Iniekcja do komór mózgowych danio pręgowanego

Procedura ta rozpoczyna się od wyznaczenia stadium rozwoju embrionów rybek danio. Po osiągnięciu przez embriony interesującego nas stadium należy je usunąć z chorionu. Następnie za pomocą końcówki pipety w naczyniu pokrytym aros tworzy się otwory do montażu embrionów, a następnie delikatnie umieszcza się w nich embriony ogonami w dół.

Po zamocowaniu embrionów, do przestrzeni komorowej embrionu wstrzykuje się ostrożnie barwnik fluorescencyjny poprzez tylny mózg. Po wstrzyknięciu do komory embriony są obrazowane, a dane przetwarzane przy użyciu programu Photoshop. Cześć, jestem Jennifer Gutman z laboratorium dr Hazel Sieve w Whitehead Institute for Biomedical Research w MIT w Cambridge, Massachusetts.

Dzisiaj przedstawimy procedurę iniekcji do komór mózgu rybki danio. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu badania formowania się komór mózgu oraz morfogenezy neuroepithelialnej u żywych osobników zebrafish. Ze względu na przezroczystość embrionów rybki danio, charakteryzacja kształtu komór mózgu może być trudna.

Technika ta jest użytecznym i prostym sposobem na odróżnienie przestrzeni wypełnionej płynem od otaczających tkanek oraz na charakterystykę embrionów mutantów, które mogą wykazywać defekty w tworzeniu komór mózgu. Zatem zacznijmy. Aby przygotować się do wstrzykiwania do komory mózgu danio pręgowanego, rozpoczynamy od wykonania igieł do iniekcji.

Do wyciągania igieł kapilarnych wykorzystuje się wyciągarkę do kapilar Sutter. Następnie igłę kapilarną wypełnia się barwnikiem fluorescencyjnym, takim jak Texas red dextrin. W kolejnym kroku wypełnioną igłę montuje się w mikromanipulatorze w aparaturze do mikroiniekcji.

Odetnij igłę pod kątem do odpowiedniej wielkości. Aby stworzyć ścięty czubek, zmierz wielkość kropli z igły i sprawdź, czy wynosi ona od 1 do 2 nanolitrów na wtrysk w oleju. Aby rozpocząć ten etap procedury, zarodki, zgodnie z klasyfikacją Kimmela, powinny zostać wstrzyknięte na 30 minut przed stadium, które jest przedmiotem zainteresowania.

Na przykład, aby badać komory mózgu w 24. godzinie po zapłodnieniu, należy wstrzyknąć preparaty do embrionów w 23,5 godzinie po zapłodnieniu. Embrion w interesującym nas stadium umieszcza się pod stereomikroskopem, a chorion ostrożnie usuwa z embrionu za pomocą pęsety. Następnie przygotowuje się naczynie z agarozą dla embrionów, używając plastikowego naczynia pokrytego 1% agarozy; w agarozie wykonuje się otwory za pomocą plastikowego końcówki pipety o pojemności 1 do 200 µL.

Ostrożnie usuń korki aros z otworów za pomocą pęsety. Przenieś embrion i pożywkę dla embrionów do szalki aros z otworami. Do pożywki dodaj trica, aby znieczulić embrion i zapobiec jego poruszaniu się.

W trakcie eksperymentu ostrożnie umieść zarodek w otworze ogonem do dołu i zorientuj go tak, aby aparat do iniekcji znajdował się po stronie tylnej zarodka. Po prawidłowym umieszczeniu i zorientowaniu zarodka w naczyniu agarowym można przystąpić do iniekcji do komór mózgowych. Najpierw ustaw zestaw do mikromanipulacji w taki sposób, aby końcówka igły znajdowała się w tym samym polu widzenia co zarodek przy dużym powiększeniu.

Ostrożnie wprowadź igłę przez cienką płytkę dachową tylnego mózgowia, tuż za punktem zawiasowym R0-R1, uważając, aby nie uszkodzić tkanki mózgowej znajdującej się poniżej, a następnie wstrzyknij taką ilość barwnika, aby całkowicie wypełnić komory. W zależności od stadium rozwoju zarodka wypełnienie przestrzeni komorowej może wymagać kilku wstrzyknięć. Po wstrzyknięciu barwnika i przygotowaniu zarodka do obrazowania należy przygotować nową szalkę Agarose dla zarodka.

Używając czystej szalki powlekanej 1%aros, wykonaj w niej otwory i usuń wypychaczki. Przenieś zarodek do szalki i dodaj trica, aby znieczulić zarodek i zapobiec jego ruchom. Umieść ogon zarodka z wstrzykniętym do komory roztworem w otworze w pozycji umożliwiającej wykonanie obrazu grzbietowego.

Zarodek jest teraz gotowy do obrazowania. Wykonaj zdjęcie w świetle przechodzącym. Bardzo ważne jest, aby nie poruszać zarodkiem ani mikroskopem.

Następnie zmień ustawienia mikroskopu i wykonaj obraz w świetle fluorescencyjnym. Zmień położenie zarodka, aby wykonać obrazy boczne zarówno w świetle przechodzącym, jak i fluorescencyjnym. Zapisz wszystkie obrazy w plikach przeznaczonych do obróbki w programie Photoshop.

Aby przetworzyć obrazy w programie Photoshop, otwórz obrazy tego samego embrionu wykonane w tej samej pozycji w świetle przechodzącym i fluorescencyjnym. Upewnij się, że wszystkie ustawienia są identyczne. W przypadku każdego obrazu przeciągnij obraz fluorescencyjny na obraz w świetle przechodzącym i precyzyjnie je wyrównaj, mając zaznaczony obraz fluorescencyjny. Wybierz korekcję obrazu, a następnie zastąp kolor i zmień czarne tło na białe.

W oknie zastępowania koloru (replace color) przesuń suwak współczynnika rozmycia (fuzziness) w prawo, aż obraz fluorescencyjny będzie miał jednolity kolor. W oknie warstw (layers) wybierz tryb mnożenia (multiply). Aby wyświetlić obrazy nałożone, obraz przestrzeni komór bocznych powinien dokładnie pokrywać się z obrazem w świetle przechodzącym.

Zapisz ten plik i powtórz czynność dla pozostałych obrazów. Jeśli iniekcja do komory została wykonana prawidłowo, obrazy powinny mieć ostre krawędzie w obszarach bez rozproszonego barwnika, co pokazano tutaj na obrazach z 25 godzin po zapłodnieniu. Panel A przedstawia obraz w świetle przechodzącym, panel B obraz fluorescencyjny, a panel C obraz nałożony.

Widok boczny obrazu nałożonego przedstawiono na panelu D. Z drugiej strony, jeśli podczas wstrzykiwania do komory igła zostanie wprowadzona zbyt głęboko, wejdzie ona w tkankę mózgową poniżej przestrzeni komorowej, co doprowadzi do błędnego wstrzyknięcia. Skutkuje to widocznością barwnika poza przestrzenią komorową oraz w żółtku, jak pokazano tutaj. Panel E przedstawia obraz w jasnym polu.

Panel F przedstawia obraz fluorescencyjny, a panel G przedstawia obraz nałożony. Widok boczny obrazu nałożonego pokazano na panelu H. Strzałki wskazują obszary, w których barwnik przedostał się poza przestrzeń komór mózgu. W tym filmie zademonstrowaliśmy, jak wstrzyknąć barwnik fluorescencyjny do rozwijających się komór mózgu rybek zebrafish.

Metoda ta jest wykorzystywana do wizualizacji przestrzeni komór mózgu w kontraście do otaczającego je neuroepitelium i jest niezwykle użyteczna przy określaniu kształtu przestrzeni komorowej, jak również kształtu otaczającej tkanki mózgowej. Technika ta pozwala lepiej zrozumieć proces formowania się komór mózgu oraz morfogenezę mózgu w czasie w żywym embrionie. Stanowi doskonałe narzędzie do badania wad formowania się komór mózgu oraz do wstępnej charakterystyki mutantów morfogenezy mózgu.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.