Wykrywanie ogniskowych przejściowych zmian stężenia Ca²⁺ w mięśniach gładkich

W pierwszej kolejności przygotowuje się roztwór do ładowania wapniem, który następnie podgrzewa się i napowietrza. Pęcherz moczowy zostaje wypreparowany, otwarty i rozpięty na płasko, a następnie wycina się pasek mięśnia detrusora. Pasek mięśnia detrusora przenosi się do roztworu do ładowania, inkubuje, płucze i rozpina na płasko.

Poziom podstawowy wapnia w tkance jest wzbudzany światłem laserowym, a emitowane światło jest rejestrowane. Filmy składające się z pojedynczych klatek są analizowane poprzez porównywanie kolejnych klatek. Tło zostaje odjęte.

Próg krawędzi komórki określa obszar, w którym mogą być wykrywane zdarzenia, a następnie obliczany jest stosunek między kolejnymi próbkami mózgu. Jeśli pozostałe zdarzenia spełniają zdefiniowane kryteria, zostają one wyróżnione i oznakowane. Dzień dobry, nazywam się John Young i reprezentuję laboratoria Keitha Braina oraz Toma Kinane z Katedry Farmakologii Uniwersytetu w Oxfordzie.

Jestem Rob Amos, również z laboratoriów Braina i Canne, a ja nazywam się Keith Brain. Dzisiaj John i Rob zaprezentują Państwu technikę obrazowania wapnia w mięśniach gładkich. Stosujemy ją w naszym laboratorium do badania uwalniania neuroprzekaźników z nerwów autonomicznych oraz ich wpływu na mięśnie gładkie.

Zacznijmy zatem. Wskaźnik wapnia organ green 488 BAFTA 1 AM dostarczany jest w fiolkach o pojemności 500 µL zawierających 50 µg proszku. Aby przygotować wskaźnik wapnia, należy dodać 40 µL roztworu Onic F1 27 do proszku i delikatnie wstrząsać przez 30 s, a następnie dodać 460 µL fizjologicznego roztworu soli PSS i ponownie delikatnie wstrząsać przez kolejne 30 s.

Końcowy roztwór organ green 4 88 BAFTA o stężeniu 10 µM dostarcza cztery alikwoty po 125 µL każda. Należy unikać ekspozycji na światło i przechowywać roztwór w temperaturze -20 °C przed przeprowadzeniem sekcji wybranego tkanek.

Wyjmij wskaźnik wapnia z zamrażarki i rozmroź w temperaturze pokojowej, dopóki wskaźnik wapnia nie stanie się płynny. Umieść 1 mL PSS w probówce i w kąpieli wodnej o temperaturze 33 °C. Zamocuj napowietrzacz w probówce za pomocą korka lub można użyć rurki Perflex, a następnie napowietrzaj mieszaniną 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla z prędkością około jednego pęcherzyka na sekundę.

Wypreparuj organ z mięśni gładkich z organizmu zwierzęcia. W tym przypadku jest to pęcherz moczowy myszy. Umieść organ w około 50 mililitrach PSS w celu jego przemycia; po dokładnym przemyciu tkanki ostrożnie usuń tkankę tłuszczową oraz tkankę łączną.

Przeprowadź sekcję zgodnie z typem laurean dla mięśni gładkich pęcherza moczowego. Otwórz pęcherz wzdłużnie od szyjki pęcherza, przez koniec dystalny, aż do szczytu kopuły. W części kranialnej przygotuj cztery paski o długości 6–8 mm i szerokości 1–2 mm wzdłuż powierzchni grzbietowej, tnąc w kierunku dominujących pęczków mięśniowych.

Umieść wypreparowaną tkankę oraz wstępnie ogrzany i napowietrzany PSS do załadowania wskaźnika wapnia, dodając do tkanki w probówce 125 µL 10 µM organ green 488B, a następnie delikatnie wstrząśnij probówką ręcznie, aby wymieszać składniki. Włóż probówkę z powrotem do łaźni wodnej. Wznów napowietrzanie i przykryj łaźnię wodną arkuszem folii.

Czas potrzebny na wchłonięcie wskaźnika wapnia przez wystarczającą ilość tkanki różni się w zależności od wielkości tkanki oraz grubości warstwy mięśni gładkich. Na przykład w przypadku mięśnia detrusora myszy oraz oxs szczura czas ten wynosi 70 minut. Natomiast w przypadku mięśnia detrusora szczura i deens VAs myszy inkubację prowadzimy przez 120 minut.

Po załadowaniu tkanki wskaźnikiem wapnia można ją przygotować do badania mikroskopowego. Najpierw płucz tkankę w napowietrzonym roztworze PSS przez 10 minut. Następnie umieść tkankę w naczyniu preparacyjnym wyłożonym osłoną S guard.

Lekko rozciągnąć tkankę, aby utworzyła płaską warstwę. Przymocować tkankę za pomocą krótkich odcinków, na przykład dwumilimetrowych srebrnych drutów o średnicy od 25 do 50 µm, wbijając piny pod kątem.

Należy unikać używania szpilek o długości przekraczającej kilka milimetrów, ponieważ mogą one porysować obiektyw. Staranne przypięcie tkanki jest istotne w celu zminimalizowania jej samoistnego kurczenia się oraz ułatwienia zlokalizowania odpowiedniego miejsca do obrazowania. Po przypięciu tkanki należy umieścić naczynie z preparatem na stoliku mikroskopu.

Należy uważać, aby PSS nie wypłynął poza obszar szalki wyłożony osłoną silikonową, ponieważ może to doprowadzić do pokrycia PSS dużego obszaru. W celach demonstracyjnych, po rozpoczęciu superfuzji, następujące kroki zostaną wykonane w świetle.

Należy pamiętać, że doświadczenia te są zazwyczaj przeprowadzane w ciemności. Włącz pompę, aby przeprowadzić superfuzję preparatu. W przypadku PSS często stosuje się szybkość 100 milliliters per hour.

Włącz urządzenie grzewcze, a następnie umieść rurki dopływowe i odpływowe oraz sondę temperatury na naczyniu preparacyjnym, mocując każdą z nich do metalowego paska za pomocą magnesu znajdującego się u podstawy. Wysokość końcówki rurki odpływowej będzie determinować głębokość PSS. Należy zachować ostrożność i upewnić się, że odpływ rzeczywiście usuwa PSS, ponieważ czasami tak się nie dzieje.

Wstępnie ustaw temperaturę na urządzeniu grzewczym tak, aby osiągnęła pożądaną wartość między 33 a 35 °C. Pozostaw tkankę do wyrównania temperatury przez co najmniej 10 minut, używając obiektywu o małej powiększeniu: 10x lub 20x.

Należy użyć fluorescencji epifluorescencyjnej lub wzbudzenia światłem niebieskim, aby uwidocznić mięśnie gładkie i zidentyfikować odpowiedni obszar do monitorowania. Ponieważ ekspozycja na światło wzbudzające prowadzi do fotoblaknięcia wskaźnika, należy unikać jego stosowania przez więcej niż kilka sekund jednorazowo.

Należy unikać obszarów z jasnymi strukturami, ponieważ mogą one powodować dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich w algorytmie detekcji obrazu. Należy starać się wybrać miejsce z minimalną ruchliwością i dużą liczbą komórek mięśni gładkich w polu widzenia. Po wybraniu obszaru do obrazowania należy przełączyć na obiektyw o większym powiększeniu, np. 40 x.

Obróć stolik lub oś optyczną tak, aby komórka lub komórki mięśni gładkich znajdowały się w pozycji poziomej, czyli równolegle do osi szybkiego skanowania. Komórki mięśni gładkich są teraz gotowe do obrazowania za pomocą mikroskopii konfokalnej.

W niniejszym protokole używamy odwróconego mikroskopu konfokalnego Leica SP dwa. Przymknij otwór pinhole do rozmiaru jednej plamki Airy'ego. Ustaw moc lasera w zakresie od 25 do 35% na regulowanym filtrze custo optic.

Wartość ta stanowi kompromis pomiędzy jasnością a fotowybielaniem. Aby przygotować się do analizy danych, należy pobrać i zainstalować program ImageJ. Pobierz wersję odpowiednią dla danego systemu operacyjnego, a następnie zaktualizuj ją do najnowszej wersji, pobierając aktualny plik jar ImageJ i zastępując nim stary plik. Następnie pobierz plik jar programu Excel writer i zainstaluj go w katalogu plugins jar.

Skopiuj te pliki do katalogu wtyczek. Zainstaluj każdy z tych skryptów za pomocą makr wtyczek. Zainstaluj funkcję programu ImageJ. Oprogramowanie do mikroskopu konfokalnego Leica SP2, z którego korzystamy, nazywa się Leica.

LCS zapisuje poszczególne klatki każdej serii jako osobne pliki. Aby zrekonstruować serię, należy upewnić się, że wszystkie klatki przeznaczone do rekonstrukcji znajdują się w jednym folderze.

Na przykład folder danych tiffs. Następnie z menu plugins macros wybierz makro Leica SP two stacker. Wybierz katalog główny, w tym przypadku folder danych.

Wybierz odpowiedni folder z listy rozwijanej. W tym przypadku wybierz katalog wyjściowy dla plików tiff lub utwórz nowy. Na przykład folder data stacks.

Następnie skrypt zrekonstruuje serie z poszczególnych klatek, aby skorygować przesunięcia wynikające z ruchu. Wykorzystujemy ogólnodostępny algorytm, który wyrównuje lub dopasowuje klatki w obrębie serii z pobranego stosu danych: rig oraz turbo reg. Skopiuj pliki każdego z nich do folderu stacks.

Wczytaj stos obrazów do przetworzenia, a następnie przejdź do klatki, która wyraźnie pokazuje interesujący obszar. Pozostałe klatki zostaną wyrównane do tej klatki referencyjnej. Następnie przejdź do menu wtyczek (plugins), a następnie do sekcji stosów (stacks).

Rejestracja stosu. Należy wypróbować każdą z różnych transformacji, aby określić, która jest najskuteczniejsza dla każdego miejsca. Czynniki obrazowania wpływające na detekcję przejściowych wzrostów poziomu wapnia będą się różnić w zależności od pomiaru określonych właściwości oraz parametrów cząstek w każdym miejscu.

Czułość i swoistość detekcji zostają zwiększone. W związku z tym dla każdego miejsca obliczymy próg dla odjętego progu stosunku oraz próg krawędzi komórki. Aby rozpocząć, przejdź do plugins, macros, install i wybierz jn CTO dot oh eight release dot IJM JM. Następnie przejdź do plugins macros load stack.

Wybierz serię i oblicz następujące parametry cząstek. Aby obliczyć próg dla odejmowania (subtracted), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania (ROI) w miejscu, które Twoim zdaniem stanowi tło pomiarowe. Zapisz średnią. Aby obliczyć próg dla stosunku (ratio), zaznacz prostokątny obszar zainteresowania wokół optycznie płaskiego obszaru komórki lub komórek mięśni gładkich.

Zmierzyć i zapisać średnią oraz odchylenie standardowe. Powtórzyć ten proces jeszcze dwa razy lub narysować trzy ramki jednocześnie, przytrzymując klawisz shift. Obliczyć i zapisać wartość progową dla stosunku.

Oblicz wartość jako odchylenie standardowe podzielone przez średnią plus jeden, a następnie pomnóż wynik przez 32. Przy uśrednianiu wartości z trzech powtórzeń mnożnik 32 jest niezbędny, aby uwzględnić algorytm obliczania stosunku, w którym brak zmian w stosunku do poprzedniej klatki jest mapowany na wartość całkowitą 32. Zapewnia to odpowiedni zakres dynamiczny do wykrywania wzrostów i spadków stosunku.

W przypadku obrazu ośmiobitowego wybierz opcję Image Adjust Threshold. Wybierz tryb Black and White. Zdefiniuj górną granicę suwaka i zapisz odpowiadającą jej wartość.

Znajduje się to po prawej stronie suwaka. Liczone będą tylko zdarzenia występujące w obszarach czarnych. Kliknij resetuj.

Po obliczeniu progów odejmowania dla stosunku oraz progu krawędzi komórek, można przystąpić do analizy stosów obrazów. Należy określić lokalizację stosów przeznaczonych do analizy. Na tym etapie należy wybrać tylko jedną serię.

Jest to pierwszy plik, a ostatni plik powinien być taki sam. Następnie wybierz lokalizację zapisu plików danych i stosów. Na przykład folder wyjściowy danych.

Wprowadź wartości progu odejmowania, progu stosunku oraz progu krawędzi komórki. Pozostałe ustawienia pozostaw w wartościach domyślnych. Algorytm wygeneruje okno z dwoma panelami, w którym po lewej stronie wyświetlana będzie seria przetworzona, a po prawej oryginalna.

Otwórz ten plik z folderu wyjściowego i dokładnie go przeanalizuj, aby ocenić liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz przypadki, w których zdarzenia widoczne gołym okiem nie zostały wykryte. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia, taką jak amplituda, pole i pozycja; wyniki fałszywie dodatnie zidentyfikowane podczas przeglądania plików obrazów wygenerowanych przez algorytm można ręcznie usunąć z tego pliku Excel. Należy jednak stosować w tym celu rygorystyczne kryteria.

Jest to film przedstawiający przejściowe zmiany stężenia wapnia w mięśniach gładkich. W tym przykładzie film składa się ze 100 pojedynczych klatek zarejestrowanych z częstotliwością 5 Hz. Podczas badania, na przykład, wpływu konkretnego leku na częstotliwość przejściowych zmian stężenia wapnia, rejestrowalibyśmy wiele takich filmów w ramach jednego eksperymentu.

Widzimy tutaj liczne spontaniczne przejściowe wzrosty stężenia wapnia w komórkach mięśni gładkich. Przedstawiono tutaj wynik działania algorytmu detekcji cząstek. Dla każdej serii algorytm generuje plik Excel, który szczegółowo opisuje charakterystykę wykrytego zdarzenia, taką jak amplituda, pole powierzchni i pozycja.

Zaprezentowaliśmy metodę obrazowania przejściowych zmian stężenia wapnia w narządach zbudowanych z mięśni gładkich, takich jak pęcherz moczowy, a także sposób analizy tych sygnałów wapniowych przy użyciu algorytmu opracowanego w naszym laboratorium. Kluczowym elementem jest staranne przygotowanie tkanki do obrazowania wapnia. W przypadku tkanki zaprezentowanej dzisiaj polega to na usunięciu tkanki łącznej oraz wszelkich złogów tłuszczu, które mogłyby przesłonić pole widzenia.

Ważne jest również, aby przypiąć tkankę w płaską warstwę. Życzymy powodzenia w eksperymentach i dziękujemy za oglądanie.