Artykuł metodologiczny

Układ optyczny do oceny mechaniki przedsionków i komór w sercach myszy perfundowanych metodą Langendorffa

DOI:

10.3791/72264

⸱

14 sierpnia 2026

 , 
1Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del IPN, Unidad Monterrey

* These authors contributed equally

W tym artykule

Podsumowanie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Niniejszy protokół opisuje procedurę wycięcia i kaniulacji serca myszy, a także przygotowanie i konfigurację systemu retrospektuwną perfuzji Langendorffa. Układ eksperymentalny jest sprzężony z wysokorozdzielczym systemem optycznym, zaprojektowanym do oceny odpowiedzi mechanicznych przedsionków i komór przy jednoczesnym zachowaniu ich naturalnej dynamiki.

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce myszy służy jako szeroko stosowany model w badaniach sercowo-naczyniowych, co jest możliwe dzięki postępom w technologiach inżynieryjnych. Jednak ocena kurczliwości przedsionków i komór pozostaje wyzwaniem ze względu na niewielki rozmiar serca myszy. Niniejsze badanie wprowadza nową metodologię oceny kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym narządzie. Wykorzystanie serca myszy perfundowanego metodą Langendorffa w połączeniu z wysokorozdzielczym systemem optycznym umożliwia ocenę kurczliwości przedsionków i komór. Układ eksperymentalny rozwiązuje problemy związane z małym rozmiarem serca i wysoką częstotliwością skurczów, zapewniając jednocześnie pozyskiwanie sygnałów o wysokiej rozdzielczości. Synchronizacja między częstotliwością stymulacji a częstotliwością skurczów serca w zakresie od 420 do 660 uderzeń na minutę (bpm) była zgodna z wynikami uzyskanymi metodą aukotoniczną. Dodatkowo pomiary skrócenia komór oraz dynamiczne sygnały z przedsionków pozwalają na określenie skurczu przedsionkowo-komorowego. Metoda ta jest odpowiednia do oceny kurczliwości i częstotliwości akcji w nienaruszonym, izolowanym sercu, bez wpływów farmakologicznych lub systemowych. Wyniki te dowodzą, że system optyczny umożliwia pomiar odpowiedzi skrócenia komór i przedsionków.

Wprowadzenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Fizjologia serca kryje w sobie wiele nieodkrytych aspektów; kluczowe procesy, takie jak rozrusznikowa aktywność serca oraz sprzężenie pobudzenie-skurcz, stanowią centralne zagadnienia, które są przedmiotem ciągłych badań1. Choć wpływ szumu biologicznego na kurczliwość serca2 oraz aktywność rozrusznikową pozostaje słabo poznany1, nowe metody obrazowania optycznego pozwoliły na przedstawienie nowych paradygmatów3,4.

Dwie metodologie eksperymentalne z wykorzystaniem układu Langendorffa wniosły nieoceniony wkład w pomiar funkcji serca. Pierwszą z nich jest metoda skurczu izowolumetrycznego, w której sygnał uzyskuje się za pomocą niewielkiego balonu wprowadzonego do lewej komory5,6,7. Drugą jest metoda rejestracji aukotonicznej, polegająca na uzyskaniu sygnału poprzez przyszycie jednego końca nici do wierzchołka serca, a drugiego do mechanicznego urządzenia rejestrującego, w celu pomiaru skurczów aukotonicznych wzdłuż osi serca2,8. Niemniej jednak ocena kurczliwości przedsionków i komór serca myszy jest trudna ze względu na jego niewielki rozmiar. Co więcej, preparatyka wymaga pewnego stopnia delikatności, ponieważ serce jest podatne na uszkodzenia9,10,11,12,13.

System optyczny do oceny dynamiki mechanicznej serca myszy posiada kilka nowatorskich cech i zalet. Po pierwsze, metoda ta nadaje się do oceny kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym sercu, bez wpływu czynników farmakologicznych lub systemowych. Protokół ten można również skutecznie zastosować w eksperymentach oceniających uszkodzenia niedokrwienno-reperfuzyjne podczas badania terapii farmakologicznych, regeneracyjnych lub opartych na tlenoterapii.

W niniejszej pracy przedstawiamy protokół rejestracji parametrów biofizycznych funkcji skurczowej serca myszy z wykorzystaniem wysokorozdzielczego systemu optycznego. Metoda ta pozwala na ocenę kurczliwości i częstotliwości akcji serca w nienaruszonym, izolowanym sercu. Ponadto umożliwia ona ocenę kurczliwości przedsionków i komór. Preparat serca myszy w układzie Langendorffa zawiera udoskonalenie obejmujące niewielką modyfikację, która minimalizuje spadek temperatury perfuzatu oraz artefakty ruchowe, nie hamując przy tym skurczów mięśni.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Wszystkie procedury dotyczące zwierząt były przeprowadzane zgodnie z Federalnymi Przepisami dotyczącymi Eksperymentów i Opieki nad Zwierzętami i zostały zatwierdzone przez Komitet Opieki nad Zwierzętami CINVESTAV (CINVESTAV Zacatenco, D.F., Meksyk). W badaniu wykorzystano samce myszy C57BL/6J o masie 28–34 g i wieku od 8 do 14 tygodni. Wszystkie materiały i sprzęt użyte w protokole są wymienione w Tabeli materiałów. Pliki uzupełniające 1–11 zawierają pomocnicze schematy, przewodniki po oprogramowaniu, programy analityczne, dane dotyczące stymulacji oraz pliki aplikacyjne do protokołu.

1. Przygotowanie roztworów stokowych

  1. Przygotuj wcześniej dwa roztwory stokowe i przechowuj je w lodówce w temperaturze 4 °C: (1) Roztwór stokowy I, 1 L (w wodzie dejonizowanej; w g/L: 76,13 NaCl, 4,02 KCl, 1 MgCl2(6H2O), 0,4 NaH2PO4) oraz (2) Roztwór stokowy II, 0,1 L (w wodzie dejonizowanej; w g/L: 73,5 CaCl2(2H2O)).
    UWAGA: Roztwory można stosować do 30 dni od momentu przygotowania. Przechowywać w temperaturze 4 °C.

2. Podłączenie i czyszczenie układu Langendorffa

  1. Połącz zbiornik (1), kąpiel wodną zbiornika (2), pompę perfuzyjną (3), wężownicę (4), recyrkulator wężownicy (5), system monitorowania (6) oraz system drenażu (8), zgodnie z przedstawionym na Rysunek 1A.
    UWAGA: Połączenie systemu monitorowania z systemem drenażowym przedstawiono bardziej szczegółowo w Plik uzupełniający 1.
  2. Napełnić układ Langendorffa 1 L wody dejonizowanej o temperaturze 50 °C, a następnie uruchomić pompy perfuzyjne i drenażowe (Plik uzupełniający 1, system drenażu)Po około 20–30 min usunąć ciecz z układu, a następnie przejść do następnego kroku.
    UWAGA: Należy sprawdzić, czy w układzie nie występują wycieki lub spadki ciśnienia. W przypadku ich wystąpienia nie należy kontynuować eksperymentu.
  3. Napełnij system 1 l 1% kwasu octowego (rozpuszczonego w wodzie dejonizowanej), następnie wyłącz pompy perfuzyjne i odpływowe i odczekaj 60 min, po czym włącz pompy, aby usunąć ciecz.
  4. Powtórz krok 2.2 dwukrotnie.
  5. Napełnij układ 70% etanolem (rozpuszczonym w wodzie dejonizowanej), aby zapobiec przyleganiu składników roztworu.
    UWAGA: System perfuzji Langendorffa musi być czyszczony co dziesięć eksperymentów lub raz w miesiącu. Protokół czyszczenia przed eksperymentem wyjaśniono w sekcja 4Podczas gdy protokół czyszczenia po zakończeniu eksperymentu został szczegółowo opisany w sekcja 8.

3. Przygotowanie roztworu Tyrode'a podczas eksperymentu

  1. Przygotować 1 L roztworu o następującym stężeniu w mM: 130,25 NaCl, 5,4 KCl, 0,53 MgCl2(6H2O), 0,33 NaH2PO4, 1,8 CaCl2(2H2O), 10 D-glukozy, 10 HEPES, z pH dostrojonym do 7,35 ± 0,05 za pomocą NaOH.
    1. Zmieszać 100 mL Roztworu Zapasowego I z 700 mL wody dejonizowanej przy ciągłym mieszaniu, a następnie podnieść temperaturę roztworu do 37 °C; zapewnić napowietrzanie roztworu, podłączając butlę z O2 do kamienia napowietrzającego, jak pokazano na Rysunku 1A (1).
    2. Dodać 3,6 mL Roztworu Zapasowego II oraz 96,4 mL wody dejonizowanej, aby uzyskać stężenie 1,8 mM CaCl2(2H2O), a następnie dodać NaOH w celu dostrojenia pH do 7,35 ± 0,05.
    3. Dopełnić wodą dejonizowaną do objętości 1 L, aby uzyskać roztwór Tyrode'a.
      UWAGA: Zaleca się przechowywanie 100 mL roztworu w lodówce w temperaturze 4 °C; ta objętość będzie wymagana później w kroku 6.

4. Przygotowanie układu Langendorffa

UWAGA: Jeśli w dniu eksperymentu układ Langendorffa nie jest wypełniony etanolem, nie zaleca się kontynuowania procedury; należy zamiast tego powtórzyć sekcję 2.

  1. Włącz pompy perfuzyjne i drenażowe. Ustaw natężenie przepływu pompy perfuzyjnej na 3 mL/min, a pompy drenażowej na 10 mL/min. Opróżnij system.
  2. Wypełnij system 1 L wody dejonizowanej o temperaturze 37 °C, a następnie spuść wodę.
  3. Wypełnij system roztworem Tyrode'a przygotowanym w kroku 3 i utrzymuj roztwór w temperaturze fizjologicznej oraz przy stałym natlenieniu.
  4. Włącz łaźnie termostatyczne zbiornika oraz cyrkulator wężownicowy. Ustaw temperaturę zbiornika (Rysunek 1A (2)) na 38 °C, aby utrzymać roztwór w warunkach fizjologicznych. Ustaw temperaturę wężownicy (Rysunek 1A (5)) na 40 °C. Pozwala to zrekompensować spadek temperatury roztworu w układzie Langendorffa.
    UWAGA: Jeśli temperatura roztworu Tyrode'a na wylocie z układu nie jest fizjologiczna (37 ± 0.5 °C), należy skorygować temperaturę cyrkulatora wężownicowego. Nie zaleca się przechodzenia do kroku 6 do momentu ustabilizowania się temperatury na odpowiednim poziomie.
  5. Włącz monitor ciśnienia (Plik uzupełniający 1, system monitorowania) i skalibruj go w zakresie 0–200 mmHg. W celu kalibracji systemu dostępna jest aplikacja do monitorowania i stymulacji (Plik uzupełniający 3 oraz Plik uzupełniający 11).
    UWAGA: Niezbędne jest upewnienie się, że w systemie nie występują spadki ciśnienia ani pęcherzyki powietrza. Jeśli w systemie znajdują się pęcherzyki, tymczasowo zablokuj dolny wylot wężownicy i otwórz górny zawór; spowoduje to wypełnienie kolumny, co pozwoli na uwolnienie pęcherzyków na zewnątrz. Nie zaleca się kontynuowania eksperymentu do czasu zweryfikowania tego stanu.

5. Układ optyczny14

  1. Zmontuj kamerę CMOS (Rysunek 1A, 10), regulowany obiektyw kamery (LC) oraz system oświetlenia.
    UWAGA: System oświetlenia składa się z dwóch diod LED (Rysunek 1A, 9), dwóch plano-konweksyjnych soczewek oświetlających (LI), kontrolera oświetlenia (Rysunek 1A, 11), karty akwizycji (Plik uzupełniający 1, system monitorowania) oraz elementów wsporczych zaprojektowanych w 3D (Plik uzupełniający 1).
  2. Umieść obiekt referencyjny o objętości około 1,000 mm3 w odległości 100–200 mm od obiektywu kamery (środek Rysunku 1A).
    UWAGA: Obiekt musi zostać umieszczony w pozycji serca w układzie Langendorffa. Pozycję tę można zaobserwować na Rysunku 1B, a konkretnie w centrum obrazu, w miejscu padania wiązek światła.
  3. Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery, a następnie ustaw kamerę z podpróbkowaniem (subsampling) 4x (4 piksele = 1 subpiksel). Wyznacz obszar zainteresowania (ROI) o wymiarach 200 x 200 subpikseli (Plik uzupełniający 2).
    UWAGA: Przy tej konfiguracji możliwa jest rozdzielczość czasowa wynosząca 750 klatek na sekundę (fps).
  4. Włącz system oświetlenia (Plik uzupełniający 1), ustaw wiązki światła tak, aby skupiały się na obiekcie referencyjnym, i uzyskaj jednorodne oświetlenie (Rysunek 1B).
  5. Dostosuj natężenie światła padającego na obiekt referencyjny, aby uniknąć prześwietlenia obrazu.
    UWAGA: Obraz powinien wyglądać jak na Rysunku 2A (lub Rysunku 1C, PC kontrolera). Odblaski na powierzchni obiektu (serca) należy zminimalizować w możliwie największym stopniu, nie tracąc przy tym definicji jego konturu. Można to osiągnąć poprzez regulację mocy kontrolera oświetlenia lub skrócenie czasu ekspozycji w ustawieniach kamery.
  6. Ustaw ostrość obiektywu kamery, aby uzyskać wyraźny obraz obiektu referencyjnego (Rysunek 1C, PC kontrolera). Upewnij się, że obiekt referencyjny zajmuje 80% pola widzenia (Rysunek 2A), aby uzyskać skalę konwersji wynoszącą około 61 µm na subpiksel.
    UWAGA: System optyczny automatycznie aktywuje system oświetlenia, gdy kamera zostanie ustawiona w trybie akwizycji (Rysunek 1A oraz Plik uzupełniający 2). Zaleca się utrzymywanie kamery w trybie czuwania, aby system oświetlenia pozostawał wyłączony i był aktywowany jedynie w okresach zbierania danych eksperymentalnych, co zapobiegnie przegrzaniu.

6. Procedury chirurgiczne i kaniulacja

  1. Heparynizacja i znieczulenie
    1. Przygotować mieszaninę anestetyczną zawierającą tiletaminę-zolazepam (40 mg/kg masy ciała myszy) i ksylazynę (10 mg/kg masy ciała myszy), a następnie rozcieńczyć ją do objętości 200 µL roztworem soli fizjologicznej.
    2. Wstrzyknąć mieszaninę anestetyczną dootrzewnowo za pomocą igły 27 G. Odczekać, aż mysz wejdzie w stan głębokiej narkozy.
      UWAGA: Zweryfikować brak odruchu w odpowiedzi na bodziec w kończynach lub ogonie (zazwyczaj wystarczające jest 10 min).
    3. Wstrzyknąć 200 UI niefrakcjonowanej heparyny dootrzewnowo za pomocą igły 27 G i odczekać około 5 min przed kontynuacją eksperymentu.
  2. Ekstrakcja i kaniulacja
    1. Ułożyć mysz w pozycji grzbietnej, usunąć sierść i skórę z obszaru klatki piersiowej za pomocą nożyc chirurgicznych.
    2. Wykonać nacięcie brzuszne poniżej przepony, dbając o zachowanie jej integralności.
    3. Kontynuować poprzez nacięcie poprzeczne przepony i szybko przeprowadzić obustronną torakotomię wstępującą przez żebra, a następnie usunąć ścianę żebrową.
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić serca. Jeśli serce zostanie naruszone lub uszkodzone podczas procedury, zaleca się przerwanie eksperymentu.
    4. Ostrożnie uchwycić górne struktury serca za pomocą precyzyjnej pęsety: łuk aorty oraz przyległe naczynia. Delikatnie unieść je, aby wykonać cięcie od dołu ku górze, a następnie usunąć serce wraz z płucami.
    5. Szybko przenieść serce do szalki Petriego zawierającej 50 mL roztworu Tyrode'a w temperaturze 4 °C w celu wstępnego płukania.
      UWAGA: Od momentu nacięcia przepony zwierzę zacznie wykazywać objawy niewydolności oddechowej; od tego momentu pozostało 60 s na wykonanie kroków 6.2.3–6.2.6. Przekroczenie tego limitu czasu może spowodować uszkodzenia niedokrwienne.
    6. Usunąć płuca i nadmiar tkanki tłuszczowej, aby odsłonić łuk aorty, używając mikroskopu stereoskopowego i precyzyjnych nożyc.
      UWAGA: Podczas oczyszczania tkanki należy upewnić się, że łuk aorty nie został uszkodzony. Jeśli aorta zostanie przecięta poniżej tętnicy szyjno-obojczykowej, kaniulacja będzie utrudniona, co może prowadzić do nieszczelności ciśnienia.
    7. Przenieść serce do specjalnie przygotowanej podstawy do kaniulacji zawierającej 50 mL buforu Tyrode'a w temperaturze 4 °C i wprowadzić koniec aorty do kaniuli wykonanej z igły 20 G (Supplementary File 1).
      UWAGA: Należy uważać, aby nie uszkodzić zastawki aortalnej. W przypadku uszkodzenia zastawki serce obrzmi, a krążenie wieńcowe nie zostanie prawidłowo przepłukane.
    8. Zawiązać dwa węzły kaniulacyjne przy użyciu nici jedwabnej 4/0: pierwszy w wgłębieniu dystalnie od końcówki kaniuli, a drugi przed pniem szyjno-obojczykowym (Supplementary File 1).
    9. Powoli podawać roztwór Tyrode'a za pomocą strzykawki 1 mL wypełnionej buforem w temperaturze pokojowej. Zweryfikować, czy tkanka wieńcowa staje się przejrzysta, co potwierdza prawidłową kaniulację.
    10. Usunąć tkankę tłuszczową, aby umożliwić dostęp do komór i przedsionków.
      UWAGA: Należy unikać przekroczenia 5 min kaniulacji, aby zachować żywotność serca.
    11. Przenieść serce do układu Langendorffa i pozostawić do stabilizacji na 30 min.
      UWAGA: Serce umieszcza się w centrum układu (Ryc. 1A,B), w zawieszeniu pionowym. Podczas zawieszania serca należy zachować szczególną ostrożność, aby zapobiec tworzeniu się pęcherzyków powietrza. Jeśli do tego dojdzie, ciśnienie wzrośnie powyżej 140 mmHg, serce zacznie obrzmijać i przestanie być żywotne.
      UWAGA: Montaż w układzie Langendorffa jest zakończony, gdy serce wykazuje stabilną mechanicznie odpowiedź, naturalną częstotliwość oscylacji wynoszącą około 360 uderzeń na minutę (BPM) oraz ciśnienie perfuzji między 60 a 110 mmHg.

7. Protokół stymulacji tempa i rejestracja wideo

  1. Żywotność serca
    1. Zweryfikuj, czy ciśnienie w tętnicach wieńcowych mieści się w zakresie 60–110 mmHg przy pompie perfuzyjnej o przepływie 3 mL/min. Jeśli ciśnienie perfuzyjne w tętnicach wieńcowych spadnie poniżej 60 mmHg, należy nieznacznie zwiększyć szybkość przepływu pompy perfuzyjnej (niskie ciśnienie spowoduje, że serce stanie się blade i wiotkie). I odwrotnie, jeśli ciśnienie przekroczy 110 mmHg, należy nieznacznie zmniejszyć szybkość przepływu pompy (nadmierne ciśnienie wywoła obrzęk tkanek i postępujący wzrost ciśnienia aż do wystąpienia zatrzymania akcji serca).
      UWAGA: Utrzymywanie ciśnienia perfuzyjnego poza wspomnianym optymalnym zakresem przez dłuższy czas nieodwracalnie naruszy żywotność serca.
    2. Umieść serce w pozycji frontalnej, aby w kamerze uzyskano pełny widok od przodu. Dostosuj pozycję tak, aby oba przedsionki były widoczne w kamerze (Rycina 2A).
    3. Ostrożnie umieść elektrody platynowe powierzchownie na szczycie prawego przedsionka w miejscu węzła rozrusznikowego. Korzystaj z obrazu z kamery, aby wprowadzić elektrody w pole widzenia. Ustaw elektrodę tak, aby nie zasłaniała prawego przedsionka. Monitorując podgląd na żywo z kamery, powoli przesuwaj elektrodę, aż zetknie się ona z tkanką przedsionka, dbając o to, by nie wywierać nadmiernego nacisku (co mogłoby spłaszczyć prawy przedsionek na obrazie).
      UWAGA: Przy prawidłowym wykonaniu widok z kamery powinien odpowiadać Rycynie 2A.
    4. Uruchom aplikację do monitorowania i stymulacji (Plik uzupełniający 11) i włącz kartę akwizycji (Rycina 1A (6)). Ustaw wartości parametrów bodźca: amplitudę na 2 V, częstotliwość na 420, 540 i 720 impulsów na minutę (PPM) z prostokątnym impulsem o cyklu pracy 7 ms (wstawka na Rycynie 2A).
    5. Zastosuj stymulację w celu oceny żywotności, zaczynając od najniższej częstotliwości, stosując czas stymulacji 20 s, a następnie 20 s okresu regeneracji (czasu spoczynku) pomiędzy zdarzeniami.
      UWAGA: Żywotność serca oceniaj poprzez monitorowanie kamerą. Jeśli organ jest funkcjonalnie sprawny fizjologicznie, zaobserwowana zostanie synchronizacja między zastosowanym bodźcem a odpowiedzią serca, wraz z odpowiednią koordynacją między jamami serca. I odwrotnie, brak żywotności objawi się utratą koordynacji jam lub wyłączną obecnością izolowanych skurczów przedsionków.
    6. Zamknij drzwiczki komory, ponieważ eksperyment jest wrażliwy na światło pokojowe i wahania temperatury (Rycina 1C).
      UWAGA: Drzwiczki komory muszą pozostać zamknięte podczas trwania eksperymentu. Monitoruj żywotność serca za pomocą kamery oraz ciśnienia perfuzyjnego.
  2. Rejestracja danych
    1. Zastosuj protokół stymulacji, który składa się z serii impulsów prostokątnych o czasie trwania 30 s, po których następuje 30 s przerwy od sygnału. Ustaw wartości parametrów bodźca w każdej serii stymulacji: amplitudę na 2 V, cykl pracy 7 ms i częstotliwość w zakresie od 360 do 720 PPM.
      UWAGA: Protokół stymulacji rozpoczyna się od 360 PPM i zwiększa się o 60 PPM w każdym kolejnym punkcie czasowym (wstawka na Rycynie 2A).
    2. H Ciągle rejestruj filmy z dynamiki widoku frontalnego serca w formacie .avi, korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu (Plik uzupełniający 2). Wykonaj 20-sekundowe nagranie wideo dla każdej serii stymulacji. Nagraj 20-sekundowy segment rozpoczynający się 5 s po stymulacji. Reprezentatywne surowe nagranie znajduje się w Filmie uzupełniającym 1.
      UWAGA: Komputer jednocześnie rejestruje zastosowaną serię stymulacji (.xls, Plik uzupełniający 9) do każdego nagranego wideo (.avi), generowane odpowiednio przez aplikację do monitorowania i stymulacji oraz oprogramowanie do akwizycji obrazu (Plik uzupełniający 2 i Plik uzupełniający 3).
    3. Zweryfikuj żywotność serca, porównując pierwsze wideo, nagrane przed rozpoczęciem protokołu stymulacji, z drugim wideo, nagranym po zastosowaniu protokołu (Rycina 2B).

8. Czyszczenie systemu perfuzji Langendorffa po zakończeniu eksperymentu

  1. Usuń stymulator oraz platynowe elektrody EKG. Wyjmij serce z systemu i odprowadź wszystkie pozostałości roztworu Tyrode'a.
  2. Wyłącz system optyczny i zamknij zawór O2.
  3. Przepłucz system 1 L wody dejonizowanej o temperaturze 37 °C, a następnie opróżnij system.
  4. Powtórz kroki 2.4 i 2.5.
  5. Wyłącz wszystkie systemy i urządzenia.

9. Przetwarzanie wideo

  1. Zacznij od zaimportowania każdego filmu do oprogramowania obliczeniowego i zastosowania funkcji normalizacji wideo15.
  2. Wybierz obszar zainteresowania (ROI), który obejmuje obszar serca. Przeprowadź segmentację obrazu, aby usunąć szumy tła, elektrody oraz kaniulę (Plik uzupełniający 4).
    UWAGA: W celu prawidłowego wybrania obszaru obrazu do usunięcia, należy zapoznać się z Plikiem uzupełniającym 10.
  3. Przeprowadź globalną analizę dynamiki mechanicznej (Plik uzupełniający 5). Przykłady zmienności i sygnałów pomocniczych przedstawiono na Ryc. uzupełniającej S1, Ryc. uzupełniającej S2 oraz Ryc. uzupełniającej S3.
    1. Zastosuj operatory morfologiczne do każdej klatki filmu w celu wykrycia obwodu serca, a następnie zastosuj algorytm wypełniania klatek w celu wygenerowania maski15.
    2. Policz piksele w obrębie segmentowanego obszaru w każdej klatce, a następnie znormalizuj tę liczbę przez całkowitą liczbę pikseli na obrazie, aby uzyskać sygnał dynamiczny (wstawka na Ryc. 2B oraz Ryc. uzupełniającej S3).
    3. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do uzyskanego sygnału, aby stłumić szumy wysokoczęstotliwościowe oraz artefakty wynikające z kapania perfuzyjnego15.
    4. Znormalizuj sygnały we wszystkich filmach, korzystając z zarejestrowanych wartości maksymalnych i minimalnych.
    5. Wyznacz częstotliwość pracy serca, obliczając interwał między dwiema wartościami o maksymalnej amplitudzie (IAA (s)) dla każdego sygnału dynamicznego i stymulacyjnego.
    6. Oblicz częstotliwość w BPM za pomocą poniższego wzoru:
      Wzór na obliczenie częstotliwości, Frequency(BPM)=60/IAA, stosowany w analizie częstotliwości pracy serca.
    7. Wygeneruj mapy Poincarégo z danych IAA, aby zilustrować zmienność w okresach krótkoterminowych i długoterminowych16,17,18 (Ryc. uzupełniająca S1 oraz Ryc. uzupełniająca S2).
      UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w Pliku uzupełniającym 10.
  4. Przeprowadź analizę segmentową dynamiki mechanicznej komór (Plik uzupełniający 6).
    1. Zastosuj binaryzację obrazu. Użyj operatorów morfologicznych do wyznaczenia obszaru komór, dostosowując go do geometrii eliptycznej bez naruszania ROI15.
    2. Dopasuj elipsę minimalną do obszaru komór w każdej klatce. Wyodrębnij współrzędne zestawu punktów dystalnych w klatce. Użyj zestawu 10–20 punktów w każdym ekstremum wzdłuż osi Y (Ryc. 3A). Reprezentatywny wynik szacowania elipsy przedstawiono w Filmie uzupełniającym 2.
    3. Oblicz skrócenie komór jako średnią odległość między punktami ekstremalnymi wzdłuż osi Y w każdym filmie19.
    4. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do uzyskanego sygnału, aby stłumić szumy wysokoczęstotliwościowe oraz artefakty wynikające z kapania perfuzyjnego15.
    5. Znormalizuj sygnał skrócenia komór w odniesieniu do wszystkich filmów uzyskanych dla każdego stymulowania, a następnie oblicz częstotliwość pracy serca i opóźnienie zgodnie z krokami 9.3.5–9.3.6.
      UWAGA: Wyznaczane są parametry takie jak czas trwania cyklu komór (DVE), czas trwania rozkurczu (DVW), interwał międzykomorowy (IVV) oraz amplituda komór (VA) (Ryc. 3A).
      UWAGA: Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w Pliku uzupełniającym 10.
  5. Przeprowadź analizę segmentową dynamiki mechanicznej przedsionków (Plik uzupełniający 7).
    1. Użyj dwóch obszarów ROI do wyznaczenia przedsionków (Ryc. 3C).
    2. Analizuj każdy przedsionek indywidualnie.
      1. Użyj operatorów morfologicznych do wyznaczenia przedsionków, dostosowując je bez naruszania ROI15. Zastosuj algorytm zwiększania kontrastu, aby wyodrębnić każdy przedsionek20,21.
      2. Zastosuj binaryzację obrazu i określ liczbę pikseli różniących się od zera na klatkę, aby uzyskać sygnał dynamiczny przedsionka.
      3. Zastosuj dwukierunkowy filtr Butterwortha 5. rzędu w zakresie od 3 do 100 Hz do uzyskanych sygnałów, aby stłumić szumy wysokoczęstotliwościowe oraz artefakty wynikające z kapania perfuzyjnego15.
      4. Oblicz średnią z dwóch sygnałów przedsionkowych (Ryc. 3D).
    3. Znormalizuj sygnał skrócenia przedsionków w odniesieniu do wszystkich filmów uzyskanych dla każdego stymulowania i oblicz częstotliwość pracy serca oraz opóźnienie zgodnie z krokami 9.3.5–9.3.6.
      UWAGA: Wyznaczane są parametry takie jak czas trwania cyklu przedsionkowego (DAE), interwał przedsionkowy (IAT) oraz amplituda przedsionkowa (AA) (Ryc. 3D). Bardziej szczegółowe informacje znajdują się w Pliku uzupełniającym 10.
  6. Przeprowadź analizę elektromechaniczną13,22 (Plik uzupełniający 8).
    1. Porównaj dane stymulacyjne z sygnałami przedsionkowymi i komorowymi (Ryc. 3D).
    2. Oblicz czas propagacji w systemie przewodzenia serca, wyznaczając opóźnienie między zdarzeniami przedsionkowymi a komorowymi (AVD), przyjmując zastosowany bodziec jako punkt odniesienia.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Doświadczenia dotyczące mechanicznej funkcji serca są przeprowadzane przy użyciu aparatu Langendorffa, jak pokazano na Rysunku 1A (Góra). Systemy monitorowania i optyczne umożliwiają rejestrację wideo po uruchomieniu sterowania oświetleniem, co przedstawiono na Rysunku 1A (Dół). Rysunek 1C ilustruje widok zewnętrzny komory z termostatem, zaprojektowanej w celu izolacji serca od wahań temperatury otoczenia i światła. Jak przedstawiono na Rysunku 1B, izolowane serce jest umieszczone jako obiekt referencyjny w układzie doświadczalnym składającym się z aparatu Langendorffa, systemu optycznego oraz systemów stymulacji.

Jak pokazano na Rysunku 2A, wyizolowane serce ustawiono tak, aby uzyskać wyraźny widok frontalny przedsionków i komór podczas perfuzji wstecznej. Zastosowanie podstawy drenażowej (Plik uzupełniający 1, system drenażu) było niezbędne do tłumienia artefaktów ruchowych generowanych przez kapiący płyn perfuzyjny oraz do stabilizacji rejestrowanych sygnałów. Protokoły stymulacji składały się z serii impulsów (2 V, 7 ms) o częstotliwościach od 360 do 720 bpm, z których każdy trwał 30 s.

Układ optyczny rejestruje zmiany w obszarze serca (HA). Ten dynamiczny sygnał pozwala również na wyznaczenie odstępów czasowych między szczytami (IAA) (wstawka na Rysunku 2B). Żywotność modelu oceniono poprzez porównanie średniej częstotliwości pracy serca przed (Start) i po (End) protokole stymulacji w kohorcie n = 6 serc. Nie stwierdzono istotnych różnic w średniej częstotliwości pracy serca (Start: 385 ± 38 BPM vs. End: 372 ± 18 BPM, test t Studenta P > 0,05), co wskazuje, że procedura eksperymentalna nie wpłynęła na funkcję serca (Rysunek 2B).

Rysunek 2C przedstawia odpowiedź częstotliwościową serca na siedem różnych częstotliwości stymulacji, wykazując wyraźną liniową zależność2 (R2 = 0.98 ± 0.01, tryb 1:1). Minimalna wartość stymulacji jest ograniczona przez cechy fizjologiczne myszy (360 bpm)22,23. Serce perfundowane metodą Langendorffa wykazuje profil tachykardyczny. Reprezentatywne bodźce stymulujące i odpowiadające im reakcje przedstawiono na wstawkach do Rysunku 2C.

Następnie, w celu oceny dynamiki jam serca, zastosowano specyficzne techniki segmentacji. Parametry skracania komór uzyskano z rejestracji optycznych (Rysunek 3A). Wstawka na Rysunku 3A przedstawia znormalizowane skracanie komór. Z tego sygnału dynamicznego wyznaczono cztery parametry: amplitudę skracania komór (VA), odstęp czasowy między skurczami komór (IVV), czas trwania skurczu komór (DVE) oraz czas trwania rozkurczu komór (DVW).

Rycina 3B przedstawia amplitudę skracania komór dla siedmiu wartości stymulacji. Niebieskie słupki reprezentują niniejsze badanie. Pomarańczowe słupki odpowiadają danym uzyskanym za pomocą metody rejestracji auksotonicznej2. Zastosowano analizę statystyczną z wykorzystaniem dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu Sidaka. Amplituda skracania komór (VA) dla wyższych wartości stymulacji, 600 PPM oraz 660 PPM, zwiększa się odpowiednio w sposób istotny (P < 0,05*, P < 0,005**). VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05).

W celu uzyskania obszaru przedsionków zastosowano specjalne techniki segmentacji (Rycina 3C). W każdym przedsionku zdefiniowano obszar zainteresowania (ROI). Rycina 3D przedstawia średni sygnał przedsionkowy oraz skrócenie komór. Z tego sygnału dynamicznego uzyskano dwa parametry: amplitudę przedsionkową (AA) oraz odstęp czasu między skurczami przedsionków (IAT). Poprzez porównanie sygnałów komorowych i przedsionkowych wyznaczono opóźnienie między zdarzeniami przedsionkowymi a komorowymi (AVD).

Schemat i konfiguracja układu Langendorffa do badań kardiologicznych; obejmuje pompę perfuzyjną, układ optyczny.
Rycina 1. Konfiguracja eksperymentalna dla izolowanego serca w układzie Langendorffa oraz układ optyczny zamontowany w obudowie. (A) Schemat systemu perfuzji wstecznej Langendorffa o stałym przepływie sprzężonego z układem optycznym. Układ Langendorffa (góra) obejmuje: (1) zbiornik zawierający stale natleniony roztwór Tyrode'a. Temperatura perfuzatu jest utrzymywana na poziomie 37 °C przez (2) termostat z zbiornikiem oraz (5) wężownicę recyrkulacyjną. (3) Perystaltyczna pompa perfuzyjna zapewnia stały przepływ 3 mL/min. (8) System drenażowy odprowadza roztwór. (4) Wężownica chłodząca służy zarówno jako wymiennik ciepła, jak i pułapka pęcherzyków powietrza. Monitorowanie ciśnienia oraz aplikacje do stymulacji elektrycznej są kontrolowane przez (6) system monitorujący. Układ optyczny (dół) obejmuje synchronizację między (11) sterownikiem oświetlenia, (10) szybką kamerą z obiektywem telecentrycznym a dwoma źródłami światła (LED). Obiektyw kamery umożliwia manualne ustawianie ostrości w zakresie 100–200 mm. (9) Dwie diody LED, sprzężone z soczewką plano-konweksyjną (LI), homogenicznie oświetlają serce. Dane dotyczące stymulacji są rejestrowane za pomocą aplikacji do monitorowania i stymulacji (Supplementary File 11). (7) Komputer sterujący jest połączony z kamerą oraz aplikacją do monitorowania i stymulacji w celu jednoczesnej rejestracji danych (wideo i stymulacja elektryczna). (B) Widok wnętrza obudowy. Pionowa pozycja serca jest pokazana za pomocą obiektu referencyjnego. Przedstawiono pozostałe elementy aparatury Langendorffa. (C) Widok zewnętrzny obudowy. Obudowa jest termoizolowana, a czarne ściany wewnętrzne i zewnętrzne minimalizują refleksy oraz światło otoczenia. Przedstawiono komputer z uruchomionymi aplikacjami do monitorowania i akwizycji wideo. Skróty: LC = obiektyw telecentryczny; LEDs = diody elektroluminescencyjne; LI = soczewka oświetlająca; PC = komputer osobisty. Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.

Heart stimulation experiment setup with ECG; response frequency chart; stimulation frequency graph.
Rycina 2Montaż serca myszy i walidacja układu optycznego. (A) Przedni widok serca z zaznaczonymi przedsionkami, komorami, stymulacją oraz elektrodami EKG. Obraz odpowiada klatce przy stymulacji z częstotliwością 420 uderzeń na minutę (Film uzupełniający 1). Na wstawce przedstawiono zastosowane stymulowanie. Nagranie wideo zostało wykonane między 5. a 25. sekundą protokołu stymulacji. (B) Test żywotności serca. W celu wyznaczenia częstotliwości oscylacji nagrywane są dwa filmy: jeden przed i jeden po zastosowaniu protokołu stymulacji. Obliczana jest częstotliwość odpowiedzi. Student’s t- Zastosowano test (P > 0,05). Różnica między grupami nie jest istotna. Dane przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 6). Wstawka przedstawia powierzchnię serca (HA) uzyskaną w kroku 9.3 protokołu oraz zastosowane stymulowanie. (C) Odpowiedź częstości akcji serca na zastosowane stymulowanie. Niebieskie słupki wskazują odpowiedź serca na siedem wartości stymulacji (R2 = 0,98 ± 0,01). Pomarańczowe słupki odpowiadają danym raportowanym przez Peña-Romo2Wstawka przedstawia typowe przebiegi odpowiedzi. Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu Sidaka. Różnica między grupami nie jest istotna (P > 0,05). Dane przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 6). Skróty: ANOVA = analiza wariancji; BPM = uderzenia na minutę; ECG = elektrokardiogram; HA = obszar serca; PPM = tętno na minutę. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.

Obrazowanie serca i analiza wykresów; vs/RA+LA; wykres amplitudy; znormalizowane wyniki; ustawienie eksperymentalne.
Rysunek 3. Analiza mechanicznej odpowiedzi przedsionków i komór. (A) Skrócenie komór. Obraz odpowiada klatce przy stymulacji 420 bpm (Supplementary Movie 1). Czerwona elipsa umożliwia oszacowanie skrócenia komór (VS) (Supplementary Movie 2). VS oblicza się poprzez uśrednienie wartości maksymalnych i minimalnych wzdłuż zestawu 10–20 linii wzdłuż osi głównej (NV; pomarańczowe linie). Znormalizowane skrócenie komór przedstawiono na wstawce. Można uzyskać następujący zestaw parametrów: czas trwania skrócenia (DVE), czas trwania rozkurczu (DVW), odstęp czasu między skurczami komór (IVV) oraz amplitudę skrócenia komór (VA). (B) Przedstawiono amplitudę odpowiedzi serca, VA w funkcji stymulacji. Niebieskie słupki reprezentują niniejsze badanie. Pomarańczowe słupki odpowiadają danym otrzymanym metodą rejestracji aukotonicznej2. Zastosowano analizę statystyczną z wykorzystaniem dwuczynnikowej analizy wariancji (ANOVA), a następnie testu Sidaka. Amplituda skrócenia komór (VA) dla wyższych wartości stymulacji, 600 PPM i 660 PPM, wzrasta znacząco (odpowiednio P < 0,05*, P < 0,005**). VA (ref. 15 vs. 360 P > 0,05, ref. 15 vs. 420 P > 0,05, ref. 15 vs. 480 P > 0,05, ref. 15 vs. 540 P > 0,05, ref. 15 vs. 600 P < 0,005, ref. 15 vs. 660 P < 0,05, ref. 15 vs. 720 P > 0,05). Dane przedstawiono jako wartości średnie ± odchylenie standardowe (n = 6). (C) Segmentacja przedsionków. Obraz odpowiada klatce przy stymulacji 420 bpm (Supplementary Movie 1). Obraz ilustruje obszary zainteresowania (ROI) zastosowane do prawego przedsionka (żółte koło) oraz lewego przedsionka (niebieskie koło). Mechaniczny sygnał przedsionkowy uzyskuje się poprzez uśrednienie obu ROI. (D) Dynamika przedsionków i komór. Przedstawiono znormalizowane odpowiedzi dla średniej powierzchni przedsionków (czarna linia), skrócenia komór (niebieska linia) oraz stymulację (czerwona linia) przy 420 bpm. Można uzyskać zestaw parametrów: odstęp czasu między skurczami przedsionków (IAT), średnią amplitudę przedsionkową (AA) oraz opóźnienie przedsionkowo-komorowe (AVD). Skróty: AA = amplituda przedsionkowa; ANOVA = analiza wariancji; AVD = opóźnienie przedsionkowo-komorowe; DVE = czas trwania skrócenia komór; DVW = czas trwania rozkurczu komór; IAT = odstęp przedsionkowo-przedsionkowy; IVV = odstęp międzykomorowy; NV = liczba linii komorowych; PPM = impulsów na minutę; ROI = obszar zainteresowania; VA = amplituda skrócenia komór; VS = skrócenie komór. Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.

Film uzupełniający 1. Wideo podczas stymulacji 420 PPM. Nagranie izolowanego serca myszy wykonane z rozdzielczością przestrzenną 200 x 200 subpikseli i rozdzielczością czasową 750 fps. Skróty: fps = klatek na sekundę; PPM = impulsów na minutę.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Film uzupełniający 2. Reprezentatywny film obrazujący szacowanie elipsy dla skracania komory. Prezentacja algorytmu segmentacji z wykorzystaniem nagrania z filmu uzupełniającego 1, przejątkowanego do częstotliwości 75 fps. Skrót: fps = frames per second (klatki na sekundę).Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S1. Analiza zmienności odstępów pola powierzchni serca. (A) Stan podstawowy bez stymulacji, (B) 360 PPM, (C) 420 PPM oraz (D) 480 PPM. Zmienność krótkoterminową i długoterminową obliczono jako rozproszenie względem średniej danych, co zaznaczono czerwoną elipsą. Skróty: IAA = odstęp pola powierzchni serca; PPM = impulsy na minutę; SD1 = zmienność krótkoterminowa; SD2 = zmienność długoterminowa.Kliknij tutaj, aby pobrać ten plik.

Rycina uzupełniająca S2. Analiza zmienności odstępów powierzchni serca. (A) 540 PPM, (B) 600 PPM, (C) 660 PPM oraz (D) 720 PPM. Zmienność krótkoterminowa i długoterminowa zostały obliczone jako rozproszenie względem średniej danych, zaznaczone czerwoną elipsą. Skróty: IAA = odstęp powierzchni serca; PPM = liczba uderzeń na minutę; SD1 = zmienność krótkoterminowa; SD2 = zmienność długoterminowa.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Rysunek uzupełniający S3. Wykres czasowy znormalizowanych sygnałów uzyskanych z dynamiki skurczowej. Zastosowany bodziec wynosił 420 PPM (kolor czerwony), a odpowiedzi obejmują globalny obszar serca (kolor czarny), skrócenie komór (kolor niebieski) oraz dynamikę obszaru przedsionków (kolor żółty). Skrót: PPM = uderzenia na minutę.Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Pliki uzupełniające 1–11. Algorytmy i dokumentacja techniczna. Skompresowany folder zawierający: 1) Obrazy i specyfikacje części wydrukowanych w technologii 3D. 2) Szczegółowe instrukcje do oprogramowania do akwizycji obrazu z kamery. 3) Szczegółowe instrukcje do aplikacji do monitorowania i stymulacji. 4) Program komputerowy do normalizacji i segmentacji wideo (kroki 9.1–9.2). 5) Program komputerowy do obliczania globalnej mechaniki serca (krok 9.3). 6) Program komputerowy do segmentacyjnego obliczania mechaniki komór (krok 9.4). 7) Program komputerowy do segmentacji mechaniki przedsionków (krok 9.5). 8) Program komputerowy do obliczania opóźnienia przedsionkowo-komorowego (krok 9.6). 9) Stymulacja elektryczna zastosowana do filmu uzupełniającego 1. 10) Szczegółowa instrukcja obsługi programów komputerowych (pliki 4–7). 11) Aplikacja do monitorowania i stymulacji. Dodatkowo wymagane do działania programów komputerowych są pięć funkcji zewnętrznych (AumCont, filterPeaks, FucCordenada, FucMaskIm, FucPoincare).Prosimy kliknąć tutaj, aby pobrać ten plik.

Dyskusja

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Serce myszy jest bardzo wrażliwe na wahania temperatury2,9,10,11,22. W tym eksperymencie perfundowane serce zostało umieszczone w pozycji pionowej. Wprowadziliśmy niewielką modyfikację metody perfuzji Langendorffa, aby zminimalizować spadek temperatury perfuzatu oraz artefakty ruchowe. Do układu wężowatego dodano pompę recyrkulacyjną w celu zminimalizowania utraty temperatury perfuzatu utrzymywanego na poziomie 37 ± 0.5 °C, a także dodano podstawę drenażową, aby ograniczyć artefakty ruchowe. Ponadto zastosowano termoizolowaną komorę wyposażoną w system optyczny i dwa źródła światła LED o regulowanej intensywności, rozmieszczone symetrycznie, aby równomiernie naświetlać tkankę serca, co przedstawiono na Rysunku 1.

Aby zbadać wykonalność eksperymentalnego montażu, przeprowadzono zestaw doświadczeń w celu śledzenia zmian powierzchni serca w różnych warunkach stymulacji. Uzyskano zakres synchronizacji między stymulacją a odpowiedzią częstotliwościową serca, zgodny z obszarem synchronizacji zgłoszonym przez Peña-Romo2, który zastosował metodę zapisu auksotonicznego8. Można wywnioskować, że optyczny układ eksperymentalny jest wystarczający do przeprowadzenia dalszych badań nad skracaniem się komór (Rysunek 2).

Dalsze badania miały na celu ustalenie, czy sygnały dynamiki skracania się komór oraz pola przedsionków umożliwiają analizę sprzężenia elektromechanicznego serca. Sygnały komorowe i przedsionkowe pozwalają na określenie czasu opóźnienia skurczu przedsionkowo-komorowego (AVD). Przy częstotliwości stymulacji 420 PPM uzyskano wartość 53 ± 14 ms (średnia ± SD). Wynik ten jest zgodny z danymi VanderBrinka24, który zgłasza odstęp PR wynoszący 44 ± 6 ms mierzony za pomocą elektrokardiogramu (ECG).

Metoda ta ma również pewne ograniczenia; niedokładność w pomiarze opóźnienia przedsionkowo-komorowego w porównaniu z technikami EKG oraz amplitudy komorowej w porównaniu z wynikami uzyskanymi za pomocą metody rejestracji auksotonicznej, jak pokazano na Rysunku 3B, może wynikać z zewnętrznych artefaktów ruchowych.

Metoda ta przyczynia się do oceny kurczliwości i częstotliwości akcji serca bez wpływów farmakologicznych lub systemowych w nienaruszonym, izolowanym sercu. Wyniki te wykazują, że system optyczny umożliwia pomiar odpowiedzi skrócenia komór i przedsionków serca, podkreślając jego użyteczność w badaniach nad arytmiami zaburzającymi koordynację przedsionkowo-komorową lub w ocenie efektów farmakologicznych.

Metoda ta posiada również pewne ograniczenia. Po pierwsze, ponieważ jest to przybliżenie 2D, nie można zmierzyć siły skurczu w taki sposób, jak w metodzie aukotonicznej. Metoda ta jest również korzystna w celu redukcji artefaktów ruchowych powstających w wyniku spadania kropel roztworu oraz w celu kontroli temperatury roztworu. Po drugie, różnice płciowe w modelach mysich mają istotny wpływ na ważność, powtarzalność i bezpieczeństwo badań biomedycznych. Historycznie badacze w dużej mierze preferowali samce myszy, aby uniknąć zmienności danych spowodowanej cyklami rujowymi u samic, co okazało się założeniem w znacznym stopniu błędnym25,26. W zależności od rodzaju badania, protokół ten można stosować w badaniach z udziałem samców lub samic myszy.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów.

Podziękowania

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Praca ta była wspierana przez grant nr LN-2025-C-23 finansowany przez Sekretariat Nauki, Humanistyki, Technologii i Innowacji (SECIHTI).

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
strzykawka 1 mLBD Plastipak302485procedura chirurgiczna
igła 20 GNIPROAH-2032kaniula aortalna
regulowana soczewka 25 mm z powiększeniem 8x-100xGenericN/Asoczewka kamery systemu optycznego; określona ogólnie jako regulowana soczewka kamery
igła 27 GBD PrecisionGlide302358procedura chirurgiczna
elementy wspierające projektowane w 3DCINVESTAVN/Aniestandardowe elementy wspierające projektowane w 3D
szew jedwabny 4-0AMERICAN SUTURETGSN0901kaniula aortalna
zasilacz 40-ASTERENPRL-25zasilacz LED
kamień napowietrzającyN/AN/Anatlenianie roztworu Tyroda
CaCl2 (2H2O)Sigma-AldrichC3306roztwór Tyroda
D-glukozaJ.T. Baker1916-01roztwór Tyroda
pompa drenażowaCINVESTAVN/Aniestandardowa pompa drenażowa; określona ogólnie jako pompa drenażowa
soczewka plano-konweksowa, F = 25,4 mmTHORLABSLA1951-Asoczewka oświetlająca systemu optycznego; określona ogólnie jako plano-konweksowa soczewka oświetlająca
lodowaty kwas octowySigma-Aldrich695092czyszczenie systemu Langendorffa
heparynaPiSA060M91antykoagulant
HEPESSigma-AldrichH3375roztwór Tyroda
diody LED o wysokiej mocyLuminiusCBT-90-G-L11-C12źródło światła LED
system oświetleniaCINVESTAVN/Aniestandardowy system oświetlenia; określony ogólnie jako system oświetlenia
KClCTR SCIENTIFICCTR02196roztwór Tyroda
oprogramowanie LabVIEW wersja 2018NATIONAL INSTRUMENTSN/Aoprogramowanie użyte do aplikacji monitorowania i stymulacji; określone ogólnie jako aplikacja monitorowania i stymulacji
oprogramowanie MATLABThe MathWorksN/Aoprogramowanie obliczeniowe dla programów normalizacji, segmentacji i analizy wideo; określone ogólnie jako oprogramowanie obliczeniowe
tlen medycznyGRUPO INFRAN/Anatlenianie roztworu Tyroda
MgCl2 (6H2O)CTR SCIENTIFICCTR02104roztwór Tyroda
mini-pompa o zmiennym przepływieCONTROL COMPANY3385pompa perfuzyjna
zestaw chirurgiczny do myszyKent ScientificINSMOUSEKITprocedura chirurgiczna
NaClSigma-AldrichS5886roztwór Tyroda
NaH2PO4DEQDEQF290400250roztwór Tyroda
NaOHCTR SCIENTIFICCTR03108regulacja pH
NI USB-6009NATIONAL INSTRUMENTS779026-01karta akwizycyjna
elektrody platynowe, średnica 0,25 mmSigma-Aldrich349402elektrody do stymulacji elektrycznej
zasilacz (12 V, 30 A)KarnickPTA-12V30Azasilacz recyrkulatora
monitor ciśnieniaCINVESTAVN/Aniestandardowy monitor ciśnienia; określony ogólnie jako monitor ciśnienia
przetwornik ciśnieniaLA BOUVETB17295monitor ciśnienia systemu Langendorffa
czysty alkohol etylowySigma-Aldrich493511etanol do czyszczenia systemu
recyrkulacyjna kąpiel termostatyczna (LXC)PolyScienceL113A0412recyrkulator zbiornika
roztwór soli fizjologicznejPiSA1118480,9% roztwór chlorku sodu (NaCl)
serpentynowa kąpiel termostatycznaCINVESTAVN/Aniestandardowy recyrkulator serpentynowy/kąpiel termostatyczna
stereomikroskopN/AN/Aprocedura chirurgiczna
oświetlenie stereomikroskopuN/AN/Aprocedura chirurgiczna
oprogramowanie uEye CockpitIDS Imaging Development System GmBHN/Aoprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery; określone ogólnie jako oprogramowanie do akwizycji obrazu z kamery
UI-3360CP-NIR-GL Rev.2IDSAB00624szybka kamera CMOS; określona ogólnie jako kamera CMOS
ksylazynaPiSA4001211środek anestetyczny
Zoletil 100Virbac83048907środek anestetyczny tiletamina-zolepazem; określony ogólnie jako mieszanka anestetyczna

Bibliografia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Guarina L et al. Biological noise is a key determinant of the reproducibility and adaptability of cardiac pacemaking and EC coupling. J Gen Physiol. 2022;154(9):e202012613.
  2. Peña-Romo A et al. Noise enhanced the electrical stimulation-contractile response coupling in isolated mouse heart. Int J Cardiol. 2016;221:155-60.
  3. Bychkov R et al. Synchronized cardiac impulses emerge from heterogeneous local calcium signals within and among cells of pacemaker tissue. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):907-31.
  4. Clancy CE, Santana LF. Evolving discovery of the origin of the heartbeat: a new perspective on sinus rhythm. JACC Clin Electrophysiol. 2020;6(8):932-4.
  5. Asamudo EU, Ng YH, Bers DM. Langendorff isolated heart perfusion model for functional studies in mice. In: Chandrasekera DNK, Katare R, editors. Cardiomyocytes: Methods and Protocols. Springer Nature; New York; 2025. p. 111-24.
  6. Louradour J et al. Simultaneous assessment of mechanical and electrical function in Langendorff-perfused ex vivo mouse hearts. Front Cardiovasc Med. 2023;10:1293032.
  7. Noly PE et al. Assessment of ex vivo murine biventricular function in a Langendorff model. J Vis Exp. 2022;(190):e64384.
  8. Beckett PR. The isolated perfused heart preparation: two suggested improvements. J Pharm Pharmacol. 1970;22(11):818-22.
  9. Ihara K et al. Electrophysiological assessment of murine atria with high-resolution optical mapping. J Vis Exp. 2018;(132):e56478.
  10. King DR, Hardin KM, Hoeker GS, Poelzing S. Reevaluating methods reporting practices to improve reproducibility: an analysis of methodological rigor for the Langendorff whole heart technique. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2022;323(3):H363-77.
  11. Lang D, Sulkin M, Lou Q, Efimov IR. Optical mapping of action potentials and calcium transients in the mouse heart. J Vis Exp. 2011;(55):e3275.
  12. Liao R, Podesser BK, Lim CC. The continuing evolution of the Langendorff and ejecting murine heart: new advances in cardiac phenotyping. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(2):H156-67.
  13. Sung YL, Tsai YS, Chang CL, Hu YF. Protocol for high-resolution optical mapping of ex vivo rat heart for electrophysiological studies. STAR Protoc. 2025;6(2):103734.
  14. Lee P et al. Low-cost optical mapping systems for panoramic imaging of complex arrhythmias and drug-action in translational heart models. Sci Rep. 2017;7:43217.
  15. Laughner JI et al. Processing and analysis of cardiac optical mapping data obtained with potentiometric dyes. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2012;303(7):H753-65.
  16. Hao X et al. TGF-β1-mediated fibrosis and ion channel remodeling are key mechanisms in producing the sinus node dysfunction associated with SCN5A deficiency and aging. Circ Arrhythm Electrophysiol. 2011;4(3):398-406.
  17. Pizzo E et al. Heart rate variability reveals altered autonomic regulation in response to myocardial infarction in experimental animals. Front Cardiovasc Med. 2022;9:843144.
  18. Tayel MB, AlSaba EI. Poincaré plot for heart rate variability. Int J Biomed Biol Eng. 2015;9(9).
  19. Bazan C, Barba DT, Blomgren P, Paolini P. Image processing techniques for assessing contractility in isolated adult cardiac myocytes. Int J Biomed Imaging. 2009;2009:352954.
  20. Christoph J, Luther S. Marker-free tracking for motion artifact compensation and deformation measurements in optical mapping videos of contracting hearts. Front Physiol. 2018;9:1483.
  21. Lebert J, Ravi N, Kensah G, Christoph J. Real-time optical mapping of contracting cardiac tissues with GPU-accelerated numerical motion tracking. Front Cardiovasc Med. 2022;9:787627.
  22. Larsen TS et al. The isolated working mouse heart: methodological considerations. Pflugers Arch. 1999;437:979-85.
  23. Vornanen M. Basic functional properties of the cardiac muscle of the common shrew (Sorex araneus) and some other small mammals. J Exp Biol. 1989;145:339-51.
  24. VanderBrink BA et al. Assessment of atrioventricular nodal physiology in the mouse. J Interv Card Electrophysiol. 1999;3(3):207-12.
  25. Shansky RM, Murphy AZ. Considering sex as a biological variable will require a global shift in science culture. Nat Neurosci. 2021;24(4):457-64.
  26. Shansky RM. Are hormones a “female problem” for animal research? Science. 2019;364(6443):825-6.

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

Serca w perfuzji wed ug metody Langendorffamodel serca mysiegoocena optycznakurczliwo przedsionk wkurczliwo kom rpomiar cz stotliwo ciy rytmu sercaobrazowanie o wysokiej rozdzielczo ciskr cenie kom rdynamika przedsionk wmechanika serca
Film wkrótce dostępny

Powiązane artykuły