Techniki mikroiniekcji do badania mitozy w embrionie syncytialnym Drosophila melanogaster

Procedura rozpoczyna się od zbierania embrionów z płytek z świeżym sokiem z winogron po 30 do 60 minutach. Po wyjęciu płytki z klatki w jeziorze, należy zebrać embriony za pomocą zwilżonego pędzelka i umieścić je na dwustronnej taśmie klejącej. Delikatnie przetoczyć jeden embrion po taśmie, używając jednej strony pęsety, aż do momentu przerwania chorionu.

Pobierz embrion i ostrożnie umieść go na szkiełku nakrywkowym. Nanieś warstwę kleju het. Powtarzaj tę czynność, aż uzyskasz odpowiednią liczbę embrionów.

Po odwodnieniu embriony są gotowe do iniekcji. Dzień dobry, nazywam się Ingrid Bruce Musher i pracuję w laboratorium dr. Jonathana Sculleya w Katedrze Biologii Molekularnej i Komórkowej na Uniwersytecie Kalifornijskim w Davis. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę mikroiniekcji syncytialnych embrionów Drosophila.

Niniejszą procedurę stosujemy do badania roli mikrotubul i motorów opartych na białkach mitralnych w mitozie. Przykładowo, mikroiniekujemy przeciwciała lub inne inhibitory specyficznych białek mitotycznych. Analizując wpływ inhibitora na mitozę, jesteśmy w stanie określić funkcję białek docelowych.

Zacznijmy zatem. Aby przygotować klatkę lęgową na dwa lub trzy dni przed eksperymentem, należy wyciąć dwa małe otwory o powierzchni około 1 cm² po przeciwnych stronach plastikowej butelki. Wypełnij otwory kawałkiem waty, aby umożliwić przepływ powietrza.

Wprowadzić muchy do butelki, a następnie przykryć ją płytką z sokiem winogronowym. W przypadku drożdży przechowywać klatkę z muchami w temperaturze pokojowej; muchy będą składać jaja przez okres do 10 dni, co należy rozpocząć co najmniej jeden dzień przed eksperymentem. Przygotować igły do iniekcji i przechowywać je w temperaturze 4 °C.

W dniu eksperymentu należy przygotować i załadować igły. Najpierw wyjmij oznakowaną tubulinę z zamrażarki i umieść ją w lodzie na od 5 do 15 minut. Następnie rozcieńcz ją buforem GPEM, a potem wiruj przez 10 do 15 minut przy 13 000 RPM w temperaturze 4 °C.

Na koniec nabić od jednego do dwóch mikrolitrów do igły i przechowywać w temperaturze 4 °C, aby zapobiec polimeryzacji indukowanej temperaturą wewnątrz igły. Przed przygotowaniem szkiełka nakrywnego przygotować klej heptanowy, zwijając dwustronną taśmę klejącą i umieszczając ją w butelce o pojemności 100 ml.

Dodaj około 50 mililitrów heptanu, szczelnie zamknij butelkę i przechowuj ją w ruchu obrotowym przez kilka dni. Przed przygotowaniem embrionów przygotuj komorę dehydratacyjną, w której embriony zostaną umieszczone przed iniekcją. Aby to zrobić, umieść jedną część szalki 35 milimetrów wewnątrz szalki Petriego 100 milimetrów, aby stworzyć platformę, a wokół niej dodaj środek osuszający, którym jest bezwodny siarczan wapnia, tak aby wysokość środka osuszającego nie przekraczała wysokości platformy i przykrycia.

Aby rozpocząć przygotowywanie embrionów, należy najpierw zebrać je z klatki jeziornej, wymieniając co godzinę płytkę z sokiem winogronowym i drożdżami; obrazowanie embrionów powinno nastąpić około dwóch godzin po rozpoczęciu zbioru. Aby przygotować szkiełko nakrywkę, należy umieścić ją po jednej stronie preparatu mikroskopowego i przymocować cztery narożniki taśmą, aby zapobiec przesuwaniu się. Za pomocą aplikatora z bawełnianym końcem należy nałożyć jedną warstwę kleju heptanowego w linii na szkiełku nakrywce.

Klej nie powinien być lepki i powinien wysychać w ciągu kilku sekund. Jeśli jest zbyt gęsty, należy dodać więcej heptanu. Na koniec przykleić kawałek dwustronnej taśmy klejącej do szkiełka przedmiotowego obok przykrycia.

Przesunąć pędzlem zwilżonym wodą. Ostrożnie zebrać zarodki z płytki z sokiem z winogron i umieścić je na dwustronnej taśmie klejącej na szkiełku. Następnie, używając jednej części pęsety, toczyć zarodki po dwustronnej taśmie klejącej, aż do przerwania chorionu.

Pobierz zarodek, delikatnie przesuwając go po powierzchni Corianu, aby przywarł do pęsety, a następnie umieść go w kleju heptanowym na szkiełku nakrywkowym. Przesuń zarodek tak, aby jego dłuższa oś była równoległa do dłuższego boku szkiełka nakrywkowego. Umieść od 10 do 20 zarodków w jednym rzędzie.

Zdejmij szkiełko nakrywkę i umieść je w komorze dehydratacyjnej na od trzech do ośmiu minut. Czas ten zależy od lokalnej wilgotności oraz ilości substancji do wstrzyknięcia. Następnie umieść szkiełko nakrywkę w metalowej komorze z zastosowaniem smaru próżniowego.

Na koniec przykryć embriony olejem halokarbonowym, aby zapobiec ich dalszemu odwodnieniu. Embriony są teraz gotowe do iniekcji. W pierwszej kolejności zlokalizować embriony przy użyciu obiektywu 16 x.

Odsuń zarodki i zlokalizuj igłę, nie zmieniając płaszczyzny ogniskowania. Wyśrodkuj igłę i przesuń ją w górę, nie zmieniając jej położenia w kierunku X lub Y. Aby otworzyć igłę, wprowadź krawędź szkiełka nakrywki w pole widzenia, ale poza miejsce, w którym znajdzie się igła.

Następnie obniżyć igłę do tej samej płaszczyzny ogniskowej. Bardzo ostrożnie przesuwać szkiełko nakrywkę, aż uderzy ono w igłę i delikatnie ją przebije. Unieść igłę.

Teraz ustaw zarodki w polu widzenia. Opuść igłę do oleju, upewniając się, że z igły wydobywają się ładne krople cieczy. Powoli przesuń zarodek w stronę igły, wstrzyknij kroplę do zarodka, a następnie odsuń zarodek.

Po wstrzyknięciu wszystkich embrionów są one gotowe do obserwacji pod mikroskopem konfokalnym z obiektywem 60x lub 100x. Embrion kontrolny powinien wyglądać tak jak ten pokazany w filmie. Jest to embrion wykazujący ekspresję GFP tubuliny oraz RFP histony, obrazowany obiektywem 100x przy użyciu konfokalnego mikroskopu z dyskiem obrotowym.

Całkowity czas wynosi osiem minut. Wykresy odległości od bieguna do bieguna są bardzo powtarzalne i stanowią wiarygodną miarę sukcesu w embrionach kontrolnych. Powinny one wyglądać tak jak przedstawione tutaj dla cykli od 11 do 13.

Na tym filmie pokazano inny embrion kontrolny. Ten wykazuje ekspresję KLP 61 FGFP i został wstrzyknięty r Domine tubuliną. Obrazowanie przeprowadzono również z użyciem obiektywu 100 x w konfokalnym mikroskopie z dyskiem obrotowym, a całkowity czas wynosi siedem minut.

Nagranie to zostało wykonane bezpośrednio po mikrowstrzykiwaniu, a gradient stężenia r Domine tubuliny jest wyraźnie widoczny na początku filmu. Zarodki te mogą być wykorzystane do badania inhibicji Klp 61 F po mikrowstrzyknięciu przeciwciał przeciwko Klp 61 F. Widoczny jest zanik Klp 61 FGFP z wrzecion.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić mikroiniekcję zarodków muszki owocówki (*Drosophila*). Podczas wykonywania tej procedury ważne jest pamiętanie o przeprowadzeniu kontroli – najpierw należy poćwiczyć wstrzykiwanie samego buforu lub rutyny oraz upewnić się, że mitoza przebiega normalnie w fazie komórkowej. Gdy wszystkie iniekcje będą powtarzalne i nie będą powodować uszkodzeń, można wstrzyknąć inhibitor i zbadać efekt tej konkretnej inhibicji.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.