Wysokoprzepustowa metoda krio konserwacji plemników i zapłodnienia in vitro ryby danio-ostreokonicznej (zebrafish)

Witam, jestem Bruce Draper z Uniwersytetu Kalifornijskiego w Davis, z katedry biologii molekularnej i komórkowej, a ja jestem Cecilia Moans z Wydziału Nauk Podstawowych w Fred Hutchinson Cancer Research Center w Seattle. Dzisiaj wraz z Cecilią zaprezentujemy protokół kriokonserwacji nasienia danio pręgowanego, który stanowi modyfikację oryginalnego protokołu Briana Harveya. Pokażemy Państwu, że pracując w dwuosobowych zespołach, możliwe jest kriokonserwowanie nasienia od 100 osobnych samców w czasie krótszym niż dwie godziny.

Choć po rozmrożeniu obserwuje się szeroki zakres przeżywalności, średnio otrzymujemy 25% przeżywalności, a dotyczy to biblioteki kriosprzechowywanej przez ponad siedem lat. Przejdźmy zatem do pracy. Przed wykonaniem tej procedury należy najpierw przygotować roztwory do mrożenia plemników.

Roztwór Ringera dla ryb według Ginsburga jest przygotowywany na świeżo co trzy dni, natomiast medium do mrożenia jest przygotowywane codziennie, z dodatkiem i bez dodatku metanolu. Skład tych roztworów znajduje się w internetowych informacjach uzupełniających towarzyszących temu protokołowi. Materiały użyte w tej procedurze mogą wpływać na szybkość mrożenia i rozmrażania, co z kolei może oddziaływać na żywotność zamrożonych plemników.

Z tego powodu w dodatkowych informacjach online zamieszczono również listę zalecanych materiałów. Najlepiej jest zamrażać plemniki na drobno kruszonym suchym lodzie, a nie na pelletach suchego lodu. Prostym sposobem kruszenia suchego lodu jest zawinięcie go w ręcznik i rozbicie młotkiem.

Bardziej efektywną metodą jest zastosowanie młynka z suchym lodem, takiego jak model claws RE two, w celu zamrożenia nasienia danio pręgowanych. Najpierw należy oznaczyć kapilary o pojemności 10 µL za pomocą pisaka laboratoryjnego na poziomie 3,33 µL lub około 16,7 mm od dna. Aby znieczulić samce, umieść dwa do czterech osobników w zlewce zawierającej roztwór trica rozcieńczony w wodzie dla ryb. Przepis można znaleźć w książce o danio pręgowanych.

Po znieczuleniu wyjmij ryby z roztworu znieczulającego za pomocą plastikowej łyżki i delikatnie osusz je ręcznikiem papierowym. Zwróć szczególną uwagę na osuszanie strony brzusznej. Woda aktywuje plemniki, dlatego kluczowe jest dokładne osuszenie obszaru wokół otworu płciowego.

Umieść rybę na uchwycie gąbkowym stroną brzuszną do góry. Jeśli obszar wokół płetw brzusznych jest nadal wilgotny, delikatnie osusz go za pomocą chusteczki Kim wipe. Umieść oznakowaną kapilarę w gumowym adapterze do pipety ustnej, który jest dołączony do kapilar.

Adapterem jest gumowy wąż, który posiada ustnik na jednym końcu i uchwyt kapilarny na drugim. Alternatywnie rurka kapilarna może zostać podłączona do strzykawki Hamiltona o pojemności 50 µL. Używając krótkiego odcinka rurki tigon o odpowiedniej średnicy, umieść samca pod mikroskopem i odsłoń otwór urogenitalny, ostrożnie rozsuwając płetwy brzuszne.

Używając końcówki rurki kapilarnej, należy pobrać nasienie, delikatnie pocierając boki ryby gładkimi pincetą lub lekko ściskając boki ryby palcem wskazującym i kciukiem; nasienie powinno być zbierane do rurki kapilarnej podczas jego wydzielania za pomocą delikatnego zasysania. Należy unikać zanieczyszczenia próbki odchodami, które mogą zostać wydalone wraz z nasieniem. Docelowa objętość nasienia wynosi 3.3 µL.

Minimalna akceptowalna ilość plemników różni się w zależności od ich jakości. Plemniki wysokiej jakości są białe i nieprzejrzyste, podczas gdy plemniki słabej jakości mają wodnisty wygląd. Generalnie minimalna akceptowalna ilość to 1 µL plemników wysokiej jakości lub jedna trzecia objętości docelowej, oraz 2 µL plemników słabej jakości lub dwie trzecie objętości docelowej.

Jeśli objętość nasienia nie osiągnie docelowej wartości 3,3 microliters, należy uzupełnić objętość do oznaczenia piórem, używając medium do mrożenia bez metanolu. Jeśli objętość nasienia już osiąga lub przekracza oznaczenie piórem na rurce kapilarnej, należy przejść do następnego kroku. Teraz dodaj krioprotektant do nasienia.

Pobrać medium do mrożenia z metanolem do pomarańczowej kreski. Przybliżona objętość całkowita wynosi obecnie 20 µL. Przenieść mieszaninę plemników i krioprotektanta na czystą powierzchnię szkiełka zegarowego, delikatnie mieszając poprzez czterokrotne pipetowanie w górę i w dół, unikając wprowadzania pęcherzyków powietrza.

Podziel spermę na dwie probówki kriogeniczne, pipetując 10 µL roztworu krioprotekcyjnego dla plemników na dno każdej z oznakowanych probówek. Szybko zakręć probówki i umieść każdą z nich w osobnej probówce typu Falcon o pojemności 15 mL. W temperaturze pokojowej zakręć probówki Falcon i umieść je w drobno rozkruszonym suchym lodzie.

Probówki należy wetknąć wystarczająco głęboko, tak aby widoczne były jedynie zakrętki, co pozwoli na monitorowanie probówek typu Falcon. Należy je ponumerować i zapisać czas umieszczenia każdej z nich w suchym lodzie. Plemniki powinny zamrażać się w suchym lodzie przez 20 minut.

Po zamrożeniu nasienia przenieś obie probówki kriogeniczne do naczynia typu doer zawierającego ciekły azot. W celu tymczasowego przechowywania umieść pudełko zamrażarki w kąpieli z ciekłego azotu, aby próbki nie uległy ogrzaniu.

Użyj długich metalowych szczypiec, aby wyciągnąć probówki z kolby, i manipuluj nimi w rękawicach kriogenicznych. Alternatywnie probówki kriogeniczne można przenieść bezpośrednio z suchego lodu do zamrażarki. Jeśli pudełko do zamrażarki jest przechowywane w ciekłym azocie w pojemniku styropianowym do długoterminowego składowania, umieść probówki kriogeniczne w kriogenicznej zamrażarce z ciekłym azotem.

Aby zachować żywotność plemników, kluczowe jest przechowywanie fiolek w zanurzeniu w ciekłym azocie; fiolki przechowywane w fazie gazowej mogą z czasem utracić żywotność. Równie istotna dla utrzymania żywotności plemników jest szybkość działania. Czas pomiędzy dodaniem krioprotektanta a umieszczeniem fiolek z plemnikami na lodzie suchym nie powinien przekraczać 30 sekund. Zapłodnienie in vitro.

Wykorzystanie plemników kriokonserwowanych najlepiej przeprowadzić w dwie osoby. Jedna osoba wyciska jaja z samic, podczas gdy druga rozmraża plemniki. Ustaw kąpiel wodną na 33 °C.

Wyjmij krio-probówkę z zamrażarki z ciekłym azotem i przenieś ją do pojemnika lub kolby zawierającej ciekły azot, aż będzie gotowa do rozmrożenia. Wyciśnij ikrę z znieczulonych samic do 35 milimetrowej plastikowej szalki Petriego. Jest to szczegółowo opisane w protokole JoVE zatytułowanym Making Gyno Genetic deployed zebrafish by early pressure, który zawiera szczegółowy opis ryb zebrafish.

W przypadku zapłodnienia in vitro, dobra partia zawiera ponad 150 jednolitych, żółtawych jaj. Wszelkie białe zanieczyszczenia świadczą o degradacji. Jeśli to możliwe, należy starać się pozyskać trzy partie jaj i połączyć je w jednej płytce.

Jeśli w ciągu jednej minuty od pobrania pierwszej porcji nie uzyskano trzech dobrych porcji, należy przejść do następnego kroku. Przez cały czas rozmrażania nasienia naczynie powinno pozostać przykryte. W tym czasie należy wyjąć fiolkę z ciekłego azotu i zdjąć nakrętkę.

Szybko zanurz fiolkę do połowy w 33 °C kąpieli wodnej na 8 do 10 sekund. Szybko dodaj do fiolki 70 µL w temperaturze pokojowej roztworu soli buforowanej Hanksa i wymieszaj, pipetując w górę i w dół, następnie natychmiast dodaj zawartość do ikry w szalce Petriego i delikatnie wymieszaj końcówką pipety. Następnie natychmiast aktywuj plemniki i ikrę, dodając 750 µL wody dla ryb, zamieszaj przez wirowanie i inkubuj przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po pięciu minutach napełnić naczynie rybami i wodą, a następnie inkubować w temperaturze 28 °C. Po dwóch do trzech godzinach policzyć i przenieść żywe embriony do naczyń o średnicy 100 mm, rozmieszczając po 50 embrionów na naczynie. Należy również policzyć zapłodzone jaja, aby można było określić płodność próbki nasienia.

Płodność plemników to stosunek liczby żywotnych embrionów do całkowitej liczby jaj wykorzystanych podczas zapłodnienia in vitro. Jaja można sortować w dowolnym czasie od dwóch do sześciu godzin po zapłodnieniu in vitro. W przypadku łatwego odróżnienia jaj niepłodnych od żywotnych embrionów, jaja niepłodne są przeźroczyste i niepodzielone.

Przy oglądaniu z oświetleniem prześwietującym pod mikroskopem stereoskopowym, średnia żywotność kriokonserwowanych plemników wykazuje duże zróżnicowanie. Niemniej jednak możliwe powinno być uzyskanie stabilnej średniej żywotności na poziomie 25% przez wiele lat. Wykres ten przedstawia średni procent żywotności plemników zamrożonych między 2001 a 2003 rokiem i rozmrażanych aż do 2008 roku.

Właśnie zaprezentowaliśmy wysokoprzepustową metodę kriokonserwacji nasienia ryb zebranych. Podczas wykonywania tego protokołu ważne jest stosowanie wszystkich zalecanych elementów z tworzyw sztucznych i sprzętu, a także użycie sproszkowanego suchego lodu zamiast jego granulek. Kluczowe jest wykorzystanie nasienia i jaj najwyższej jakości, a w przypadku jaj podczas zapłodnienia in vitro, po rozmrożeniu nasienia, należy użyć jak największej liczby jaj, aby zwiększyć liczbę uzyskanych w końcowym etapie żywotnych embrionów, co może wymagać wykorzystania trzech do czterech samic.

Kolejnym kluczowym elementem protokołu jest szybkość. Proces od momentu pozyskania nasienia od samca do umieszczenia go w suchym lodzie nie powinien trwać dłużej niż około minuty. Myślę, że to wszystko.

Powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.