Metody elektrofizjologiczne rejestracji potencjałów synaptycznych z złącza nerwowo-mięśniowego larw Drosophila
6 lutego 2009
W niniejszej pracy opisujemy metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym larwy Drosophila. Uwalnianie wywołane inicjuje się sztucznie poprzez stymulację aksonów neuronów ruchowych, a przekaźnictwo w złączu NMJ można zmierzyć na podstawie odpowiedzi postsynaptycznej wywołanej w mięśniu.
Aby uzyskać stabilne zapisy elektrofizjologiczne z złączy nerwowo-mięśniowych larwy Joof. Najpierw należy przeprowadzić wiwisekcję larwy, aby odsłonić ścianę ciała, mięśnie i układ nerwowy przed rozpoczęciem pomiarów. Aksony u podstawy OUN są przecinane za zwojem brzusznym.
Następnie elektrodę rejestrującą umieszcza się na badanym mięśniu, a elektrodę stymulującą w pobliżu unerwiających go neuronów ruchowych. Przecięte aksony neuronów ruchowych są zasysane do pipety stymulującej. Można wówczas rejestrować pobudzające potencjały złącza.
Witajcie, jestem Wendy MLA z laboratorium McCabe w Katedrze Fizjologii i Biofizyki Komórkowej na Uniwersytecie Columbia. Dzisiaj przedstawimy procedurę pomiaru transmisji synaptycznej w złączu nerwowo-mięśniowym larw GE. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania fizjologii synaptycznej i neurotransmisji.
Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć eksperyment, przeprowadź sekcję larw w stadium wędrującej trzeciej oraz larw gwieździstych, aby odsłonić ścianę ciała. Protokół ten został zmodyfikowany na potrzeby eksperymentów elektrofizjologicznych poprzez zastosowanie krótkich szpilek sekcyjnych.
Mają one około dwóch do czterech milimetrów długości i rzadziej uderzają w obiektyw mikroskopu lub elektrody podczas eksperymentu. Po odsłonięciu ściany ciała, należy za pomocą pęsety uchwycić OUN i lekko go unieść. Następnie należy przeciąć aksony ruchowe nerwów obwodowych i usunąć mózg.
Po wyjęciu mózgu należy dwukrotnie przemyć preparat buforem HL 3.1 z 1 mM wapnia. Po zakończeniu sekcji można przystąpić do rejestracji wewnątrzkomórkowej z komórek mięśniowych larwy. Płytkę do sekcji należy umieścić pod mikroskopem do elektrofizjologii i zanurzyć preparat w buforze HL 3.1 z dodatkiem wapnia.
Następnie przymocuj elektrodę kąpielową tak, aby stykała się z roztworem. Elektroda ssąca służy do stymulacji nerwów obwodowych unerwiających mięsień. Najpierw umieść elektrodę ssącą w naczyniu, aby uniknąć wibracji podczas umieszczania elektrody wewnątrzkomórkowej w mięśniu.
Po umieszczeniu elektrody w szalce, ustaw ją blisko motoneuronu unerwiającego mięsień szósty. W trzecim segmencie brzusznym zastosuj delikatne ssanie, aż przecięty nerw znajdzie się wewnątrz szklanej pipety. Należy uważać, aby nie rozciągać nerwów podczas stosowania ssania.
Lekko unieś pipetę, aby nie dotykała ona mięśnia. Następnie ustaw ją tak, aby nie naprężać przeciętych włókien nerwowych. Po umieszczeniu elektrody ssącej, ustaw elektrodę rejestrującą do rejestracji wewnątrzkomórkowej.
Należy użyć ostrej mikroelektrody wypełnionej trzymolowym roztworem chlorku potasu. Elektrodę rejestrującą należy umieścić nad środkiem mięśnia szóstego. Należy dostosować offset wejściowy tak, aby wskazywał zero dla roztworu kąpieli.
Powoli opuszczaj elektrodę i zbliżaj ją do mięśnia przy dużym powiększeniu optycznym, aż dotknie ona powierzchni mięśnia. Aby potwierdzić penetrację mięśnia, obserwuj oscyloskop. Potencjał spoczynkowy błony powinien wynosić co najmniej -60 mV.
Powinny być teraz widoczne sporadyczne potencjały płytki miniaturowej. Po umieszczeniu elektrody rejestrującej należy odczekać jedną minutę, aż komórki się ustabilizują. Przed rozpoczęciem pomiarów należy użyć Axon HS-2, głowicy wzmacniacza AxoClamp 2B, aby wykryć zmiany potencjału błonowego.
Klem clamp two B jest połączony z komputerem, na którym uruchomione jest oprogramowanie P clamp poprzez konwerter cyfrowy data. 1322 A, który cyfryzuje sygnał. Rejestruj potencjał błonowy na komputerze PC. Za pomocą oprogramowania clamp X podawaj bodźce do aksonu ruchowego, aby wywołać pobudzające potencjały błonowe lub EPSP.
Po wygenerowaniu potencjałów złączeniowych pobudzających (ejs), rejestruj miniaturowe potencjały złączeniowe przez trzy minuty bez synchronizacji bodźców. Do analizy śladów oraz wyznaczenia amplitudy i częstotliwości miniaturowych potencjałów złączeniowych płytki końcowej (mini EJP) można użyć oprogramowania Soft mini analysis. Aby wygenerować ejs.
Użyj ośmiokanałowego generatora impulsów do stymulacji odciętego końca neuronu ruchowego. Generator powinien dostarczać prostokątne impulsy napięciowe o czasie trwania 0,3 ms. Zachowaj pięciosekundowy odstęp między stymulacjami, aby umożliwić regenerację synaptyczną.
W obrębie NMJ zarejestruj co najmniej 10 potencjałów wywołanych z każdego mięśnia i oblicz średnią ich amplitud. Ten rysunek przedstawia typowy zapis z szóstego mięśnia larwy sal typu dzikiego z wywołanymi odpowiedziami EJP oraz spontanicznymi mini EJP. Właśnie pokazaliśmy, jak rejestrować potencjały z połączenia nerwowo-mięśniowego larwy drosophila. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o ukończeniu sekcji w ciągu od 3 do 10 minut i natychmiastowym rozpoczęciu pomiarów elektrofizjologicznych, dopóki komórki są jeszcze zdrowe i reaktywne.
Jeśli sekcja potrwa zbyt długo, potencjał spoczynkowy błony komórek mięśniowych spadnie poniżej −60 milliwoltów, co będzie wartością zbyt niską do rejestracji. To wszystko na dziś. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje metody elektrofizjologiczne służące do pomiaru przekaźnictwa synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larw Drosophila. Proces ten obejmuje wypreparowanie larw w celu odsłonięcia ściany ciała i układu nerwowego, a następnie umieszczenie elektrod rejestrujących i stymulujących w celu pomiaru pobudzających potencjałów złącza.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Elektrofizjologia
- Neuronauka
- Przekaźnictwo synaptyczne
Wstęp
- Zrozumienie przekazywania synaptycznego jest kluczowe dla poznania mechanizmów komunikacji neuronalnej.
- Larwy Drosophila służą jako organizm modelowy do badania NMJ.
- Techniki elektrofizjologiczne umożliwiają precyzyjny pomiar aktywności synaptycznej.
- Wyzwalane uwalnianie w NMJ może być sztucznie stymulowane w celu przeprowadzenia analizy.
Cel badania
- W celu zaprezentowania metod rejestracji przekazywania synaptycznego w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ).
- W celu przedstawienia protokołu dla badaczy zainteresowanych badaniami elektrofizjologicznymi.
- W celu pogłębienia zrozumienia mechanizmów sygnalizacji nerwowo-mięśniowej.
Zastosowane metody
- Disekcja larw Drosophila w celu odsłonięcia mięśni i układu nerwowego.
- Umieszczenie elektrod rejestrujących na wybranym mięśniu.
- Użycie elektrod stymulujących w pobliżu neuronów ruchowych.
- Rejestracja pobudzeniowych potencjałów złączeniowych po stymulacji.
Główne wyniki
- Pomyślny pomiar transmisji synaptycznej w NMJ.
- Wykazanie wywołanych pobudzających potencjałów złącza.
- Walidacja podejścia elektrofizjologicznego w badaniu NMJ.
- Wgląd w dynamikę sygnalizacji synaptycznej u Drosophila.
Wnioski
- Opisane metody stanowią wiarygodne podejście do badania przekaźnictwa w NMJ.
- Rejestracje elektrofizjologiczne mogą ujawnić istotne aspekty funkcji synaptycznej.
- Niniejsze badanie przyczynia się do szerszego zrozumienia oddziaływań nerwowo-mięśniowych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Rejestracja elektrofizjologiczna w złączu nerwowo-mięśniowym (NMJ) larwy Drosophila stanowi genetycznie podatną, ilościową platformę do badania funkcji synaptycznej i neurotransmisji. Model ten umożliwia wysoką pewność walidacji celów oraz mitygację ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania, wspierając prognostyczną ocenę modulacji synaptycznej i perturbacji genetycznych. Podejście to jest bezpośrednio istotne dla zespołów portfelowych poszukujących solidnych, powtarzalnych systemów do odkrywania leków napędzanego neurobiologią.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia bezpośredni pomiar przewodnictwa synaptycznego i zawartości kwantowej w celu funkcjonalnej walidacji celu.
- Wspiera ograniczanie ryzyka mechanistycznego poprzez izolowanie efektów genetycznych lub farmakologicznych w transmisji neurotransmisyjnej.
- Ułatwia badanie szlaków synaptycznych w oparciu o hipotezy w zdefiniowanym, manipulowalnym systemie.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Zapewnia ustandaryzowany, powtarzalny test do ilościowego oznaczania pobudzeniowych potencjałów złączeniowych (EJPs) oraz miniaturowych potencjałów złączeniowych (mEJPs).
- Dostarcza wyników ilościowych odpowiednich do analizy porównawczej pomiędzy różnymi tłem genetycznymi lub wariantami traktowania związkami chemicznymi.
- Umożliwia przygotowanie zwalidowanych systemów biologicznych do dalszych procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami synaptycznymi istotnymi dla przebiegu choroby, co zapewnia ciągłość translacyjną w programach neurobiologicznych.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez dostarczanie danych prognostycznych dotyczących funkcji i modulacji synaptycznej.
- Stanowi pomost między odkryciami genetycznymi a walidacją przedkliniczną w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych i synaptycznych.
Integracja potoków i procesów roboczych
Ta metoda elektrofizjologiczna wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od wczesnej walidacji celu, poprzez opracowanie testów, aż po badania przedkliniczne, umożliwiając iteracyjne testowanie hipotez i ocenę mechanizmów działania.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez zerowych i wyjaśnianie szlaków sygnałowych poprzez ilościowe określanie odpowiedzi synaptycznych na zdefiniowane manipulacje.
- Przesiewanie: Dostarcza powtarzalnych, ilościowych odczytów amplitudy i częstotliwości EJP, co umożliwia stabilny rozwój testów.
- Analityka: Zapewnia zdigitalizowane, statystycznie analizowalne dane do porównań między różnymi warunkami i genotypami.
- Badania translacyjne: Ułatwia dostosowanie do istotnych w kontekście chorób punktów końcowych synaptycznych dla zapewnienia ciągłości badań przedklinicznych.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy wielokrotnego użytku, genetycznie elastyczną platformę do bieżących badań nad neurobiologią i funkcjami synaptycznymi.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów synaptycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzuje przepływy pracy elektrofizjologicznej w celu zapewnienia powtarzalności i skalowalności w różnych zespołach.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie świadomych decyzji go/no-go oraz efektywną pod względem kapitałowym selekcję projektów w portfolio w oparciu o ilościowe dane synaptyczne.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów ukierunkowanych na neurobiologię.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga wiedzy z zakresu elektrofizjologii i genetyki Drosophila w celu optymalnego przeprowadzenia procedury.
- Wymaga specjalistycznej aparatury, w tym mikroelektrod, wzmacniaczy i sprzętu do digitalizacji danych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów preparatyki i rejestracji pomiędzy zespołami w celu zapewnienia powtarzalności.
- Można dostosować do różnych tła genetycznych i manipulacji eksperymentalnych w systemie Drosophila.
- Ograniczona do kontekstu organizmu modelowego; ekstrapolacja translacyjna wymaga starnej walidacji.
