szyi jako drugą metodę eutanazji, zgodnie z wytycznymi AVMA dotyczącymi eutanazji zwierząt (wydanie z 2020 r.) oraz zatwierdzonymi protokołami instytucjonalnymi.
   OSTROŻNIE: Trupy zwierząt, wycięte tkanki i materiały zanieczyszczone krwią stanowią odpady biologiczne/zwierzęce. Należy je utylizować zgodnie z instytucjonalnymi przepisami dotyczącymi bezpieczeństwa biologicznego i zasadami funkcjonowania zapleczy dla zwierząt.
2. Wykonać torakotomię za pomocą chirurgicznych nożyczek mikrochirurgicznych w celu odsłonięcia serca.
3. Wprowadzić igłę perfuzyjną do wierzchołka lewej komory i przepłukać krążenie systemowe zimnym, sterylnym roztworem soli fosforanowej (PBS). Prawidłową perfuzję sygnalizuje bladość wątroby i płuc.
4. Wyciąć nienaruszone serce i zanurzyć je w 4% paraformaldehydzie (PFA) w temperaturze pokojowej na minimum 24 h, aby zapewnić całkowitą fiksację.
   OSTROŻNIE: Paraformaldehyd jest toksyczny i drażniący. 4% PFA należy obsługiwać w dygestorium z zastosowaniem odpowiednich środków ochrony indywidualnej, a odpady z PFA utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
5. Przenieść utrwaloną tkankę do automatycznego procesora tkanek w celu sekwencyjnego odwadniania w szeregu stężeń etanolu, a następnie przejrzystania ksylenem i infiltracji woskiem parafinowym w 65 °C.
   OSTROŻNIE: Ksylen jest łatwopalny i toksyczny, a gorąca parafina może spowodować oparzenia. Ksylen należy obsługiwać w dygestorium lub zatwierdzonym procesorze, a odpady zawierające ksylen utylizować jako niebezpieczne odpady chemiczne.
6. Zatopić przetworzone serca w blokach parafinowych.
   UWAGA: Prawidłowa orientacja serca podczas zatapiania jest krytyczna. Ułożyć serce tak, aby umożliwić przekroje poprzeczne przez pierścień aorty na poziomie trzech płatków zastawki.
7. Za pomocą mikrotomu obrotowego wykonać seryjne przekroje poprzeczne o grubości 4–5 µm przez płaszczyznę zastawki aortalnej, upewniając się, że wszystkie trzy płatki zostały uchwycone. Przenieść skrawki na szkiełka przedmiotowe i przechowywać w temperaturze pokojowej.
8. Wyonać barwienie hematoksyliną i eozyną (H&E) na wybranych szkiełkach w celu oceny morfologii tkanki, przebudowy strukturalnej oraz grubości płatków zastawki.
9. Wyonać barwienie metodą Von Kossa na sąsiednich przekrojach seryjnych, aby wykryć i ilościowo określić zwapnienia dystroficzne, widoczne jako ciemnobrązowe lub czarne złogi mineralne w obrębie płatków zastawki.

8. Zabieg chirurgiczny pozorowany

UWAGA: Ta sekcja opisuje procedurę kontrolną sham. Myszy z grupy sham zostają poddane tej samej anestezji, przygotowaniu skóry, odsłonięciu naczynia, arteriotomii oraz wstecznej insercji drutu prowadzącego co myszy z grupy z uszkodzeniem aorty drutem (AWI); drut prowadzący jest wprowadzany do poziomu nadzastawkowego, ale nie przechodzi przez zastawkę aorty i nie wykonuje się mechanicznego uszkodzenia zastawki.

1. Zanurzyć mysz w znieczuleniu i przygotować pole operacyjne zgodnie z opisem w krokach od 1.1 do 1.5.
2. Pod kontrolą stereomikroskopu odsłonić prawą tętnicę szyjną wspólną (RCCA) poprzez rozdzielanie tępe
3. Trwale podwiązać dystalny koniec RCCA jedwabną nicią 6-0 i zawiązać luźny supeł poślizgowy proksymalnie (zgodnie z krokami 2.2–2.3).
4. Wykonać poprzeczną arteriotomię i wprowadzić drut prowadzący zgodnie z opisem w krokach 3.1–4.2.
5. Wprowadzić drut prowadzący w kierunku wstecznym do poziomu nadzastawkowego aorty wstępującej pod kontrolą echokardiograficzną, upewniając się, że końcówka drutu NIE przechodzi przez zastawkę aorty.
   UWAGA: NIE wykonywać ruchów pchających, ciągnących ani rotacyjnych, które mogłyby uszkodzić zastawkę, opisanych w kroku 4.4. Wycofać drut prowadzący i niezwłocznie podwiązać proksymalny odcinek RCCA zgodnie z opisem w krokach 5.1–5.2.
6. Zamknąć nacięcie skóry za pomocą przerywanych szwów nylonowych 5-0 lub klipsów chirurgicznych.
   UWAGA: Podobnie jak w grupie AWI, analgezję śródoperacyjną zapewniono poprzez miejscową infiltrację lidokainą (krok 1.5). Przenieść zwierzę do ogrzewanej klatki pooperacyjnej i monitorować do pełnego odzyskania sprawności ruchowej.
7. Myszy z grupy Sham poddać identycznemu monitorowaniu pooperacyjnemu, ocenie echokardiograficznej w 4. tygodniu oraz opracowaniu histologicznemu, jak w przypadku grupy AWI.

9. Analiza statystyczna i projekt badania

1. W ramach badania 20 myszy (10 samców, 10 samic) poddano procedurze AWI, a 6 myszy C57BL/6 (3 samców, 3 samic) poddano procedurze Sham.
2. Zmierzyć szczytową prędkość przezklapową (kryterium określające sukces modelu) u wszystkich przeżyłych zwierząt (19 AWI, 6 Sham).
3. Przeanalizować szczegółowe wskaźniki echokardiograficzne i histologiczne w określonej wcześniej, zrównoważonej pod względem płci podgrupie 6 myszy AWI (3 samców, 3 samic).
4. Upewnić się, że wszystkie pomiary echokardiograficzne i histologiczne są wykonywane przez badaczy oślepionych na przydział do grup.
5. Ocenić normalność rozkładu danych testem Shapiro-Wilka przed zastosowaniem testów parametrycznych. Porównać dwie niezależne grupy (AWI vs. Sham) za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta.
6. Przeanalizować i przedstawić dane dotyczące przeżywalności metodą Kaplana-Meiera.
7. Wszystkie analizy przeprowadzić w programie GraphPad Prism. Przedstawić dane jako średnia ± SEM, przyjmując p < 0,05 za wartość istotną statystycznie.

Wyniki

Opracowanie platformy wydrukowanej w technologii 3D do kontroli krwawień

Aby zapobiec krwotokom okołoperacyjnym — głównemu źródłu zachorowalności i śmiertelności w konwencjonalnym modelu AVS indukowanym drutem prowadzącym — zaprojektowano trójwymiarową platformę wsparcia naczyniowego (Rysunek 1). Platformę wykonano metodą stereolitografii (SLA) z biokompatybilnej żywicy fotopolimerowej (zgodnej z normami USP Class VI / ISO 10993) o grubości strukturalnej 1,07 mm. Po wydruku elementy przemyto alkoholem izopropylowym w celu usunięcia nieutwardzonej żywicy, a następnie poddano utwardzaniu pod wpływem promieniowania ultrafioletowego. Dołączono pełny plik projektowy (.stp), aby platformę można było odtworzyć na standardowych systemach SLA. Platforma posiada odwróconą w kształcie litery V powierzchnię wierzchołkową z kątem wierzchołkowym 120° (Rysunek 1A–B), która dopasowuje się do krzywizny izolowanej prawej tętnicy szyjnej wspólnej, nie powodując nadmiernej kompresji ściany. Wielostopniowe wcięcia boczne (Rysunek 1C–D) pozwalają operatorowi na zahaczenie o wcześniej umieszczone szwy i zastosowanie regulowanego napięcia wzdłużnego naczynia. Napięcie zwiększa się stopniowo do momentu, aż pulsacja tętnicy przestanie być widoczna — jest to punkt końcowy, który wskazuje na uzyskanie odpowiedniej czasowej hemostazy. Takie podejście zapewnia stabilne pole operacyjne do arteriotomii i wprowadzenia drutu prowadzącego, zapobiegając jednocześnie nadmiernym obrażeniom zmiażdżeniowym ściany naczyniowej.

Śródoperacyjne potwierdzenie położenia drutu prowadzącego

Poprawność umieszczenia drutu prowadzącego weryfikowano na dwóch etapach procedury. Po pierwsze, pod bezpośrednią wizualizacją stereomikroskopową zaobserwowano wprowadzanie drutu prowadzącego do światła RCCA poprzez poprzeczną arteriotomię w kierunku wstecznym (Rycina 2A). Po drugie, obrazowanie echokardiograficzne w czasie rzeczywistym potwierdziło, że końcówka drutu prowadzącego przekroczyła zastawkę aortalną i weszła do lewej komory. Obrazowanie w trybie B pozwoliło zidentyfikować drut prowadzący jako hiperechogeniczny liniowy artefakt przecinający płaszczyznę zastawki aortalnej (Rycina 2B). Obrazowanie kolorowym Dopplerem wykazało miejscowy przepływ turbulentny na poziomie zastawki aortalnej, co stanowiło dodatkowe potwierdzenie położenia drutu prowadzącego przez płatki zastawkowe (Rycina 2C; Wideo uzupełniające 1).

Przeżywalność okołoperacyjna i wskaźnik sukcesu modelu

Włączenie platformy z regulowanym naciągiem do przebiegu operacji skutkowało wysoką wczesną przeżywalnością. Analiza Kaplana-Meiera wykazała 95% przeżywalność w 24 h po operacji (19 z 20 myszy; Rysunek 3A). Badanie pośmiertne jedynego osobnika, który nie przeżył, nie wykazało oznak dużego krwotoku, uszkodzeń strukturalnych ani niedokrwienia serca, co sugeruje, że zgon był wynikiem powikłań związanych z anestezją, a nie urazu chirurgicznego. Sukces modelu w 4. tygodniu oceniano na podstawie zdefiniowanego wcześniej kryterium: szczytowa prędkość przepływu przez zastawka przekraczająca 2 000 mm/s, wraz z potwierdzającymi znaleziskami histologicznymi. Z 19 przeżywających zwierząt 18 (94,7%) spełniło ten próg, co przełożyło się na całkowity wskaźnik sukcesu modelu na poziomie 90% dla całej kohorty (18 z 20 myszy; Rysunek 3B). Wyniki były porównywalne między płciami: przeżywalność w 24 h wyniosła 9 z 10 u samców i 10 z 10 u samic, a wskaźnik sukcesu modelu w 4. tygodniu wyniósł 9 z 10 (90%) dla obu płci; jedyny zgon okołooperacyjny dotyczył samca (związany z anestezją), a jedyny przypadek niepowodzenia modelu dotyczył przeżywającej samicy.

Echokardiograficzne potwierdzenie stenozy aortalnej

Echokardiografia przezklatkowa przeprowadzona w 4. tygodniu po operacji potwierdziła zmiany hemodynamiczne zgodne z ciężkim zwężeniem zastawki aorty w grupie AWI. Ilościowe wartości echokardiograficzne przedstawiono jako średnią ± błąd standardowy średniej (SEM); parametry funkcjonalne i przebudowy lewej komory przeanalizowano u 6 myszy w grupie Sham i 6 myszy w grupie AWI, natomiast szczytową prędkość przepływu przez zastawkę zmierzono u wszystkich przeżywających myszy z grupy AWI oraz kontrolnej Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Frakcja wyrzutowa lewej komory w 4. tygodniu była nieco niższa w grupie AWI niż w grupie kontrolnej Sham (56,21 ± 1,15% vs. 61,57 ± 2,12%; p = 0,0503; Ryc. 3C), przy czym różnica ta nie osiągnęła istotności statystycznej. Rejestracje Dopplerowskie falowane wykazały znaczny wzrost prędkości strumienia przez zastawkę w grupie AWI, która osiągnęła 2740,89 ± 104,10 mm/s, w porównaniu z 988,00 ± 126,24 mm/s w grupie kontrolnej Sham (Ryc. 3D). Analiza ilościowa potwierdziła wysoce istotny wzrost szczytowej prędkości strumienia przez zastawkę w grupie AWI w stosunku do grupy kontrolnej Sham (p < 0,0001; Ryc. 3E). Zgodnie z wczesną fazą adaptacji do przeciążenia ciśnieniowego, w grupie AWI zaobserwowano koncentryczną przebudowę lewej komory: grubość przedniej ściany w rozkurczu była istotnie zwiększona (LVAWd 1,14 ± 0,02 vs. 0,96 ± 0,03 mm; p = 0,0016; Ryc. 3F), natomiast grubość tylnej ściany w rozkurczu oraz masa lewej komory były wyższe, lecz nie osiągnęły istotności statystycznej (LVPWd 1,01 ± 0,12 vs. 0,76 ± 0,02 mm, p = 0,0650, Ryc. 3G; LV mass 124,51 ± 10,63 vs. 104,47 ± 2,45 mg, p = 0,0961, Ryc. 3H).

Walidacja histopatologiczna przebudowy i zwapnienia zastawek

Badanie histologiczne korzeni aorty potwierdziło wyniki echokardiograficzne. Ilościowe wartości histologiczne przedstawiono jako średnią ± SEM i analizowano u 6 myszy z grupy Sham oraz 6 myszy z grupy AWI. Barwienie H&E w grupie AWI wykazało wyraźne pogrubienie i dezorganizację strukturalną płatków zastawek, cechy te nie występowały w grupie kontrolnej Sham (Rycyna 3I). Morfometria ilościowa potwierdziła istotny wzrost średniej grubości płatków zastawek w grupie AWI w porównaniu z grupą Sham (p < 0,0001; Rycyna 3J). Barwienie metodą von Kossa wykazało rozległe zwapnienia dystroficzne w obrębie pogrubionych płatków zastawek w grupie AWI, zidentyfikowane jako ciemnobrązowe lub czarne złogi mineralne. W grupie kontrolnej Sham odnotowano nieznaczące osadzanie minerałów (Rycyna 3K). Ilościowa analiza obrazu wykazała istotny wzrost całkowitej powierzchni zwapnień (µm²) w grupie AWI w stosunku do grupy kontrolnej Sham (p < 0,0001; Rycyna 3L).

Rysunek 1: Projekt wydrukowanej w technologii 3D platformy do podtrzymywania naczyń przedstawiony w czterech rzutach. (A) Widok ukośny z przodu od lewej strony. (B) Widok ukośny z tyłu od prawej strony. (C) Widok z profilu bocznego ogólnej geometrii podłużnej platformy. (D) Widok pod kątem z zaznaczeniem odwróconego wierzchołka w kształcie litery V. Oznaczenia elementów: 110, korpus platformy; 120, ramiona boczne; 121, schodkowe nacięcia boczne; 130, koniec roboczy; 140, odwrócony wierzchołek do wprowadzania w kształcie litery V; 150, powierzchnia podpierająca stykająca się z naczyniem; 160, nachylenie przejścia między sąsiednimi nacięciami; 190, prawa tętnica szyjna wspólna (RCCA). Platforma została wykonana z biokompatybilnej żywicy fotopolimerowej (grubość strukturalna: 1,07 mm). Rysunek strukturalny 3D został wygenerowany przez autorów z oryginalnego pliku projektowego CAD (.stp) platformy do podtrzymywania naczyń przy użyciu FreeCAD, darmowego oprogramowania do wizualizacji i modelowania CAD o otwartym kodzie źródłowym. Nie adaptowano żadnych publikacji stron trzecich ani rysunków objętych prawem autorskim. Oryginalny plik projektowy CAD jest dostępny jako plik uzupełniający. Prosimy kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rysunek 2: Intraoperacyjne i echokardiograficzne potwierdzenie położenia drutu prowadzącego. (A) Fotografia intraoperacyjna przedstawiająca retrospektorne wprowadzenie drutu prowadzącego (strzałka) przez poprzeczną arteriotomię do światła prawej tętnicy szyjnej wspólnej (RCCA) pod bezpośrednią wizualizacją stereomikroskopową. (B) Obraz echokardiograficzny w trybie B przedstawiający drut prowadzący (zidentyfikowany jako hiperechogenny artefakt liniowy; strzałka) przechodzący przez zastawkę aortalną i wchodzący do lewej komory. (C) Obraz echokardiograficzny w trybie kolorowego Dopplera wykazujący zlokalizowany przepływ turbulentny na poziomie zastawki aortalnej, potwierdzający położenie drutu prowadzącego przez płatki zastawkowe. Wizualizacja przepływu przez zastawkę w czasie rzeczywistym w trybie kolorowego Dopplera podczas pozycjonowania drutu prowadzącego została przedstawiona w Supplementary Video 1. Proszę kliknąć tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Rycina 3: Przeżywalność, parametry hemodynamiczne, przebudowa komory oraz wyniki histopatologiczne w zoptymalizowanym modelu urazu aorty drutem (AWI). (A) Krzywa przeżywalności Kaplana-Meiera po 24 h dla myszy AWI (n = 20). (B) Skuteczność modelu (czerwone) w stosunku do niepowodzeń (czarne) w grupie AWI w 4. tygodniu (n = 20); sukces zdefiniowano jako szczytową prędkość przezpławkową > 2,000 mm/s. (C) Frakcja wyrzutowa (EF; p = 0.0503). (D) Reprezentatywne echokardiogramy Dopplera z falą impulsową (PW) z myszy Sham (lewo) i AWI (prawo). (E) Szczytowa prędkość przezpławkowa (n = 19 AWI, n = 6 Sham; p < 0.0001). (F) Rozdętościowa grubość przedniej ściany lewej komory (LVAWd; p = 0.0016). (G) Rozdętościowa grubość tylnej ściany lewej komory (LVPWd; p = 0.0650). (H) Masa lewej komory (p = 0.0961). (I) Reprezentatywne przekroje pierścionka aorty barwione HE (Sham, lewo; AWI, prawo). (J) Grubość płatków zastawki aorty (p < 0.0001). (K) Reprezentatywne przekroje pierścionka aorty barwione metodą Von Kossa (Sham, lewo; AWI, prawo). (L) Całkowita powierzchnia złogów wapnia (µm²; p < 0.0001). Paski skali = 500 µm. Na wszystkich ilościowych wykresach słupkowych słupki reprezentują wartości średnie, a słupki błędów reprezentują błąd standardowy średniej (SEM). Ilościowe porównania między grupami Sham i AWI na panelach C, E–H, J i L przeprowadzono za pomocą nieparzystego dwustronnego testu t Studenta. Dane ilościowe pochodzą z grup Sham i AWI (n = 6 na grupę), z wyjątkiem szczytowej prędkości przezpławkowej w panelu E, która była mierzona u wszystkich przeżywających myszy AWI oraz kontroli Sham (n = 19 AWI, n = 6 Sham). Kliknij tutaj, aby zobaczyć powiększoną wersję tej ryciny.

Wideo uzupełniające 1: Wizualizacja przepływu krwi przez zastawkę w kolorowym Dopplerze echokardiograficznym podczas pozycjonowania drutu prowadzącego. Film przedstawia obrazowanie kolorowym Dopplerem w czasie rzeczywistym na poziomie zastawki aortalnej podczas procedury AWI, pokazując lokalny przepływ turbulentny wywołany pozycjonowaniem drutu prowadzącego przez płatki zastawki. Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

Niniejszy protokół zawiera szczegółowy opis stabilnego i bezpiecznego modelu zwierzęcego zwężenia zastawki aortalnej. Cechą charakterystyczną tego podejścia jest platforma pomocnicza, która ułatwia wprowadzenie drutu prowadzącego do wspólnej tętnicy szyjnej. Platforma jest wytwarzana za pomocą stereolitografii (SLA) z biokompatybilnej żywicy fotopolimerowej (grubość strukturalna 1,07 mm) i posiada odwróconą wierzchołkową powierzchnię w kształcie litery V z kątem wierzchołkowym 120°; kompletny plik projektu jest swobodnie dostępny jako uzupełniający plik .stp. Urządzenie to zapewnia płynne wprowadzenie drutu prowadzącego, obiektywnie kontroluje okołoperoperacyjną utratę krwi, a tym samym zabezpiecza zarówno krótko-, jak i długoterminowe przeżycie myszy w modelu. Od czasu pierwotnego opisu model indukowany drutem prowadzącym został dodatkowo udoskonalony i scharakteryzowany, w tym o warianty o różnym stopniu nasilenia, które pozwalają na miareczkowanie intensywności uszkodzenia w celu uzyskania zwężenia od łagodnego do ciężkiego¹⁷, a niedawne raporty dokumentują jego powikłania okołoperoperacyjne¹⁸; niniejszy protokół opiera się na tych pracach, systematycznie rozwiązując problem krwotoków okołoperoperacyjnych.

Kilka etapów niniejszego protokołu jest kluczowych dla prawidłowej indukcji modelu i wymaga szczególnej uwagi. Po pierwsze, stopień napięcia podłużnego przyłożonego za pomocą platformy wydrukowanej w technologii 3D musi zostać precyzyjnie skalibrowany: napięcie należy zwiększać tylko do momentu, aż pulsacja tętnicy stanie się niezauważalna wizualnie. Niedostateczne napięcie prowadzi do utrzymującego się krwawienia podczas arteriotomii, natomiast zbyt duże napięcie grozi uszkodzeniem śródbłonka i pęknięciem naczynia. Po drugie, proksymalny węzeł poślizgowy musi zostać mocno zaciśnięty wokół naczynia i drutu prowadzącego przed usunięciem platformy; przedwczesne usunięcie platformy przy niewystarczająco zabezpieczonym węźle poślizgowym jest najczęstszą przyczyną krwotoku podczas procedury. Po trzecie, niezbędne jest potwierdzenie wprowadzenia drutu prowadzącego do lewej komory pod kontrolą echokardiograficzną. Bez tego etapu weryfikacji operator nie może mieć pewności, że drut prowadzący jest prawidłowo umiejscowiony przy zastawce aortalnej, a niepełne uszkodzenie doprowadzi do niepowodzenia modelu.

Można przewidzieć i opanować kilka typowych powikłań. Jeśli podczas wprowadzania drutu prowadzącego wystąpi krwawienie, należy ponownie ustawić platformę pod naczyniem, aby przywrócić tymczasową hemostazę przed kontynuacją procedury. U zwierząt z tętnicami szyjnymi o mniejszej średnicy lekkie zmniejszenie napięcia platformy może rozszerzyć światło naczynia, ułatwiając wprowadzenie drutu prowadzącego. Model ten posiada kilka ograniczeń, które należy wziąć pod uwagę podczas interpretacji wyników. Mechaniczne uszkodzenie drutem powoduje ostre mechaniczne i zapalne uszkodzenie zastawki, co różni się od przewlekłego, indukowanego lipidami procesu degeneracyjnego charakteryzującego ludzką zwapniałą stenozę aorty^17,19,20,21. W konsekwencji cechy histologiczne — choć odtwarzają pogrubienie płatków i zwapnienie dystroficzne — mogą nie w pełni oddawać wszystkie zdarzenia molekularne występujące w ludzkiej chorobie. Protokół opracowano i zwalidowano u samców i samic myszy C57BL/6 w wieku 8–10 tygodni; jednak zastosowanie go u innych szczepów lub starszych zwierząt wymaga niezależnej walidacji. Różnice między płciami w średnicy tętnicy szyjnej i anatomii serca mogą modyfikować trudność zabiegu oraz wyniki hemodynamiczne; zaleca się, aby badacze raportowali płeć jako zmienną biologiczną w późniejszych analizach²². Ponadto, stałe podwiązanie prawej tętnicy szyjnej wspólnej jest nieodłącznym elementem procedury; chociaż krąg Willisa zapewnia poboczne ukrwienie mózgu u myszy i nie zaobserwowano jawnych deficytów neurologicznych, nie można wykluczyć subtelnych efektów poznawczych lub naczyniomózgowych. Przed zabiegiem nie wykonano echokardiografii wyjściowej; współczesna grupa pozorowana (sham) służyła jako kontrola prawidłowej funkcji zastawki. W miarę możliwości zaleca się wykonanie skanu wyjściowego, aby umożliwić porównania w obrębie tego samego zwierzęcia oraz wykryć rzadkie, spontaniczne wady zastawki aorty zgłaszane u myszy C57BL/6 (~0,3% w nieniekshowanych szczepach). W niniejszym badaniu nie oceniano systematycznie niedomykalności aorty; częstotliwość indukowanej urazem niedomykalności aorty oraz jej związek z nasileniem stenozy wymagają oddzielnej oceny i zostaną omówione w przyszłych pracach.

Należy również wziąć pod uwagę potencjalne wady platformy. Urządzenie mogłoby mechanicznie drażnić sąsiednie struktury, w tym nerw błędny biegnący wzdłuż tętnicy szyjnej; ryzyko to jest zminimalizowane dzięki zaokrąglonym, tępym krawędziom platformy, jej dopasowanemu do naczynia wierzchołkowi o kącie 120° oraz krótkiemu czasowi aplikacji; w niniejszym badaniu nie zaobserwowano nieprawidłowości oddechowych ani innych ewidentnych powikłań przypisywanych urządzeniu. W porównaniu z uznanymi metodami alternatywnymi, zoptymalizowany protokół oferuje kilka praktycznych zalet. Modele dietetyczne u myszy ApoE⁻/⁻ wymagają 20–24 tygodni żywienia dietą wysokotłuszczową i dają zmienny fenotyp stenozy, przy czym u wielu zwierząt nie dochodzi do rozwoju hemodynamicznie istotnej choroby. Niniejszy protokół pozwala na uzyskanie spójnego fenotypu stenozy w ciągu 4 tygodni, przy ogólnym wskaźniku sukcesu wynoszącym 90% (18 z 20 zwierząt). W porównaniu z oryginalną metodą prowadnicy Hondy, głównym udoskonaleniem tego protokołu jest systematyczna kontrola krwawienia okołooperacyjnego za pomocą wydrukowanej w technologii 3D platformy.

Krwawienie podczas wprowadzania drutu prowadzącego zostało rozpoznane jako powikłanie pierwotnej techniki, jednak nie było ono odpowiednio rozwiązywane. W retrospektywnym doświadczeniu tego samego laboratorium z konwencjonalną procedurą (przed wprowadzeniem platformy) (ponad 400 przypadków), do poważnego krwotoku śródoperacyjnego doszło w szacunkowo ~40% przypadków, przy śmiertelności po krwotoku wynoszącej ~60% i 24-godzinnym przeżyciu na poziomie ~75%, przy czym krwotok — głównie w miejscu dostępu do tętnicy szyjnej — odpowiadał za niemal wszystkie zgonów okołoperacyjne. Jest to spójne z wynikami Qian i wsp., którzy zidentyfikowali krwawienie w miejscu nakłucia tętnicy szyjnej jako główną przyczynę zgonów okołoperacyjnych w tym modelu. Dzięki kontroli utraty krwi platforma wydrukowana w technologii 3D zwiększyła 24-godzinne przeżycie do 95%, a w obecnej kohorcie nie zaobserwowano zgonów przypisywanych krwotokowi. Ponieważ krwawienie nie jest już czynnikiem ograniczającym, intensywność uszkodzenia mechanicznego może być zmieniana w celu uzyskania stopnia nasilenia zwężenia. Ta możliwość regulacji ma bezpośrednie znaczenie translacyjne: w przypadku kandydatów na leki o umiarkowanej wielkości efektu, może być konieczne zastosowanie poważniejszego uszkodzenia wyjściowego, aby ujawnić różnice związane z leczeniem, które w łagodniejszym modelu zostałyby zamaskowane.

Model ten dobrze nadaje się do kilku kategorii dalszych badań. Ponieważ fenotyp stenozy rozwija się w określonym i powtarzalnym czasie, może on służyć jako platforma do przedklinicznej oceny potencjalnych terapii farmakologicznych mających na celu spowolnienie zwapnienia lub włóknienia zastawek²³. Model jest również kompatybilny z podejściami genetycznymi: protokół można zastosować u myszy transgenicznych lub z nokautem genów na tle C57BL/6, aby przeanalizować udział konkretnych szlaków sygnalizacyjnych w progresji choroby zastawek. Ponadto 4-tygodniowy punkt końcowy zapewnia praktyczne okno czasowe dla seryjnego monitorowania ewolucji choroby lub odpowiedzi na leczenie za pomocą echokardiografii. Pliki projektowe platformy drukowanej w 3D mogą być udostępniane swobodnie jako uzupełniający plik .stp, a standaryzacja tego urządzenia w różnych laboratoriach ma na celu dalszą poprawę powtarzalności między ośrodkami.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Platforma do wsparcia naczyniowego drukowana w 3D	Wykonana na zamówienie	N/A	Wsparcie naczyniowe wykonane na zamówienie w druku 3D; dołączono uzupełniający plik CAD w formacie .stp.
4% Paraformaldehyd	Servicebio	G1101-3ML	Fiksacja tkanek
Nylonowa nić chirurgiczna 5-0	Jinhuan Medical	F503	Zamknięcie skóry za pomocą szwów przerywanych
Jedwabna nić chirurgiczna 6-0	Jinhuan Medical	RC411	Trwałe podwiązanie dystalnej RCCA i proksymalny węzeł poślizgowy
Żel do sprzęgania akustycznego (podgrzany)	Keppler	KL-250	Echokardiografia
Biokompatybilna żywica fotopolimerowa	Formlabs	RS-F2-BMCL-01	Materiał do druku SLA użyty do wykonania platformy do wsparcia naczyniowego drukowanej w 3D.
Myszy C57BL/6 (8–10 tygodni; samce 22–25 g, samice 18–20 g)	GemPharmatech	C57BL/6	Obie płcie stosowane w badaniu; utrzymywane w standardowych warunkach
Tlenek etylenu (gaz)	Instytucjonalna sterylizatornia	N/A	Sterylizacja platformy do wsparcia naczyniowego drukowanej w 3D.
FreeCAD	FreeCAD Project Association	1.1.1	Wizualizacja CAD i generowanie rysunku konstrukcyjnego 3D z pliku .stp.
GraphPad Prism	GraphPad Software	9.0	Analiza statystyczna i tworzenie wykresów
Drut prowadzący, średnica 0,014 cala	Boston Scientific	H749393071900	Mechaniczne uszkodzenie zastawki aorty
Zestaw do barwienia hematoksyliną i eozyną (H&E)	Beyotime	C0105S	Morfologia i grubość płatków zastawki
Izofluran	RWD Life Science	R510-22-2	Indukcja 3%; utrzymanie 1,5–2% w 100% O2
Lidokaina	Shijiazhuang Pharmaceutical Group	H14024045	Zapobiegawcza infiltracja miejscowa w miejscu nacięcia (0,5%, krok 1.5)
Nożyczki mikrochirurgiczne	RWD Life Science	F11022-11	Nacięcie skóry, arteriotomia, torakotomia
Przetwornik MX550D (40 MHz)	FUJIFILM VisualSonics	MX550D	Echokardiografia
Krem do usuwania włosów Nair	Nair	255 g	Do depilacji przedniej części szyi i ściany klatki piersiowej
Bufor fosforanowy (PBS)	Servicebio	G4202-100ML	Perfuzja
Mikrotom obrotowy	Leica Biosystems	RM2125 RTS	Seryjne cięcie w grubości 4–5 µm
Stereomikroskop (chirurgiczny)	Olympus	SZX7	Izolacja naczyń i mikrochirurgia
System ultradźwiękowy o wysokiej rozdzielczości Vevo 3100	FUJIFILM VisualSonics	Vevo 3100	Echokardiografia
Zestaw do barwienia metodą von Kossa	Servicebio	G1043-20ML	Wykrywanie zwapnień dystroficznych
Ksylen	Nanjing Chemical Reagent Co., Ltd.	C0430530209	Przejaśnianie tkanek podczas obróbki w parafinie.