Macierz mikronapędów do chronicznych pomiarów in vivo: montaż tetrod

W niniejszym protokole opisujemy wykonanie i implantację wiązek Tetros składających się z czterech elektrod do przewlekłych pomiarów in vivo u budzących się gryzoni, rozpoczynając od procesu wytwarzania tetrod. Pasmo przewodów mikroelektrodowych jest dwukrotnie składane, aby utworzyć wiązkę czterech równoległych przewodów. Następnie przewody te są ze sobą skręcane i utrwalane za pomocą opalarki.

Każdy gotowy tero jest umieszczany w pudełku do przechowywania. W miarę wytwarzania kolejnych teros, każdy z nich jest wprowadzany do dedykowanego kanału, wchodząc przez otwór w siłowniku liniowym i wychodząc u podstawy macierzy mikronapędów. Każdy z czterech przewodów tero jest podłączany do oddzielnych pinów na płytce złączowej wyjściowej przymocowanej do górnej części macierzy mikronapędów.

Impedancja każdego kanału tero jest obniżana przy użyciu procesu złocenia galwanicznego. Po zainstalowaniu i pozłaceniu wszystkich tero, dwa przewody uziemiające są mocowane do odpowiednich pinów na płytce złącza, a do ramy macierzy mikroelektrod mocowany jest stożek ochronny w celu zabezpieczenia układu po uziemieniu stożka, tworząc w pełni funkcjonalne macierze mikroelektrod Tero gotowe do implantacji. Cześć, jestem Dave Nian z laboratorium Nat Wilson w Instytucie Uczenia się i Pamięci Pickout.

Dzisiaj w MIT zaprezentujemy procedurę wytwarzania terosów, ich ładowania oraz końcowych etapów rekonstrukcji mikroprzewodu. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania skoordynowanej aktywności neuronalnej pomiędzy dużymi populacjami a neuronami w preparacie zwierzęcia budzącego się i wykazującego zachowania. Zatem zacznijmy.

Aby zbudować tero dla naszego standardowego układu mikro-napędów, rozpoczynamy od 50 centymetrów izolowanego drutu mikro-miedzianego o grubości 12 mikronów. Złóż drut na pół, a następnie przesuń palcami wzdłuż obu pasm, aby je do siebie docisnąć. Upewnij się, że oba druty mają dobry kontakt na całej swojej długości.

Ponownie złóż parę, trzymając oba końce razem. Upewnij się, że pętla utworzona na jednym końcu nie jest załamana. Odetnij cztery druty na końcówce bez pętli w taki sposób, aby cztery końcówki były wyrównane.

W następnym kroku będą potrzebne zmodyfikowany zacisk typu „krokodylk”, zmotoryzowane urządzenie obrotowe oraz poprzeczny drążek nad urządzeniem obrotowym. Zacisk typu „krokodylk” modyfikuje się poprzez przyklejenie plastikowego pręta do jego podstawy. Gdy końcówki są odsłonięte, należy z clampować cztery przewody za pomocą zmodyfikowanego zacisku typu „krokodylk”.

Zawieś pętlę z drutu na poziomym pręcie. Umieść klips krokodylkowy w zmotoryzowanym stole. Wykonaj 80 skrętów zgodnie z ruchem wskazówek zegara, a następnie 40 skrętów przeciwnie do ruchu wskazówek zegara w wiązce drutów w czasie około trzech minut.

Parametry te można zmieniać zgodnie z własnymi potrzebami. Po zakończeniu skręcania tero, zespawaj druty ze sobą, podgrzewając je opalarką z trzech różnych kątów, stosując średni lub niski przepływ powietrza dla każdego z kątów; zacznij jeden do dwóch centymetrów poniżej miejsca, w którym wiązka drutów się rozdziela. Następnie prowadź opalarkę w dół i w górę w odległości dwóch centymetrów od drutów przez około pięć sekund.

Należy zachować ostrożność, ponieważ wysokie temperatury spowodują całkowite stopienie izolacji i doprowadzą do zwarć. Po stopieniu się drutów, usuń tero z urządzenia do skręcania, delikatnie podnosząc zacisk krokodylkowy, aby zmniejszyć naprężenie tero, a następnie przetnij tero w pobliżu zacisku. Z drugiej strony przetnij pętlę tak, aby otrzymać cztery nieoznakowane pasma drutu o jednakowej długości. Następnie rozdziel poszczególne pasma u góry, delikatnie odginając druty pęsetą z miękkimi końcówkami.

Tero jest teraz gotowy do załadowania do macierzy mikronapędów. Przygotuj od 21 do 25 dodatkowych dróg Tet i przechowuj je w wolnym od kurzu pudełku do momentu rozpoczęcia procesu ładowania tero. Jeśli jeszcze go nie zbudowałeś, będziesz potrzebować kompletnej macierzy mikronapędów.

W naszym planie projektowym należy odnieść się do wideo dotyczącego macierzy napędów mikroelektrod do chronicznych pomiarów in vivo w celu wykonania macierzy mikro-napędów. Tero zostanie przymocowany jednym końcem do sprzętu złączy i zostanie przeprowadzony przez rurkę nośną z polimidu w mikro-napędzie w taki sposób, aby końcówki elektrod wystawały poniżej podstawy macierzy mikro-napędów. Przedemonstrujemy teraz ten proces ładowania dla jednego tero.

Przed rozpoczęciem należy zbudować uchwyt napędowy, który z jednej strony można przymocować do płytki złączy, a z drugiej zacisnąć w kąpieli lodowej. W tym przykładzie uchwyt napędowy stanowi złącze milax przyklejone do jednego końca rękojeści noża X exacto. Trzymając tero pęsetą z miękkimi końcówkami i korzystając ze stereoskopu, wsuń końcówkę tero do rurki nośnej poly mid jednego z mikro napędów. Wsuwaj Tet road do rurki, aż poszczególne przewody elektrod znajdą się blisko płytki złączy na górze macierzy napędowej; należy przy tym uważać, aby nie zgiąć przewodów, ponieważ spowoduje to wprowadzenie tetro do mózgu pod kątem, a nie prostopadle, co osłabi integralność tero.

Teraz ostrożnie wprowadź drugi koniec czterech przewodów do odpowiednich otworów w płytce interfejsu elektrod, używając pęsety z miękkimi końcówkami. Ponownie unikaj załamywania lub zginania przewodów. Po umieszczeniu wszystkich czterech przewodów, dociśnij złote piny do otworów za pomocą szczypiec z przyciętą dolną szczęką.

Po wsunięciu pinów do otworu, izolacja przewodu zostanie usunięta, co stworzy połączenie elektryczne do późniejszego wykorzystania. Należy monitorować mapowanie między mikronapędami a pozycją pinów na płytce interfejsu elektrod. Kontynuuj ładowanie, aż do uzyskania łącznie 18 tetrod.

Trzy pozostałe mikropopychacze w matrycy zostaną wykorzystane do umieszczenia elektrod odniesienia. Każda elektroda odniesienia składa się z tero, który wykorzystuje tylko jeden z czterech niewiązanych yns. Aby zamocować elektrody odniesienia, należy postępować zgodnie z procedurą ładowania, jednak do odpowiedniego pinu elektrody odniesienia na płytce złączy należy przymocować tylko jedną z czterech elektrod.

Jeśli planują Państwo rejestracje z wielu obszarów, warto wcześniej zaplanować połączenia między tetrodami a płytką złącza. Na przykład można zgrupować na płytce interfejsu elektrod tetrody skierowane do jednego regionu anatomicznego. Powinno to zminimalizować ryzyko regulacji niewłaściwej tetrody podczas przeprowadzania eksperymentów.

Po zakończeniu ładowania tero, przygotuj dwa przewody uziemiające: jeden dla zwierzęcia i jeden dla stożka ochronnego. Odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości six inch i za pomocą metalowej pęsety usuń trzy millimeters izolacji z każdego końca drutu. Następnie odetnij kawałek izolowanego stalowego drutu o długości four inch.

Usuń trzy milimetry izolacji z jednego końca i jeden centymetr z drugiego końca. Przeciągnij sześciocalowy przewód uziemiający przez otwór z boku macierzy mikroprzewodów w górę, w stronę płyty interfejsu. Połącz odsłonięty przewód z płytą interfejsu elektrod za pomocą złotego pinu w wyznaczonym otworze uziemiającym.

Ten przewód zostanie podłączony do czaszki zwierzęcia. Poprowadź czterocalowy przewód uziemiający równolegle do wcześniej zainstalowanego przewodu uziemiającego. Podłącz odsłonięty koniec o długości 3 mm do płytki interfejsu elektrod, używając złotego pinu w innym wyznaczonym otworze uziemiającym.

Ten przewód zostanie później podłączony do ochronnego stożka, który będzie pełnił funkcję małej klatki Faradaya, aby zredukować zakłócenia. Zakończyliśmy już podłączanie przewodów i możemy przejść do dopracowania naszych teros. Naszym celem w tym procesie jest przycięcie wszystkich teros tak, aby były nieco dłuższe niż głębokość docelowej struktury mózgu w naszym przykładzie.

Mikrod라이wy zostały zaprojektowane dla maksymalnego zasięgu od pięciu do sześciu milimetrów, co jest wystarczające, aby dotrzeć do wielu obszarów neocortex oraz grzbietowej części hipokampa dorosłego szczura. Najpierw należy opuścić wszystkie mikrodraywy tak, aby tetrody były jednocześnie maksymalnie odsłonięte. Następnie należy przyciąć wszystkie tetrody do długości o około pięć milimetrów większej niż pożądana długość końcowa, używając do ostatniego cięcia pary ostrych, precyzyjnych nożyczek.

Przygotować parę ząbkowanych nożyczek w naczyniu z lodem, zacisnąć jeden uchwyt pod lekkim kątem w dół, z ząbkami skierowanymi do góry, pozostawiając drugi uchwyt swobodnie zwisający. Następnie całkowicie wycofać wszystkie elektrody Tet do ich kaniul prowadzących, obracając mikronapędami w górę. Używając stereoskopu, w pełni wysunąć jedną elektrodę z kaniuli.

Za pomocą linijki ustaw nożyczki z ząbkami w pożądanej odległości od prowadnicy kaniuli. Powoli i delikatnie przetnij tero jednym płynnym ruchem. Po przecięciu tero wycofaj mikronapęd do góry o trzy do czterech milimetrów.

Powtórz ten proces dla każdego tero, aż wszystkie zostaną przecięte. W tym momencie można przystąpić do pozłacania. Pozłacanie.

Powłoka z rutenu jest kluczowa dla stabilnych pomiarów w długim terminie. Zapobiega ona korozji i poprawia biokompatybilność. Skonfiguruj miernik impedancji w trybie zewnętrznym w generatorze prądu oraz w trybie kontroli DC z wyjściem audio.

Przyłożyć dwa przewody generatora prądu do sześciu możliwych par kanałów w każdym tero i wykorzystać sygnał dźwiękowy do ustalenia, czy między parami występują zwarcia. Zwarcie między parami kanałów brzmi w ten sposób. W przypadku stwierdzenia zwarcia, należy ponownie przeciąć tero nożyczkami ząbkowanymi i powtórzyć test.

Jeśli problem nie ustąpi, należy zutylizować drogę Tet i ją wymienić. Przesuń wszystkie mikronapędy w dół, wysuwając wszystkie drogi Tet tak daleko, jak to możliwe. Zmodyfikuj konfigurację aparatury w celu sprawdzenia impedancji elektrod.

Teraz zanurz końcówki wszystkich terod w kąpieli standardowego roztworu do pozłacania. Kąpiel złota jest połączona elektrycznie z ujemnym przewodem miernika impedancji. Sprawdź impedancję elektrody, dotykając dodatnim przewodem miernika impedancji odpowiedniego pinu na płytce złączy.

Zmierz i zapisz impedancję każdego przewodu w matrycy mikronapędów. Normalne wartości w generatorze prądu mieszczą się w zakresie od 1 do 3 megaomów. Ustaw natężenie prądu w przedziale od 1 do 3 µA.

Następnie bezpiecznie podłącz dodatni przewód miernika impedancji do pinu na płytce złącza. Na mierniku impedancji.

Szybko przełączaj z trybu normalnego na tryb pomijania (bypass), a następnie z powrotem, pozostając w trybie pomijania. Prąd przepłynie przez ścieżkę Tet i roztwór złota, a na końcówce elektrody zostanie osadzone złoto. Impedancja po każdej serii platerowania powinna być niższa niż przed nią.

Powtórz bieżący impuls. Jeśli impedancja nie spadła poniżej 1 MΩ. Konserwatywny zakres dopuszczalnych impedancji wynosi od 250 kΩ do 350 kΩ.

Jeśli impedancja spadnie poniżej 200 kilo ohms, może to wskazywać na zwarcie. Jeśli po wielokrotnych impulsach impedancja nie spadnie w wystarczającym stopniu, końcówka elektrody może być zablokowana. Należy ponownie przyciąć tero, sprawdzić pod kątem zwarć i powtórzyć proces pozłacania.

Jeśli ponowne cięcie nie pomoże, należy wymienić tero i rozpocząć procedurę od nowa. Po osadzeniu wszystkich teros należy zanurzyć je w etanolu i pozostawić do odparowania przez trzy do pięciu minut. Za pomocą generatora prądu należy sprawdzić, czy w obrębie teros nie występują zwarcia, gdy końcówki teros są wystawione na działanie powietrza.

Jeśli między dwiema lub więcej elektrodami tero występuje połączenie DC, należy ponownie wyciąć tero i ponownie pokryć je złotem. Po zakończeniu złocenia wszystkich tero, należy przenieść wszystkie tero do napędu. Jako ostatni krok, na górnej części każdego mikro-napędu, należy nanieść kroplę średniolepkiego kleju cyjanoakrylowego na miejsce styku każdego tero z odpowiadającą mu rurką polimerową.

Zapewni to stabilne zamocowanie tero do micro drive. Celem osłony ochronnej jest zabezpieczenie micro drives oraz odsłoniętego przewodu tero przed wpływem środowiska. Zapewnia ona również wsparcie podczas manipulacji w trakcie eksperymentu i redukuje szumy elektryczne.

Używamy wydrukowanego w technologii 3D plastikowego stożka. Można jednak wykonać stożek z innych materiałów, na przykład z wygiętego kawałka puszki po napoju. Można również wziąć plastikowy stożek i przymocować taśmę aluminiową do jego wewnętrznej lub zewnętrznej powierzchni.

Najpierw wkręć i częściowo obróć 3 śruby rozmiaru 1 72 o długości trzech szesnastych cala w boki stożka, gdy zespół napędowy jest zawieszony. Nałóż stożek na napęd. Upewnij się, że oba przewody uziemiające wystają z dołu zespołu napędowego.

Owiń odsłoniętą część czterocalowego przewodu uziemiającego kilka razy wokół jednej ze śrub 1 72 i mocno dokręć śrubę. Mocno przymocuj stożek do podstawy napędu, dokręcając pozostałe dwie śruby stożka. Produkcja mikrotablicy napędowej jest teraz zakończona. Twoja mikrotablica napędowa jest załadowana 18 terosami w trzech referencjach.

Dla zapewnienia trwałości jest on zamknięty w ochronnym stożku i nakrętce. Gotowy napęd waży zazwyczaj średnio od 20 do 25 g.

Gotowy zestaw elektrod jest implantowany zgodnie ze standardową procedurą chirurgiczną. Jak widać, zestaw jest połączony z układem przedwzmacniacza oraz wiązką przewodów, które przesyłają sygnał do sprzętu i oprogramowania do akwizycji danych. Przedstawiliśmy właśnie sposób wykonania teros oraz pełną procedurę konstrukcji mikroelektrodowego zestawu napędowego.

W tym filmie pokazaliśmy, jak wykonać terosy oraz jak je ładować i przygotować do rejestracji in vivo. Dodatkowo zaprezentowaliśmy sposób zamocowania stożka do matrycy mikronapędu, aby zwiększyć jej trwałość w czasie. Konstrukcja matrycy mikronapędu składa się z wielu etapów, dlatego należy zachować cierpliwość, obchodzić się z elektrodami z delikatnością i upewnić się, że wszystkie kroki pośrednie zostały prawidłowo wykonane.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.