Generowanie chimerycznych embrionów ryby danio przez transplantację

Cześć, jestem Hillary Kemp z laboratorium Cecilii Owens. A ja jestem Cecilia Owens. Wraz z Hillary pracujemy w dziale nauk podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle.

Dzisiaj przedstawimy technikę tworzenia chimerycznych zarodków danio przebrzmiałego, znanych również jako mozaiki genetyczne. Procedura ta pozwala nam ocenić komórkowe podstawy funkcji genów podczas rozwoju. Możemy zbadać, czy dany gen funkcjonuje wewnątrz komórek o fenotypie mutanta, co określa się jako funkcję autonomiczną komórkowo, czy też w ich środowisku, co określa się jako brak autonomii komórkowej.

Tworzymy te mozaiki poprzez transplantację komórek między embriony typu dzikiego a mutantami w stadium blastuli lub wczesnej gastruli. Następnie oceniamy funkcję genów, obserwując fenotyp i genotyp komórek pochodzących od dawcy w ich środowisku gospodarza. Zacznijmy zatem.

W tej części protokołu do embrionu dawcy wstrzykuje się barwnik linii komórkowej, aby umożliwić śledzenie losów komórek pochodzących od dawcy po transplantacji. Za pomocą tej techniki można wstrzyknąć dowolny rodzaj kwasów nukleinowych; jednak w przypadku wstrzykiwania DNA należy pominąć etap dekoracji przed pracą z embrionami. Następnie przygotowuje się szalkę do iniekcji, umieszczając szkiełko przedmiotowe pod kątem 45 stopni w najszerszej części szalki Petriego, wypełnionej w trzech czwartych pożywką dla embrionów 1.2% aros w pen strep.

Usuń szkiełko po zastygnięciu agaru, aby utworzyć skośną rynienkę. Wypełnij rynienkę pożywką dla embrionów z pen strep. Następnie przejdź do enzymatycznej dekortykacji embrionów w jednym stadium rozwojowym.

Inkubować zarodki w stadium jednego komórki od jednej do pięciu minut w roztworze pronazy o stężeniu 0,5 mg/mL. Ściśle monitorować proces dekortykacji.

Gdy tylko chorion zacznie widocznie zapadać się, zanurz embriony w wodzie systemowej. Następnie odlej cały chorion, podczas gdy embriony pozostaną na dnie zakrzywionego naczynia. Bardzo ważne jest, aby embriony nie uderzyły ponownie o powierzchnię wody; większość z nich nie posiada już chorionu. Kilka sztuk, które wciąż go mają, wiruje na zewnątrz.

Jeśli jakiekolwiek zarodki nadal znajdują się w chorionie, pipetowanie ich w ten sposób pozwoli na ich wydobycie i uwolnienie, dzięki czemu nigdy nie dotkną one powierzchni wody. Ważne jest, aby obchodzić się z zarodkami pokrytymi powłoką za pomocą pipety, której krawędzie zostały wygładzone poprzez polerowanie ogniowe. Delikatnie przenieś delikatne zarodki pokryte powłoką dec do korytka naczynia do iniekcji, używając szklanej pipety o szerokim światle, wypolerowanej ogniowo.

Następnie umieszczamy pojedynczy plik w tym korytku. Zarodki są teraz gotowe do wstrzyknięcia markera linii komórkowych przy użyciu precyzyjnie skalibrowanej, wyciąganej ogniem pipety szklanej oraz urządzenia do wtrysku ciśnieniowego. Użyjemy naczynia wypełnionego medium do zarodków do ułamania igły oraz naczynia wypełnionego olejem do skalibrowania igły.

Jest to zwykły olej mineralny o standardowej czystości laboratoryjnej. Używamy pary zaostrzonych pęset zegarmistrzowskich, a następnie, patrząc przez okulary, aby określić odpowiedni rozmiar, umieszczamy pęsetę po obu stronach igły i delikatnie odłamujemy fragment, czego nie jestem w stanie zrobić bez patrzenia. Aby określić objętość dostarczanego barwnika lub rybonukleotydu przed rozpoczęciem.

Zmierzyć wielkość bolusa w naczyniu z olejem mineralnym. Igłę należy odłamać tak, aby jednym lub dwoma impulsami mikroinjektora podać bolus o objętości jednego nanolitra. Objętość bolusa można obliczyć na podstawie jego średnicy zmierzonej za pomocą mikrometru okularowego.

Wstrzyknij jeden nanolitr od 1 do 3% roztworu fluorescencyjnego dekstranu bezpośrednio do żółtka pokrytych embrionów w stadium od jednego do czterech komórek. Teraz umieszczę embrion dokładnie pod igłą. Delikatnie wbiję igłę w środek żółtka i nacisnę pedał sterujący.

Podczas wstrzykiwania ważne jest, aby celować w prądy żółtkowe, tak aby barwnik został przetransportowany do komórek. Taka iniekcja będzie wystarczająca do śledzenia komórek w embrionach chimerycznych przez kilka dni rozwoju. Idealnie należy to wykonać, zanim komórki osiągną stadium czterokomórkowe. Hoduj wstrzyknięte embriony przy niskiej gęstości w powlekonej płytce Petriego wypełnionej świeżą pożywką do embrionów z dodatkiem penstrepu.

Należy zauważyć, że wstrzyknięte zarodki mają tendencję do nieco wolniejszego tempa rozwoju; należy inkubować zarodki w różnych temperaturach, 25, 28 i 31 stopni Celsjusza, aby rozłożyć ich rozwój w czasie i zmaksymalizować okno czasowe, w którym można przeprowadzić przeszczepy. Aparatura używana do transplantacji komórek w blastuli danio prążkowanego składa się ze strzykawki Hamiltona z kontrolą napędu, połączonej za pomocą trójdrożnego kurka z rezerwuarem oleju mineralnego oraz z uchwytem mikropipety za pomocą odcinka elastycznego przewodu. Należy usunąć z układu wszystkie pęcherzyki powietrza, ponieważ uniemożliwią one kontrolę nad ssaniem i ciśnieniem.

Należy użyć stereomikroskopu wyposażonego w wysokiej jakości optykę o powiększeniu co najmniej DX. Do sterowania pozycjonowaniem uchwytu mikropipety i igły zaleca się użycie manualnego mikromanipulatora NARA shige. Należy upewnić się, że jest on przymocowany do stołu laboratoryjnego za pomocą podstawy magnetycznej, aby zapobiec przenoszeniu drgań na przeszczep.

Igły do transplantacji wykonuje się z szklanych pipet kapilarnych, które są wyciągane do łagodnego zwężenia na biegunie elektrody. Szczegóły dotyczące wyciągania pipet pod mikroskopem dissectingowym oraz odłamywania końcówki wyciągniętej igły znajdują się w protokole JoVE z laboratorium Miriam Goodman. W przypadku transplantacji na etapie blastuli średnica zewnętrzna igły powinna wynosić od około 50 do 60 micronów, a dla transferu na etapie gastruli od 30 do 40 micronów.

Aby przeprowadzić transfer w fazie gastruli i poprawić penetrację, najpierw należy wyciągnąć ostry zadzior na końcu igły za pomocą mikrokuźni, wygładzając końcówkę igły poprzez zbliżenie jej do włókna mikrokuźni. Następnie należy obrócić igłę tak, aby krawędź prowadząca ścięcia mogła zetknąć się z włóknem. Gdy krawędź prowadząca igły dotknie włókna, należy ją szybko odsunąć, aby utworzyć zadzior.

Aby uniknąć uszkodzenia komórek, zadziorek powinien być prosty, a końcówka igły nie powinna być zakrzywiona. Po przygotowaniu zestawu oraz igieł do transplantacji można przystąpić do tworzenia embrionów chimerycznych. Transplantacje w stadium blastuli stosuje się do przenoszenia komórek między embrionami w sytuacjach, gdy nie jest wymagana precyzyjna informacja o mapie losów komórkowych. Z wyjątkiem pierwotnych komórek linii zarodkowej, większość komórek na tym etapie zazwyczaj nie jest jeszcze zdeterminowana pod kątem konkretnego losu.

Mapa losów blastuli jest taka, że możemy rozróżnić komórki, z których powstanie ektoderma, od komórek, z których powstanie mezoderma. Progenitory mezodermalne i endodermalne znajdują się w pobliżu brzegu zarodka na etapie blastuli, podczas gdy progenitory dermalne, z których powstanie układ nerwowy i skóra powierzchniowa, znajdują się dalej od brzegu zarodka. Dzięki temu, podczas transplantacji komórek do zarodków na etapie blastuli, możemy skierować te komórki do domniemanej mezodermy lub domniemanej ektodermy.

Nie możemy jednak skierować komórek do żadnego konkretnego regionu ektodermy lub mezodermy, ponieważ nie wiemy, gdzie on się znajduje. Na etapie blastuli, w miejscu, gdzie znajduje się strona grzbietowa embrionu, przygotuj wcześniej naczynia do iniekcji, umieszczając plastikową formę z parami rzędów klinowatych wypustek w szalce Petriego wypełnionej do połowy stopionym 1,2% agarosem w medium dla embrionów. Po zestaleniu się agarosu usuń szablon, pozostawiając rzędy trójkątnych wgłębień, z których każde jest wystarczająco duże, aby pomieścić jeden embrion.

Wypełnij formę do transplantacji pożywką do embrionów z dodatkiem penstrepcyny, a następnie za pomocą wypalanej szklanej pipety umieść pojedynczo embriony w stadium blastuli w każdej z dolek. Przenieś teraz embriony do dolek transplantacyjnych, pozwalając im początkowo leżeć na boku. Ułóż embriony tak, aby embriony donora znajdowały się w jednej kolumnie, a embriony biorcy w kolumnie sąsiedniej.

Ustaw szalkę na stole w taki sposób, aby w momencie wniknięcia igły transplantacyjnej do embrionu, igła dociskała go do tylnej ścianki dołka. Za pomocą mikromanipulatora opuść igłę transplantacyjną do szalki pod dość stromym kątem. Idealnie igła transplantacyjna powinna wnikać do embrionu pod kątem około 45 stopni.

Gdy końcówka igły znajdzie się poniżej powierzchni medium do zarodków, pobierz niewielką ilość medium do wnętrza igły, obracając mikrometryczny napęd sterujący strzykawką Hamiltona. Aby uzyskać najdokładniejszą kontrolę, granica między olejem mineralnym a medium do zarodków powinna pozostać w cienkiej, zwężającej się części igły, nie za blisko jej końca. Delikatnie ustaw zarodek dawcy za pomocą igły, a następnie wycofaj igłę i wprowadź ją do czapki blastuli zarodka w wybranym miejscu.

Szybkie, zdecydowane uderzenie pozwoli na przebicie się przez zarodek, zapobiegając jego przesunięciu. Należy powoli i ostrożnie pobrać komórki donora do igły, aby uniknąć ich uszkodzenia mechanicznego. Po pobraniu pożądanej liczby komórek należy unikać zasysania żółtka do wnętrza igły.

Należy lekko odwrócić ciśnienie, aby zatrzymać ssanie, a następnie wyjąć igłę, aby ustawić zarodek biorcy w odpowiedniej pozycji. Poprzez przesuwanie naczynia do transplantacji można wprowadzać niewielkie korekty położenia zarodka biorcy, delikatnie obracając go za pomocą igły transplantacyjnej, dbając jednocześnie o to, aby nie dotknąć żółtka. Podczas wprowadzania komórek dawcy do zarodka biorcy należy unikać zasysania żółtka do wnętrza zarodka, ponieważ spowoduje to uszkodzenie i śmierć komórek dawcy; komórki z jednego zarodka dawcy mogą zostać przeszczepione do wielu biorców po zakończeniu transferów komórkowych.

Przenieś pary dawca-gospodarz do powlekanych studzienek płytki 24-dołkowej, aby kontynuować rozwój. Jedynym wyjątkiem od reguły, zgodnie z którą komórki w stadium blastuli nie są jeszcze przypisane do konkretnych losów, są pierwotne komórki płciowe. Komórki pierwotne płciowe są specyfikowane bardzo wcześnie w rozwoju i są przypisane do stanu pierwotnych komórek płciowych.

Od bardzo wczesnego etapu pierwotne komórki zarodkowe znajdują się w pobliżu brzegu blastuli oraz embrionu w stadium gastruli. Jeśli zatem celem eksperymentu transplantacyjnego jest przeszczepienie pierwotnych komórek zarodkowych, kluczowe jest miejsce, z którego pochodzą komórki w embrionie dawcy, natomiast nieistotne jest miejsce ich umieszczenia w embrionie biorcy. Zasadą jest zatem taka, że w przypadku komórek somatycznych to miejsce ich przeznaczenia w embrionie biorcy determinuje ich dalszy los.

W przypadku pierwotnych komórek płciowych kluczowe jest miejsce ich pobrania z embrionu dawcy, ponieważ ich los jest już zdeterminowany. Jeśli celem jest transplantacja pierwotnych komórek płciowych, należy je pobrać z brzegu jaja embrionu dawcy; na tym etapie rozwoju (stadium sferuli lub wczesnym stadium) znajdują się one tuż przy brzegu embrionu w czterech małych skupiskach, z których każde składa się z trzech lub czterech komórek. Należy je pobierać bardzo ostrożnie, aby przypadkowo nie zasysać żółtka.

W porządku, to wszystko, co zrobiłem, a teraz przechodzę do zarodka gospodarza. Prymordialne komórki płciowe będą teraz migrować do obszaru grzbietu płciowego w każdym zarodku, w którym się znajdą. W związku z tym nie ma potrzeby przeszczepiać tych prymordialnych komórek płciowych do krawędzi; dotrą tam samodzielnie.

Zatem po prostu przesadzam je, umieszczając w dowolnym miejscu w organizmie po stadium embrionalnym. Kluczową kwestią w przypadku transplantacji komórek linii zarodkowej, co jest całkowitym przeciwieństwem każdego innego rodzaju przeszczepu, jest to, że istotne jest pochodzenie komórek dawcy. Transplantacja komórek do gospodarza w stadium gastrulacji pozwala eksperymentatorowi wykorzystać mapę losów komórek danio pręgowanego, która wyłania się, gdy staje się widoczna tarcza embrionalna.

Można już rozróżnić różne typy tkanek, jak również domeny w obrębie presumptive central nervous system. Podczas przenoszenia komórek między embrionami na etapie gastruli występują pewne różnice w protokole, jednak ogólna procedura jest podobna do pracy z blastulami w celu zamontowania gastruli. Najpierw nałóż pionowy pasek metylocelulozy w zagłębieniu szkiełka wgłębnego, a następnie wypełnij je obfitą ilością pożywki dla embrionów z pen-strep, używając wypalanej pipety transferowej.

Przenieś jednego dawcę i trzech gospodarzy w stadium tarczy do wgłębienia na preparacie. Wybierz embriony dawców, które są nieco młodsze od gospodarzy. Do manipulowania klejem gastralnym wymagane jest nowe narzędzie: końce krótkiego odcinka żyłki wędkarskiej o wytrzymałości dwóch funtów wprowadzone do końcówki rurki kapilarnej.

W ten sposób tworzy się małą pętlę. Używając pętli, należy delikatnie przetoczyć embriony dawcy i biorcy na górną część paska z metylocelulozą i wcisnąć je w metylocelulozę, aż będą stabilnie osadzone. Należy je ustawić tak, aby docelowy region znajdował się na górze.

Ponieważ podczas transplantacji igła wnika do zarodka stycznie, aby dostarczyć komórki dawcy bez uszkadzania żółtka, transplantacje w stadium gastruli najlepiej przeprowadzać przy użyciu mikroskopu złożonego ze stałym powiększeniem. Należy użyć sterowników mikromanipulatora, aby ustawić końcówkę igły do transplantacji w płaszczyźnie ostrości.

Ustaw uchwyt mikropipety oraz igłę pod niewielkim kątem, tak aby igła znajdowała się jak najbliżej poziomu, na ile pozwala krawędź wgłębienia na szkiełku. Następnie przebij embrion dawcy. Jeśli jest on odpowiednio zamocowany, nie będzie się toczyć podczas wprowadzania igły do transplantacji, chyba że embrion jest zbyt stary, co utrudnia łatwe przeniknięcie igły.

Aby uniknąć przebicia żółtka, igła powinna zostać wprowadzona do zarodka na płaszczyźnie ogniskowej znajdującej się nieco głębiej niż EDL. Po przebiciu z dawcy można pobrać dużą liczbę komórek, wystarczającą do wykonania do trzech iniekcji do komórek biorcy. Podczas pobierania komórek należy unikać zasysania żółtka, przesuwając igłę w miarę pobierania komórek, jeśli jest to pożądane.

W celu pozyskania większej liczby komórek można pobrać dodatkowe embriony, używając tej samej igły przed wstrzyknięciem komórek do gospodarza; podczas wstrzykiwania komórek do embrionu gospodarza należy je uwalniać, przesuwając igłę przez docelowy obszar, zamiast osadzać komórki w jednej skupionej masie. Zwiększy to prawdopodobieństwo, że komórki donora przyczynią się do powstania pożądanego tkanki. Po zakończeniu transferu komórek należy umieścić cały preparat na szkiełku w czarce Petriego i ostrożnie zalać go pożywką do embrionów z dodatkiem pen strep.

W ciągu następnych kilku godzin metyloceluloza rozpuści się, uwalniając embriony. Liczba przeniesionych komórek zależy od konkretnego celu eksperymentu. Komórki od jednego donora mogą zostać przeszczepione do trzech lub czterech biorców rano następnego dnia po transplantacji.

Można zbadać organizmy biorcy, aby ustalić, czy celowanie w komórki dawcy zakończyło się sukcesem. Pomyślna transplantacja pierwotnych komórek płciowych z etapu blastuli skutkuje pojawieniem się fluorescencyjnie znakowanych komórek, rozmieszczonych brzusznie w pobliżu połączenia między ylk a przedłużeniem ylk. W ten sposób zaprezentowaliśmy, jak przeprowadzać transplantacje na etapie gastruli i blastuli.

Podczas stosowania tej techniki ważne jest wybranie odpowiedniej metody transplantacji dla tkanki docelowej, w którą chcą trafić komórki. Transplantacja na etapie blastuli jest wystarczająca do ustalenia, czy komórki migrują do mezodermy, czy do ektodermy. Technikę tę można również wykorzystać do celowania w pierwotne komórki płciowe.

Jeśli chcą Państwo przeprowadzić dokładniejsze mapowanie, lepiej jest zastosować transplantat w wieku gastruli, w którym określono już stronę grzbietową. Dzięki tej technice można kierować komórki do różnych części układu nerwowego, w szczególności do przedmózgowia, śródmózgowia, tyłomózgowia i rdzenia kręgowego. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia we wszystkich Państwa eksperymentach.