Wychwyt poprzez elongację starterów: celowane odzyskiwanie sekwencji z silnie zdegradowanych źródeł DNA

Niniejszy film wyjaśnia technikę PECA (primer extension capture), która umożliwia celowe wyodrębnianie sekwencji DNA z wysoce pofragmentowanych źródeł DNA o ekstremalnie niskiej liczbie kopii. Wykorzystaliśmy tę technikę do sekwencjonowania kompletnych genomów mitochondrialnych z kości neandertalczyków sprzed ponad 40 000 lat; metoda ta może być stosowana do przechwytywania dowolnych małych regionów docelowych lub polimorfizmów pojedynczego nukleotydu u wielu osobników. Główne etapy tej procedury to: amplifikacja PCR pierwotnej biblioteki DNA, ilościowe oznaczenie amplifikowanej biblioteki za pomocą ilościowego PCR (qPCR), docelowa elongacja primerów w amplifikowanej bibliotece, wychwyt produktów elongacji na kulekach w celu usunięcia fragmentów niedocelowych oraz elucja i sekwencjonowanie przechwyconych i przemytych celów.

Witajcie, jestem Adrian Briggs z laboratorium Shanti Payable w Zakładzie Genetyki w Instytucie Maxa Plancka ds. Antropologii Ewolucyjnej w Lipsku. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji specyficznych, interesujących sekwencji DNA ze złożonego, silnie zdegradowanego źródła DNA, takiego jak starożytne kości. Wykorzystaliśmy tę procedurę do badania mitochondrialnej różnorodności genetycznej Homo neanderthalensis, czyli człowieka neandertalczyka.

Zacznijmy. DNA wykorzystane w naszym eksperymencie pochodzi z kości neandertalczyków w wieku od 40 000 do 70 000 lat, które znaleziono w czterech miejscach w obrębie zasięgu geograficznego neandertalczyków. Najpierw kość jest poddawana działaniu światła UV przez całą noc, aby odkazić jej powierzchnię z wszelkich obcych cząsteczek DNA.

Do wytworzenia od 100 do 500 miligramów proszku kostnego używa się wiertła precyzyjnego. DNA jest ekstrahowane z proszku kostnego zgodnie z procedurą opisaną w artykule z 2007 roku pt. „Comparison and optimization of ancient DNA extraction” autorstwa Nadine Rockland i Michaela Hofa. Następnie ekstrakt DNA jest przekształcany w bibliotekę sekwencyjną poprzez dodanie uniwersalnych miejsc primowania adapterów do końców wszystkich fragmentów DNA, ponieważ biblioteka 4 5 4 wygenerowana z kości neandertalczyka zawiera jedynie śladowe ilości DNA, niekiedy zaledwie kilka pikogramów. Ta pierwotna biblioteka DNA jest najpierw amplyfikowana za pomocą PCR z wykorzystaniem primerów do emulsyjnego PCR odpowiadających uniwersalnym primerom bibliotecznym.

Aby przygotować mieszaninę PCR do amplifikacji biblioteki, połączyć następujące odczynniki w probówce do PCR: 10 µL buforu GAMP PCR 10 X, 2 µL chlorku magnezu, 2 µL BSA, 1 µL mieszaniny dNTP, po 3 µL starterów PCR forward i reverse 4 54, 1 µL polimerazy DNA amply gold oraz 25 µL matrycy biblioteki. Na koniec dodać 45 µL wody klasy PCR, aby uzyskać całkowitą objętość 100 µL. Polimeraza DNA amply gold jest stabilna w temperaturze pokojowej, więc praca na lodzie nie jest konieczna.

Po przygotowaniu reakcji PCR, umieść probówkę PCR w termocyklerze, rozpoczynając od etapu denaturacji w temperaturze 95°C przez 12 minut, a następnie przeprowadź 14 cykli: 95°C przez 30 sekund, 60°C przez jedną minutę oraz 72°C przez jedną minutę. Po zakończeniu tych 14 cykli ustaw końcowy etap w temperaturze 72°C przez pięć minut, po czym probówkę PCR można przechowywać w temperaturze 10°C do momentu rozpoczęcia dalszych prac po zakończeniu amplifikacji PCR. Następnie przeprowadź oczyszczanie produktu PCR przy użyciu kolumny wirowej Kyogen MinLu zgodnie z instrukcjami producenta, a DNA wypłucz z kolumny za pomocą 50 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu przed wstępną elongacją i wychwytywaniem produktu.

Ilościową PCR należy przeprowadzić na alikwotach bibliotek nieamplifikowanych i amplifikowanych w celu ilościowego określenia i sprawdzenia jakości produktu amplifikowanej biblioteki. Biblioteka amplifikowana w 14 cyklach powinna zawierać kilka tysięcy razy więcej DNA niż biblioteka pierwotna. Jeśli tak nie jest, należy sprawdzić i powtórzyć warunki amplifikacji.

Pierwotne primery przechwytujące do elongacji, które posłużą do wyodrębnienia interesujących sekwencji z amplifikowanej biblioteki, powinny zostać zaprojektowane jak standardowe primery PCR, tak aby odpowiadały pożądanemu regionowi docelowemu z optymalną temperaturą topnienia 60 °C na końcu 5' każdej z tych sekwencji docelowych, posiadały 12-nukleotydowy ogon oraz zawierały resztę biotyny na końcu 5'. W jednej mieszaninie multipleksowej przygotowanej z zapasów o stężeniu 200 µM można zastosować do 150 primerów PEC. W celu przeprowadzenia reakcji pierwotnej elongacji przygotować mieszaninę PCR w odpowiedniej probówce PCR, dodając 5 µL buforu GAMP PCR 10X, 2,5 µL chlorku magnezu, 1 µL BSA oraz 0,5 µL dNTP. Wymieszać 5 µL mieszaniny pierwotnych primerów przechwytujących do elongacji, 0,5 µL polimerazy Taq Gold, 2 µL DNA z biblioteki amplifikowanej w 14 cyklach, a na koniec 31 µL wody jakości PCR, aby uzyskać objętość końcową 50 µL.

Jeśli namnożona matryca biblioteki zawiera więcej niż 1×10¹² kopii na µL, należy ją najpierw rozcieńczyć buforem EB w taki sposób, aby do mieszaniny reakcyjnej dodano nie więcej niż 2×10¹² kopii. Po przygotowaniu probówki do PCR należy umieścić ją w termocyklerze i ustawić pojedynczy cykl reakcji. Proces rozpoczyna się od denaturacji przez 12 minut w 95 °C, następnie 60 °C przez jedną minutę, a następnie 72 °C przez pięć minut w celu pierwotnej elongacji.

Po zakończeniu pojedynczego cyklu, temperaturę 72 °C utrzymuje się, aby zachować produkt PCR do następnego etapu. Aby uniknąć niespecyficznego przyłączania starterów, należy bezpośrednio pipetować 150 µL buforu PBI lub PB z zestawu do oczyszczania Kyogen do probówek z reakcją PCR, podczas gdy mieszanina reakcyjna pozostaje w termocyklerze w temperaturze 72 °C. Takie postępowanie dezaktywuje polimerazę, a temperatura jest zbyt wysoka dla niespecyficznej elongacji starterów docelowych; należy zamknąć probówki, krótko wymieszać w wstrząsaczu Vortex, a następnie odwirować ciecz w wirówce laboratoryjnej.

W tym kroku należy stosować wyłącznie bufor PBI lub PB, ponieważ inne bufory wiążące, takie jak bufor PM firmy Qiagen, mogą zakłócać późniejszy proces wychwytu. Następnie należy wyjąć mieszaninę z probówki do PCR i przenieść ją do kolumny wirowej Rogen MinLu w celu oczyszczenia zgodnie z instrukcjami producenta, tak jak zrobiono to wcześniej, a następnie eluować DNA z kolumny za pomocą 30 µL buforu EB dostarczonego w zestawie MinLu. Aby usunąć wszystkie fragmenty, które nie przyłączyły się do starterów PEC, przeprowadza się etap wychwytu z użyciem kulek magnetycznych.

Najpierw resuspender roztwór zapasu kulek M 270 strip divide poprzez wirowanie w wortexie i pobrać ilość kulek odpowiadającą 25 µL na próbkę. Przemyć kulki dwukrotnie 500 µL dwukrotnego buforu BW i resuspender w objętości dwukrotnego buforu BW równej objętości pierwotnie pobranych kulek. Przygotować 25 µL zawiesiny.

Do każdej próbki dodaj 25 µL oczyszczonego eluowanego DNA do 25 µL zawiesiny kulek, zachowując pozostałe 5 µL do późniejszej kwantyfikacji. Wymieszaj DNA i zawiesinę kulek poprzez pipetowanie w górę i w dół oraz mieszanie końcówką pipety, a następnie inkubuj w powolnym obrocie na rotatorze laboratoryjnym przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Po wymieszaniu przenieś zawartość do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.

Podczas poprzedniego etapu inkubacji z rotacją część niecelowego DNA mogła przykleić się do ścianki probówki. Przeniesienie zawiesiny kulek do nowej probówki pozwala uniknąć możliwości uwolnienia tego niecelowego DNA do produktów końcowych. Podczas etapu elucji termicznej, używając magnetycznego kolektora cząstek do pelletowania kulek, po 10 do 20 sekundach wszystkie kulki przemieścą się do ścianki, pozostawiając klarowny supernatant, który należy usunąć w celu przemycia kulek; należy dodać do probówki 500 µL buforu 1× BW i mieszać w wortexie przez około trzy sekundy przy niskiej prędkości.

Zarówno przy pozycji pionowej, jak i odwróconej probówki, żadne kuleczki nie powinny pozostać przyklejone do jej ścianek. Używając wirówki stołowej, odwiruj zawiesinę przez jedną do trzech sekund, wystarczająco długo, aby ściągnąć cały płyn ze ścianek probówki. Włóż probówkę z powrotem do MPC i odczekaj od 10 do 20 sekund, aż wszystkie kuleczki zbiorą się przy ściance probówki.

Następnie usuń nadsącz z SUP. Pierwsze płukanie jest teraz zakończone. Powtórz tę procedurę jeszcze cztery razy, po ostatnim jednokrotnym płukaniu BW i usunięciu nadsączu.

Dodaj 500 µL buforu do gorącego przemywania (1×). Wymieszaj zawiesinę, krótko wirując w wortexie i odwirowując tak jak poprzednio, a następnie inkubuj probówkę przez dwie minuty w temperaturze 65 °C na termicznym shakerze blokowym przy 1000 RPM; po zdjęciu z bloku termicznego w ciągu jednej minuty krótko odwiruj, aby usunąć pozostałości supernatantu. Ten etap pozwoli na usunięcie fragmentów, które mogły wiązać się z primerami PEC, ale nie zostały przedłużone w etapie elongacji primerów; zawiesić osad w 30 µL buforu EB i przenieść mieszaninę do nowej probówki PCR o pojemności 1,5 ml.

Inkubuj probówkę w termocyklerze w temperaturze 95°C przez trzy minuty. Osadź kuleczki w kolektorze cząstek magnetycznych. Proces całkowitego oczyszczenia nadsączu powinien zająć od 10 do 20 sekund; następnie przenieś nadsącz S do nowej, opisanej probówki.

Należy uważać, aby nie przenieść żadnych kulek. Zachować nadfiltr zawierający wyizolowany produkt fragmentów DNA. Kuleczki można na tym etapie odrzucić.

Aby namnożyć wychwycony produkt, przygotować mieszaninę PCR do całkowitej objętości 100 µL w sposób opisany w części drugiej i zastosować te same warunki cykliczności PCR. Ponownie, po zakończeniu amplifikacji PCR produktu, przeprowadzić oczyszczanie przy użyciu kolumny wirowej Qiagen Ute, tak jak zrobiono to wcześniej w sekcji drugiej; eluować DNA z kolumny za pomocą 50 µL buforu Eeb. Produkt jest teraz gotowy do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Zaprojektowaliśmy 574 primery PEC, aby pokryły one cały genom mitochondrialny neandertalczyka.

Podzieliliśmy je na cztery mieszaniny multipleksowe i przeprowadziliśmy dwie seryjne rundy wychwytu poprzez pierwotną elongację (PEC) w bibliotekach z pięciu skamieniałości neandertalczyka z czterech stanowisk w całej Eurazji, datowanych na okres od 40 000 do 70 000 lat, generując od 170 000 do 500 000 sekwencji na osobnik i dopasowując wyniki do mitochondrialnej sekwencji referencyjnej. Stwierdziliśmy, że procedura PEC doprowadziła do znacznego wzbogacenia mtDNA, osiągając pełne pokrycie mitochondrialnego DNA dla każdego osobnika przy średnim pokryciu od 18 do 56,3 krotności. Dzięki tym wynikom mogliśmy wygenerować wysokiej jakości pełną sekwencję genomu mitochondrialnego dla każdego osobnika.

Następnie przeprowadziliśmy porównanie filogenetyczne tych sekwencji z globalną próbką współczesnych ludzi oraz naszych najbliższych żyjących krewnych, szympansa i bonobo. Potwierdziło to wcześniejsze ustalenia, że mitochondrialne DNA neandertalczyków jest blisko spokrewnione, ale wyraźnie odmienne od mitochondrialnego DNA współczesnych ludzi. Co więcej, porównanie samych sekwencji neandertalskich ujawniło niezwykle niską różnorodność genetyczną neandertalczyków – niższą niż obecnie wśród ludzi na całym świecie i podobną do tej u współczesnych Europejczyków.

Dowody te, w połączeniu z analizą ewolucji białek w sekwencjach neandertalczyków, sugerują, że neandertalczycy charakteryzowali się długoterminowo niewielką liczebnością populacji, co jest zgodne z dowodami archeologicznymi wskazującymi, że gęstość zaludnienia neandertalczyków nigdy nie osiągnęła poziomów odnotowanych u ludzi współczesnych. Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić przechwytywanie rozszerzeń naczelnych w celu amplifikacji i wyodrębnienia sekwencji docelowych w przygotowaniu do sekwencjonowania wysokoprzepustowego. Podczas stosowania tej procedury ważne jest przestrzeganie wszystkich specyfikacji temperatury w termocyklerze, jednak należy pamiętać, że primery mogą mieć różne temperatury topnienia, dlatego może być konieczne dostosowanie temperatury topnienia do konkretnych primerów oraz zachowanie szczególnej ostrożności podczas wszystkich etapów płukania, aby usunąć jak największą ilość cieczy.

Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.