Wizualizacja pojedynczych kompleksów molekularnych In vivo Wykorzystanie zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej

W niniejszym materiale prezentujemy protokół przeprowadzania mikroskopii fluorescencyjnej pojedynczych cząsteczek w żywych komórkach bakteryjnych, umożliwiający wykrywanie, śledzenie i kwantyfikację funkcjonalnych kompleksów molekularnych. Protokół rozpoczyna się od hodowli bakterii, które syntetyzują białko znakowane cząsteczką barwnika fluorescencyjnego. Po czterech do sześciu godzinach z hodowli pobierana jest niewielka objętość komórek, a ich włókna flagellarne są skracane poprzez ścinanie.

Szklana lamelka wewnątrz komory przepływowej jest powlekana, aby umożliwić przyleganie komórek do powierzchni. Komórki są wstrzykiwane do komory przepływowej i przytwierdzane za pomocą żelowego słupka, który jest obrazowany w fluorescencji przy użyciu mikroskopii z wzbudzeniem laserowym. Kamera o wysokiej wydajności kwantowej rejestruje następnie jasne obrazy w polu jasnym oraz obrazy fluorescencyjne znakowanych kompleksów molekularnych.

Witajcie, nazywam się Ian Doy i pracuję z Markiem Lee w Departamencie Biochemii na Uniwersytecie Oksfordzkim. Jestem Alex Robertson i pracuję z Markiem Lee w departamencie fizyki. Jestem Nick De z laboratorium leak, również działającego przy departamencie fizyki.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę wizualizacji pojedynczych kompleksów molekularnych w żywych bakteriach przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej. Stosujemy tę procedurę, aby badać je w stanie funkcjonalnym. Wykorzystujemy ją również do badania dynamiki naturalnych maszyn biologicznych w czasie rzeczywistym w skali nanometrycznej.

Zacznijmy zatem. Na początek rozmroź 50 µL zamrożonych szczepów bakterii e coli. Zostały one zmodyfikowane genetycznie.

Aby oznakować białko cząsteczką barwnika fluorescencyjnego, zaszczepić pięć mililitrów pożywki wzrostowej LB i hodować bakterie tlenowo w wytrząsarkach przez noc w temperaturze 37 °C. Następnego dnia pobrać 50 µL nasyconej kultury i przenieść ją do minimalnej pożywki M 63 z glukozą, a następnie inkubować w temperaturze 30 °C przez cztery do sześciu godzin. W tym przypadku zastosowano dwa różne szczepy komórkowe.

Jeden z nich wykazuje ekspresję cytochromu transportującego elektrony połączonego z GFP. Drugi wykazuje ekspresję białka zaangażowanego w pracę bakteryjnego silnika wiciowego. Komórki połączone z GFP mogą być zbierane bezpośrednio z rosnącej subkultury, jeśli mają być obserwowane jako próbki unieruchomione, lub mogą zostać poddane ścinaniu w celu skrócenia wici bakteryjnych, jeśli są obserwowane w warunkach przytwierdzonych.

Aby poddać bakterie ścinaniu, przenieś od 1 do 5 ml subkultury do urządzenia składającego się z dwóch sterylnych strzykawek za pomocą sterylnego pipetowania. Naprzemiennie naciskaj tłoki obu strzykawek, aby przepchnąć kulturę przez wąską rurkę około 50–100 razy, zależnie od uzyskanego stopnia ścinania. Następnie odwiruj kulturę w wirówce, aby uzyskać osad komórkowy, a potem resuspenduj komórki w minimalnym medium, aby usunąć fragmenty wici. Po przygotowaniu komórek przygotuj czyste szkiełka przedmiotowe BK7, zanurzając je w nasyconym roztworze wodorotlenku potasu i etanolu przez 20 minut.

Dokładnie wypłucz w wodzie dejonizowanej i etanolu, a następnie pozostaw do wyschnięcia na powietrzu przez co najmniej jedną godzinę. Następnie skonstruuj prostą komorę przepływową, aby umieścić komórki w mikroskopie. W tym celu nanieś linie z wazeliny parafinerowej na szkiełko przedmiotowe z szkła BK7, a następnie stwórz konstrukcję typu kanapka, nakładając na górze jedno z oczyszczonych szkiełek nakrywkowych.

Naciśnij delikatnie pęsetą. Powinno to zapewnić objętość komory przepływowej od 5 do 10 µL. Aby zaobserwować unieruchomione komórki, wypełnij komorę przepływową, wstrzykując 0,1% roztwór poli-L-lizyny, i pozostaw do inkubacji w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną minutę.

Następnie przepłukano komorę przepływową, wstrzykując 100 µL minimalnego medium z jednego końca komory i jednocześnie odsączając medium z drugiego końca za pomocą ręcznika papierowego. Po tym procesie odsączono 20 µL rozcieńczenia 1:500 mikrosfer lateksowych o średnicy 200 nm w minimalnym medium, aby oznaczyć powierzchnię szkiełka nakrywkowego. Komorę przepływową umieszczono w prostej komorze wilgotnościowej i inkubowano w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Komorę przepływową odwrócono tak, aby szkiełko nakrywkowe było skierowane w dół.

Niewiązane kuleczki są następnie wypłukiwane poprzez odsączanie 100 µL minimalnego medium za pomocą ręcznika papierowego. Aby zaobserwować przytwierdzone komórki, należy pominąć etap inkubacji z poli-L-lizyną, zamiast tego wypełnić komorę przepływową roztworem przeciwciał Anti-Flag gellan w stężeniu 5 µg/mL, a następnie umieścić ją w komorze wilgotnościowej na 10 minut. Po inkubacji należy przepłukać komorę przepływową, odsączając jej zawartość ręcznikiem papierowym.

Następnie, za pomocą papierowego ręcznika, wciągnij 20 µL hodowli komórkowej do komory przepływowej, wykorzystując próbkę poddaną ścinaniu w celu obserwacji komórek przytwierdzonych lub próbkę niepoddaną ścinaniu w celu obserwacji komórek unieruchomionych; komorę przepływową należy odwrócić i umieścić w komorze wilgotnościowej na 20 minut. Niewiążące się komórki są następnie wypłukiwane poprzez wciągnięcie 100 µL minimalnego medium. Na środku górnej powierzchni szkiełka nakrywkowe nałóż kroplę olejku imersyjnego.

Ostrożnie umieść celę przepływową na uchwycie do próbek specjalnie skonstruowanego mikroskopu fluorescencyjnego. Powinno to zapewnić kontakt optyczny z obiektywem o wysokiej aperturze numerycznej. Następnie włącz kamerę z mnożeniem elektronów mikroskopu i ustaw chłodzenie kamery na -70 °C.

Oprogramowanie jest ustawione na rejestrację obrazów z typową częstotliwością klatek 25 hertz. W trybie transferu klatek. Włącz oświetlenie w polu jasnym i ustaw ostrość obrazu.

Wybierz odpowiednią komórkę lub grupę komórek do obrazowania na podstawie tego, czy są one przytwierdzone wzdłuż swojej długiej osi. Równolegle do powierzchni szkiełka podstawowego wyreguluj ostrość tak, aby 200 nanometer lateksowe kuleczki przytwierdzone do powierzchni szkiełka były dokładnie w ogniskowej. Pozyskaj sekwencję obrazów w polu jasnym, aby zarejestrować obrys ciała komórki.

Następnie wyłącza się oświetlenie w jasnym polu i ustawia maksymalną wzmocnienie kamery w celu obrazowania z wykorzystaniem całkowitego wewnętrznego odbicia fluorescencji, znanego również jako TIRF. Należy rozpocząć akwizycję obrazu i otworzyć migawkę lasera, aby wzbudzić białka fluorescencyjne wewnątrz bakterii. Parametry intensywności lasera oraz prędkości akwizycji muszą zostać zoptymalizowane dla danego systemu biologicznego.

Próbki poddane badaniu są naświetlane aż do momentu fotowybielenia, co zazwyczaj trwa około 10 sekund. Po zebraniu danych obrazy są wprowadzane do specjalnie napisanego programu analitycznego, który automatycznie wykrywa pozycje fluorescencyjnych punktów w komórkach z precyzją do kilku nanometrów i wyodrębnia ich wielkość oraz jasność. Jasność krzywej fotowybielenia w funkcji czasu dla kompleksu molekularnego jest następnie wykorzystywana do oszacowania stechiometrii.

Stosując tę metodę, obraz komórek obserwowany w jasnym polu jest bardzo wyraźny, tak że obrysy ciał komórkowych są ciemne na tle biało-szarego ciała komórki przy zastosowaniu fluorescencji z unieruchomionymi komórkami. Widoczne są tutaj w sztucznych kolorach wyraźne punkty o intensywności, których szerokość wynosi zazwyczaj od 250 do 300 nanometrów. W obrazach w jasnym polu pod wpływem wzbudzenia fluorescencyjnego można zaobserwować zdrowe, przytwierdzone komórki rotujące wokół punktu przytwierdzenia.

W punkcie przyczepienia można również dostrzec niektóre kompleksy molekularne, co wskazuje na lokalizację białka transportowanego wraz z motorem Geller. Punkty te stanowią poszczególne kompleksy molekularne. Liczba widocznych kompleksów zależy od zastosowanego trybu oświetlenia oraz od tego, ile takich kompleksów znajduje się w danej chwili w komórce.

Jeśli początkowa gęstość plamek jest bardzo wysoka, jak ma to miejsce w przypadku użytych tutaj znakowanych cytochromów, wykonanie wstępnego wybielania metodą FRAP może poprawić kontrast obrazowania. Mobilność plamek zależy od konkretnego układu biologicznego. W ramach badania pokazaliśmy właśnie, jak wizualizować pojedyncze kompleksy molekularne przy użyciu zaawansowanej mikroskopii fluorescencyjnej.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby nie dopuścić do ścinania komórek, ponieważ może to upośledzić funkcjonalność silnika wici. Należy również pamiętać, aby nie pozostawiać komórek na szkiełkach mikroskopowych przez więcej niż godzinę, gdyż mogą one ulec niedotlenieniu. W celu znalezienia optymalnych warunków obrazowania wymagana jest automatyzacja.

Użycie samego oczyszczonego GFP może pomóc w ustaleniu prawidłowej mocy lasera dla konkretnego systemu mikroskopowego. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w eksperymentach.