Przygotowanie puli lizatu płytek krwi ludzkich (pHPL) jako wydajnego suplementu do bezzernowych hodowli ludzkich komórek macierzystych
30 października 2009
Ludzki lizat płytek krwi jest bogatym źródłem czynników wzrostu i silnym suplementem w hodowlach komórkowych. Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi, rozpoczynając od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzając kilka cykli zamrażania i rozmrażania oraz usuwając fragmenty płytek.
Niniejszy protokół przedstawia proces przygotowania dużej puli lizatu płytek krwi człowieka, zaczynając od osocza bogatopłytkowego. Poprzez przeprowadzenie jednego cyklu zamrażania i rozmrażania dochodzi do lizy płytek krwi. Następnie co najmniej 10 jednostek lizatu płytek krwi człowieka jest łączonych w jedną partię puli lizatu płytek krwi człowieka (PHPL).
Tę objętość wynoszącą około trzech litrów dzieli się dalej na alikwoty, które ponownie zamraża się w celu usunięcia fragmentów płytek krwi. Alikwoty te rozmraża się, przenosi do probówek i wiruje. Nadsącz stanowi PHPL pozbawiony fragmentów płytek krwi, zawierający czynniki wzrostu pochodzenia płytkowego, które są wykorzystywane jako suplementy do hodowli komórkowych.
Pozostały osad z fragmentami płytek krwi zostaje usunięty. Dzień dobry, nazywam się Kadina Sharmo i reprezentuję laboratorium dr TRO w jednostce badań nad komórkami macierzystymi na Uniwersytecie Medycznym w Grads. Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania puli izolatów ludzkich płytek krwi.
Zaczniemy od osocza bogatopłytkowego, przeprowadzimy kilka cykli zamrażania i rozmrażania, a następnie usuniemy fragmenty płytek krwi. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu uzyskania odpowiedniego suplementu do hodowli komórkowych jako alternatywy dla płodowej surowicy bydlęcej. Zatem zacznijmy.
Protokół ten rozpoczyna się od osocza bogatopłytkowego, zwanego PRP. Osocze to mogło zostać przygotowane za pomocą aferezy lub pozyskane z warstwy leukocytarnej (Buffy coat). Osoby spoza obszaru medycyny transfuzjologicznej powinny nabyć PRP z lokalnego banku krwi lub od innego autoryzowanego dostawcy.
Sprawdź sterylność jednostki PRP, przenosząc 20 ml z każdej jednostki do małego podłączonego worka, a następnie odłączając worek za pomocą zgrzewarki. Alikwot ten można wysłać do laboratorium mikrobiologicznego w celu przeprowadzenia testów sterylności bezpośrednio po przygotowaniu. Ważne jest, aby zamrozić jednostki PRP w temperaturze co najmniej -20 °C w oryginalnym worku do przechowywania.
Po uzyskaniu negatywnych wyników testów bakteriologicznych można przejść do kolejnego kroku. Należy uważać, aby lizat płytek krwi pochodzenia ludzkiego (zwany odtąd HPL) nie nagrzał się nadmiernie; jednostki HPL należy umieścić w kąpieli wodnej o temperaturze 37 °C do momentu rozpuszczenia się skrzepów lodowych. Po tym etapie zamrażania i rozmrażania płytki powinny zostać poddane lizie w celu przygotowania zestandaryzowanego produktu dla każdej puli lizatu płytek.
Zebrać od 10 do 15 rozmrożonych jednostek PRP. Podłączyć kolejno każdą workowidą jednostkę HPL do podwójnego worka do łączenia, a następnie przenieść HPL do tych dwóch worków. Odłączyć puste worki HPL za pomocą zgrzewarki.
Wymieszać zawartość obu worków, aby uzyskać końcową objętość od trzech do czterech litrów połączonego lizatu płytek krwi człowieka. Produkt ten nazywany jest od teraz PHPL. Podłączyć mały worek i pobrać 20 mililitrów próbki PHPL w celu sprawdzenia jałowości połączonego produktu.
Przenieś alikwoty PHPL do mniejszych worków połączonych z podwójnym workiem do łączenia w celu dalszej obróbki. Przenieś objętości wynoszące około 250 milliliters do małych worków do przechowywania, a następnie odłącz wypełnione worki za pomocą zgrzewarki. Następnie przeprowadź dodatkowy cykl zamrażania i rozmrażania, aby zwiększyć stopień fragmentacji płytek krwi oraz ilość uwalnianych czynników wzrostu.
Należy to zrobić, zamrażając małe woreczki z porcjowanym PHBL w temperaturze -20 °C. Następnie woreczki należy rozmrozić w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C, w komorze z laminarnym przepływem powietrza.
Za pomocą sterylnych nożyczek przetnij i otwórz końcówkę każdego worka, a następnie przelej PHPL do probówek o pojemności 50 ml. Fragmenty płytek krwi często wykazują tendencję do agregacji i mogą również indukować alloimmunizację. Aby zapobiec tym zjawiskom, usuń fragmenty z PHPL poprzez wirowanie przy 4 000 GS przez 15 minut w wirówce chłodzącej.
Następnie przenieś pipetą nadsącz plazmy do końcowych probówek do przechowywania, a osady płytek krwi odrzuć, aby uniknąć obecności fragmentów w kulturach komórkowych. Zamroź alikwoty PHPL o objętości 50 ml ponownie w temperaturze -20 °C do czasu dalszego użycia. Po otrzymaniu PHPL pozbawionego fragmentów płytek krwi można przystąpić do analizy charakterystyki lizatu.
Funkcję i jakość puli lizatu platelets testuje się w hodowlach komórkowych, co potwierdza efektywna stymulacja proliferacji komórek, propagacja mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) oraz komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) przy użyciu PHPL pozbawionego fragmentów platelets. Przepisy na pożywki znajdują się w naszym protokole pisemnym tutaj. Dwa zastosowania puli ludzkiego lizatu platelets.
W hodowli mezenchymalnych komórek macierzystych pokazano MSC z pierwszego dawcy, które były hodowane w PHPL lub w PHPL pozbawionym fragmentów płytek krwi. Jak wskazano, widoczne jest tutaj większe zanieczyszczenie fragmentami w porównaniu do samego PHPL pozbawionego fragmentów. Fragmenty płytek krwi nie wspierają wzrostu MSC w stopniu wystarczającym.
Wszystkie trzy obrazy zostały wykonane po 13 dniach hodowli. MSC od drugiego dawcy były hodowane przez dziewięć dni w PHPL pozbawionym fragmentów płytek zamiast w osoczu bogatopłytkowym. Należy zauważyć, że PRP bez lizy płytek nie zapewnia wystarczającego wsparcia dla wzrostu MSC.
Prosimy również o zapoznanie się z protokołem JoVE opracowanym przez Andreasa Reisha, który opisuje zastosowanie PHPL pozbawionego fragmentów do izolacji i hodowli MSC pochodzących z krwi pępowinowej człowieka. Właśnie zaprezentowaliśmy, jak przygotować PHPL w celu całkowitego zastąpienia surowicy zwierzęcej w hodowlach komórek macierzystych. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o usunięciu fragmentów płytek krwi przed dodaniem heparyny i PHPL do pożywki hodowlanej.
To już wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w prowadzeniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy protokół szczegółowo opisuje przygotowanie lizatu płytek krwi człowieka (HPL) z osocza bogatopłytkowego (PRP). Proces obejmuje cykle zamrażania i rozmrażania w celu lizy płytek krwi i otrzymania lizatu o zredukowanej zawartości fragmentów płytek, bogatego w czynniki wzrostu do suplementacji hodowli komórkowych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Hodowla komórkowa
- Biologia płytek krwi
- Badania nad czynnikami wzrostu
Wstęp
- Ludzki lizat płytek krwi jest silnym suplementem stosowanym w hodowlach komórkowych.
- Zawiera on różne czynniki wzrostu, które są niezbędne dla proliferacji i różnicowania komórek.
- Proces przygotowania ma kluczowe znaczenie dla zapewnienia jakości i skuteczności lizatu.
- Osocze bogatopłytkowe służy jako materiał wyjściowy do przygotowania HPL.
Cel badania
- Zapewnienie szczegółowego protokołu przygotowania ludzkiego lizatu płytek krwi.
- Zapewnienie usunięcia fragmentów płytek w celu uzyskania czystszego lizatu.
- Ułatwienie zastosowania HPL w różnych aplikacjach hodowli komórkowych.
Zastosowane metody
- Wykorzystanie osocza bogatopłytkowego (PRP) jako materiału wyjściowego.
- Przeprowadzenie cykli zamrażania i rozmrażania w celu lizy płytek krwi.
- Przygotowanie puli ludzkiego lizatu płytek krwi (PHPL).
- Wirowanie w celu usunięcia fragmentów płytek krwi z supernatantu.
Główne wyniki
- Pomyślne przygotowanie dużej puli ludzkiego lizatu płytek krwi.
- Usunięcie fragmentów płytek krwi za pomocą wirowania.
- Uzyskanie około trzech litrów czynników wzrostu pochodzących z płytek krwi.
- Preparat odpowiedni do suplementacji hodowli komórkowych.
Wnioski
- Protokół zapewnia niezawodną metodę przygotowania ludzkiego lizatu płytek krwi.
- HPL może znacząco poprawić wyniki hodowli komórkowych.
- Dalsze badania mogą zgłębiać zastosowania HPL w różnych dziedzinach badawczych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie przemysłowe
Systemy hodowli wolne od surowic zwierzęcych są kluczowe dla rozwoju terapii komórkami macierzystymi w kierunku wdrożeń klinicznych i zgodności z wymogami regulacyjnymi. Niniejszy protokół umożliwia skalowalną produkcję ludzkiego lizatu płytek krwi (pHPL) jako zdefiniowanego, wolnego od składników ksenogenicznych suplementu, który wspiera proliferację mezenchymalnych komórek stropowych oraz propagację komórek endotelialnych tworzących kolonie. Poprzez standaryzację lizy płytek i usuwania fragmentów, metoda ta redukuje zmienność między partiami oraz zwiększa powtarzalność w początkowych etapach odkrywania leków i w badaniach przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesna faza odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Zapewnia zdefiniowany suplement pochodzenia ludzkiego, który wspiera badania mechanistyczne nad szlakami proliferacji i różnicowania komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia utrzymanie spójnych warunków hodowli w różnych eksperymentach, co zmniejsza zmienność w testach walidacji celów.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Zapewnia zestandaryzowane, bogate w czynniki wzrostu medium, które umożliwia uzyskanie wiarygodnych wyników w funkcjonalnych testach komórek macierzystych.
- Wartość operacyjna: Ułatwia standaryzację testów dzięki zastosowaniu lizatu pozbawionego fragmentów, co minimalizuje zakłócenia wywołane przez agregaty płytek krwi w platformach przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Wspiera ekspansję komórek macierzystych istotnych w badaniach nad chorobami w warunkach wolnych od komponentów pochodzenia zwierzęcego (xeno-free), co jest zgodne z wymogami dotyczącymi biomarkerów translacyjnych i modeli przedklinicznych.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalną produkcję z połączonych źródeł donatorskich, wspierając transfer technologii oraz rozwój procesów zgodnych ze standardami GMP.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta integruje się z kontinuum procesu odkrywania leków poprzez zapewnienie suplementu bezsurowiczego do hodowli komórek macierzystych – od wczesnej walidacji celu, aż po ekspansję przedkliniczną – wspierając identyfikację wiodących kandydatów oraz redukcję ryzyka mechanistycznego.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez dotyczących proliferacji i różnicowania komórek macierzystych poprzez zapewnienie spójnego, zdefiniowanego mikrośrodowiska.
- Przesiewanie: Umożliwia powtarzalne testowanie związków lub warunków w testach opartych na komórkach macierzystych dzięki zastosowaniu standaryzowanego lizatu z usuniętymi fragmentami.
- Analityka: Dostarcza mierzalnych wyników, takich jak tempo proliferacji komórek i wydajność jednostek tworzących kolonie, co umożliwia analizę porównawczą różnych warunków hodowli.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia z pracami przedklinicznymi, wspierając ekspansję mezenchymalnych komórek zrębowych oraz komórek progenitorowych śródbłonka w klinicznie istotnych warunkach wolnych od składników pochodzenia zwierzęcego.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Ustanawia wielokrotnego użytku, skalowalny proces wytwarzania suplementu klasy klinicznej z rutynowo pozyskiwanej osocza bogatopłytkowego, co zmniejsza zależność od zmiennych surowic zwierzęcych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną wyników hodowli komórek macierzystych poprzez eliminację nieokreślonych składników surowicy zwierzęcej i standaryzację dostarczania czynników wzrostu.
- Wartość operacyjna: Poprawia powtarzalność i skalowalność dzięki przetwarzaniu połączonych próbek od dawców oraz standaryzacji etapów zamrażania-rozmrażania i wirowania.
- Wartość strategiczna: Redukuje ryzyko biologiczne w rozwoju terapii komórkowych, zapewniając pochodzącą od ludzi, wolną od komponentów ksenogenicznych alternatywę dla płodowej surowicy bydlęcej.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, umożliwiając spójne generowanie danych przedklinicznych w zdefiniowanych systemach hodowli.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie sterylnych technik hodowli komórkowych, obchodzenia się z płytkami krwi oraz protokołów wirowania.
- Zależność od dostępu do osocza bogatopłytkowego z autoryzowanych banków krwi lub sługeń transfuzyjnych oraz sterylnego sprzętu do zgrzewania lub uszczelniania w celu manipulacji workami.
- Konieczność standaryzowanych testów sterylności wejściowego PRP i połączonego lizatu przed i po przetworzeniu w celu zapewnienia bezpieczeństwa hodowli.
- Wymaga adaptacji protokołów hodowlanych w celu uwzględnienia specyficznych dla danej partii stężeń czynników wzrostu, pomimo strategii łączenia próbek.
- Ograniczenie wynikające z konieczności przeprowadzenia wielu cykli zamrażania i rozmrażania oraz etapów wirowania, co wydłuża czas przetwarzania i wymaga specjalistycznego sprzętu.
