Pomiar długości życia Caenorhabditis elegans na podłożach stałych

W celu pomiaru długości życia C. elegans generowana jest populacja zsynchronizowana pod względem wieku przy użyciu kontrolowanego czasowo znoszenia blokady jaj. Aktywne dorosłe nicienie hermafrodyty są przenoszone na płytki z podłożem wzrostowym dla nicieni (NGM) wysianym E. coli zabitymi promieniami UV, gdzie pozostawia się je na sześć do ośmiu godzin w celu zniesienia jaj, a następnie usuwa. W ciągu kolejnych dwóch dni nicienie wykluwają się z tych jaj i rozwijają do czwartego stadium larwalnego (L4). Nicienie w stadium L4 są przenoszone na nowe płytki NGM zawierające ampicylinę, aby zapobiec kontaminacji żywymi bakteriami, oraz FUDR w celu zahamowania reprodukcji, po czym pozostawia się je do osiągnięcia stadium dorosłego.

Od tego momentu dorosłe nicienie są obserwowane co dwa do trzech dni, aż wszystkie z nich zginą. W każdym punkcie czasowym martwe nicienie są usuwane z płytki, a liczba osobników żywych i martwych jest rejestrowana. Jestem George Seton z laboratorium Matta Capline'a w Katedrze Patologii na Uniwersytecie Waszyngtońskim.

Dzisiaj pokażemy Państwu, jak mierzyć długość życia i obserwować nasze *C. elegans*. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania genetyki starzenia się. Zapraszamy do rozpoczęcia.

Podstawowy eksperyment dotyczący długości życia wymaga dwóch rodzajów płytek: standardowych płytek NGM, które nie zawierają żadnych dodatków, oraz płytek AMP FUDR, do których podłoża NGM dodano ampicylinę i fluorodeoksyurydynę. Oba rodzaje płytek są zaszczepione bakteriami e coli OP 50, które następnie są zabijane poprzez ekspozycję na promieniowanie UV. Rozpocznij od przygotowania 10 mililitrów roztworu NGM.

Na każdą szalkę Petriego o średnicy 60 milimetrów należy całkowicie roztopić stałe podłoże NGM, podgrzewając je w mikrofalówce na wysokiej mocy w 32-sekundowych cyklach. Między cyklami należy delikatnie mieszać medium, aby zapobiec gromadzeniu się pęcherzyków gazu pod ciśnieniem; następnie umieścić ciekłe NGM w kąpieli wodnej o temperaturze 55 °C lub pozostawić na blacie laboratoryjnym do ostygnięcia. Gdy medium ostygnie do 55 °C – w momencie, gdy można już swobodnie trzymać szklany pojemnik gołymi rękami – jest ono gotowe do dodania leków.

Aby przygotować płytki z lekami, należy dodać 33 µL 150 mM FUDR oraz 100 µL 100 mg/ml ampicyliny na 100 ml NGM i zamieszać w celu wymieszania. Ampicylina jest stosowana w celu zapobiegania kontaminacji obcymi bakteriami, a FUDR w celu zapobiegania wykluciu się jaj. Dzięki temu nie będzie konieczności przenoszenia nicieni co kilka dni w celu odseparowania ich od rosnących larw.

Następnie wlej pożywkę i pozostaw płytki do wyschnięcia na blacie na dwa dni. W dniu poprzedzającym zakończenie schnięcia płytek, zaszczep płynną kulturę LB pojedynczą kolonią świeżego posiewu bakterii e coli OP 50 na agarze LB. Przygotuj co najmniej 0,5 ml kultury na każdą płytkę o średnicy 60 mm.

Umieść kulturę OP 50 w inkubatorze z wytrząsaniem w temperaturze 37 °C i pozostaw bakterie do wzrostu przez noc. Następnego dnia odwirowuj bakterie OP 50 z siłą odśrodkową 3 500 g przez 10 minut. Odlej odpowiednią ilość supernatantu, aby resuspenderć bakterie do stężenia 10 x.

Następnie zaszczep każdą płytkę 100 µL skoncentrowanej hodowli. Należy unikać dotykania końcówką pipety powierzchni NGM, ponieważ uszkodzenia powierzchni podłoża umożliwią nicieniom wgryzanie się; obracaj płytki, aż bakterie pokryją centralny obszar NGM, nie zbliżając się do ścianek płytki, a następnie pozostaw płytki do wyschnięcia na blacie na 24 godziny. Po wyschnięciu poddaj powierzchnię płytek dawce UV wystarczająco silnej, aby zatrzymać wzrost bakterii; używamy urządzenia strata gene UV straddle linker 2, 400.

Rozpocznij od umieszczenia płytek w łączniku typu straddle bez nakrywek. Następnie naciśnij przycisk energy. Wpisz 9 9 9 9 na klawiaturze i naciśnij start.

Płytki będą naświetlane promieniami UV przez około pięć minut. Płytki z bakteriami zabitymi promieniami UV można przechowywać dnem do góry w temperaturze 4°C przez maksymalnie miesiąc. W tej sekcji opisano, jak uzyskać populację nicieni o wspólnej dacie wyklucia.

Zacznij od przeniesienia około 20 młodych dorosłych nicieni na nową płytkę NGM bez leków. Pozostaw płytkę w temperaturze 25 stopni Celsjusza przez około tydzień, aby nicienie mogły się rozmnożyć i w ciągu tego tygodnia skonsumować całe bakterie stanowiące pożywkę. Po pojawieniu się nowo wyklutych nicieni w stadium dower (zatrzymanie wzrostu), należy przenieść od 20 do 30 larw w stadium dower na nową płytkę NGM bez leków i inkubować je w temperaturze 25 stopni Celsjusza w obecności pożywki.

Larwy dower staną się reprodukcyjnie aktywnymi osobnikami dorosłymi w ciągu dwóch dni i pozostaną aktywne przez kilka kolejnych dni. Teraz przenieś od 10 do 15 reprodukcyjnie aktywnych osobników dorosłych na świeżą płytkę NGM bez leków. Płytkę tę określa się jako płytkę do czasowego składania jaj (timed egg laying, TEL).

Pozostaw płytkę TEL w temperaturze 25 °C, aby nicienie mogły złożyć jaja. Zwierzęta, które wyklują się z tych jaj, będą zwierzętami doświadczalnymi, a ich długość życia zostanie oceniona po sześciu godzinach. Sprawdź płytkę TEL pod kątem obecności jaj.

Jeśli liczba jaj jest wciąż niewystarczająca, pozostaw płytkę TEL w temperaturze 25°C łącznie do 24 godzin, okresowo sprawdzając obecność jaj. Po zniesieniu odpowiedniej liczby jaj usuń osobniki dorosłe z płytki TEL.

Typowy eksperyment dotyczący długości życia wymaga od 30 do 90 jaj na grupę eksperymentalną, jednak na jednej płytce TEL można uzyskać kilkaset jaj. Około 150 jaj zostanie złożonych przez 10 do 15 osobników dorosłych w stanie aktywności rozrodczej w ciągu sześciu do ośmiu godzin. Przy porównywaniu grup eksperymentalnych istotność statystyczną dla dużych różnic w długości życia można osiągnąć przy użyciu zaledwie 30 zwierząt.

Należy użyć większej liczby zwierząt, aby móc rozróżnić mniejsze różnice. Teraz należy umieścić płytkę TEL bez dorosłych osobników w temperaturze 20 °C, aż jaja wyklują się, a nicienie rozwiną do czwartego stadium larwalnego (L4). W przypadku typu dzikiego C elegance zazwyczaj zajmuje to dwa dni, jednak w szczepach o fenotypie powolnego rozwoju proces ten może trwać dłużej.

W tej sekcji opisano sposób monitorowania cyklu życiowego populacji zsynchronizowanej pod względem wieku. Najpierw przenieś larwy w stadium L4 z płytki TEL na przygotowane płytki AMP FUDR. W przypadku każdego testowanego szczepu lub warunku zazwyczaj przygotowuje się od dwóch do trzech płytek, zawierających od 25 do 30 nicieni na płytkę.

Inkubować płytki AMP FUDR w temperaturze 20 °C przez 24 godziny. Następnie dokonać wizualnej oceny nicieni, pożywki oraz bakterii, a następnie przenieść nicienie na świeże płytki AMP FUDR. Jeśli nicienie zjadły większość pokarmu bakteryjnego, czynność tę należy zazwyczaj powtarzać raz lub dwa razy w tygodniu.

Na wczesnym etapie eksperymentu obecność znacznej liczby larw zazwyczaj wskazuje na to, że nicienie zostały przeniesione na płytki AMP FUDR w stadium młodych dorosłych zamiast w stadium L4. Młode dorosłe osobniki mogą składać jaja, zanim FUDR zacznie działać, a sporadycznie zdarza się, że larwy unikną działania FUDR i wyrosną na dorosłe osobniki. W takiej sytuacji larwy te będą zakłócać przebieg eksperymentu; należy wówczas przenieść dorosłe nicienie na świeże płytki, a stare płytki zawierające larwy wyrzucić.

Robaki należy również przenieść na świeże szalki w przypadku zaobserwowania wzrostu żywych bakterii. Zazwyczaj połączenie działania AMP i naświetlania UV zapewnia brak kontaminacji eksperymentu żywymi bakteriami, jednak sporadycznie może do niej dojść. W takim przypadku należy przenieść robaki.

W przypadku zaobserwowania wzrostu grzybni na pożywce, jeśli zostanie ona wykryta odpowiednio wcześnie, grzyba można usunąć za pomocą końcówki pipety lub szpatułki. Gdy wzrost grzybni przekroczy kilka milimetrów średnicy, zazwyczaj łatwiej jest przenieść nicienie na nową płytkę.

Oceniaj długość życia wszystkich nicieni co dwa do trzech dni. Używając stereomikroskopu, określ, czy każdy nicień jest żywy, czy martwy.

Delikatnie stuknij w płytkę. Nicień jest żywy, jeśli porusza się w odpowiedzi na stuknięcie. Jeśli nicień nie reaguje na stuknięcie w płytkę, powiększ obszar głowy i delikatnie dotknij głowy nicienia platynową pęsetą transferową.

Oznacz nicienia jako martwego. Jeśli nie reaguje on ruchem głowy, usuń martwego nicienia z płytki. Po sprawdzeniu wszystkich nicieni zapisz datę oraz liczbę osobników żywych i martwych.

Robaki hodowane na podłożach stałych mogą sporadycznie opuszczać powierzchnię płytki poprzez drążenie tuneli lub wspinanie się po ściankach. Robaki, które uciekną, zostają całkowicie wykluczone z badania. Po zakończeniu prac należy zwrócić płytki do inkubatora ustawionego na 20 °C.

Odczekaj kolejne dwa do trzech dni, a następnie ponownie sprawdź płytki. Kontynuuj ten schemat aż do śmierci wszystkich nicieni. Liczbę nicieni ginących każdego dnia zazwyczaj odwraca się, aby obliczyć proporcję osobników żyjących w każdym dniu; dane te nanosi się na wykres w postaci krzywej przeżywalności, uwzględniając dzień zsynchronizowanego składania jaj.

Dzień zero. Typowa mediana długości życia dla N dwa. Dziki szczep C. elegans hodowany na podłożu UV kill bacteria w temperaturze 20 °C wynosi około 25 dni, licząc od stadium jaja.

Właśnie pokazaliśmy, jak mierzyć długość życia i obserwować elegancję. Tę podstawową procedurę można zmodyfikować, aby przetestować różnorodne warunki środowiskowe, w tym restrykcje dietetyczne oraz interferencję RNA, co zostało omówione w tekście uzupełniającym. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentu.