Enkapsulacja komórkowa w trójwymiarowych hydrożelach w inżynierii tkankowej

Krok po kroku proces enkapsulacji komórek rozpoczyna się od przygotowania i sterylizacji form do hydrożelu oraz innych materiałów, a następnie od izolacji komórek do poszczególnych populacji w probówkach dla każdego zestawu żelu. Następnie przeprowadza się żelowanie w obecności komórek, po czym następuje okres inkubacji in vitro lub in vivo. Dalsza analiza zachowania komórek może obejmować testy żywotności, morfologii, proliferacji i różnicowania.

Witam, jestem Amidio Kahan z laboratorium dr. Jasona Burdicka w Katedrze Bioinżynierii na Uniwersytecie Pensylwanii. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę enkapsulacji komórek w trójwymiarowych hydrożelach do inżynierii tkankowej. Procedury tej używamy do badania wpływu składu i struktury hydrożelu na zachowanie enkapsulowanych komórek.

Zacznijmy zatem. Aby rozpocząć tę procedurę, należy przygotować 0,5% wagowy roztwór fotoinicjatora air cure 2 9 5 9 lub I 2 9 5 9 w PBS. Wymieszać i inkubować przez dwa do trzech dni w ciemności w temperaturze 37 °C.

Po przygotowaniu należy użyć filtra strzykawkowego, aby wysterylizować roztwór, a następnie przechowywać go w temperaturze pokojowej. Następnie należy użyć programu arkusza kalkulacyjnego, takiego jak Microsoft Excel, aby obliczyć wykazaną potrzebną ilość polimeru i sieciującego. Oto kwas hialuronowy funkcjonalizowany reaktywnymi grupami akrylowymi.

Należy również obliczyć ilość peptydu zawieszonego zawierającego funkcjonalną domenę adhezyjną z aminokwasami cysteiną, argininą, glicyną i asparaginianem. Cysteina służy do przywiązania do polimeru. Po wyznaczeniu wymaganych ilości sieciującego polimeru oraz peptydu, należy je odważyć i umieścić każdy z nich w osobnej probówce typu Eppendorf.

Odpowiednio dostosuj arkusz kalkulacyjny. W celu określenia rzeczywistej masy otrzymanego polimeru przejdź do sekcji Przygotowanie form żelowych. Użyj żyletki, aby odciąć końcówki pojedynczo zapakowanych sterylnych.

Jednorazowe strzykawki o pojemności 1 ml. Należy upewnić się, że wykonano płaskie cięcie w celu przygotowania form, które będą wykorzystane do przenoszenia wzorów fotograficznych na żele. Na koniec należy wysterylizować formy ze strzykawek, probówki EOR z otwartymi zakrętkami oraz wszelkie inne niezbędne materiały, umieszczając je pod wbudowanym w komorę z laminarnym przepływem powietrza źródłem światła bakteriobójczego przez 30 minut.

Po zakończeniu sterylizacji należy przystąpić do przygotowania komórek, po uprzedniej sterylizacji sprzętu eksperymentalnego. Pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy dodać sterylny TEA do polimeru stosowanego w sieciowaniu typu mical oraz sterylny PBS do polimeru stosowanego w sieciowaniu wolnorodnikowym. NADAĆ pasujący bufor do probówek z grupami bocznymi i wymieszać w wibratorze Vortex.

Aby rozpuścić grupę boczną, należy związać ją z alkilowanym kwasem hialuronowym za pomocą grupy tiolowej z grupy INE w peptydzie, co pozwoli przyłączyć grupę boczną do polimeru; należy dodać ją do roztworu polimeru i szczelnie zamknąć. Następnie krótko wymieszać w wstrząsarze wortexowym i inkubować w temperaturze 37 °C przy ciągłym mieszaniu. W czasie, gdy grupa boczna jest przyłączana, należy przygotować komórki do enkapsulacji – mogą to być ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (hMSCs) – poprzez przemycie ich PBS.

Następnie inkubować z trypsyną przez jedną minutę w temperaturze pokojowej, usunąć trypsynę i inkubować przez kolejne pięć minut w 37°C. Następnie dodać pożywkę do wzrostu HMSC, aby zneutralizować trypsynę i odczepić komórki z powierzchni płytki. Policzyć komórki za pomocą hematocytometru.

Rozdziel policzone komórki na porcje zawierające odpowiednią liczbę dla każdego zestawu żeli. Dla zestawu trzech żeli o objętości 50 µL przy gęstości 10 milionów komórek na mL, odseparuj 1,5 miliona komórek do oddzielnej probówki stożkowej. Nie przygotowuj więcej niż czterech żeli w jednym zestawie ze względu na czas trwania procesu.

Następnie odwiruj komórki z prędkością 500 RCF przez sześć minut. W temperaturze pokojowej, podczas wirowania komórek, przygotuj mieszaninę polimeryzacyjną do sieciowania metodą mical edition. Dodaj bufor do sieciującego, aby uzyskać odpowiednie stężenie.

W celu przeprowadzenia fotopolimeryzacji rodnikowej dodaj wcześniej przygotowany roztwór I 2 9 5 9 do roztworu polimeru. Dodaj go w ilości stanowiącej 10% całkowitej objętości żelu, aby uzyskać końcowe stężenie inicjatora na poziomie 0,05% masy. W ten sposób komórki oraz mieszanina polimeryzacyjna są gotowe do enkapsulacji w hydrożelu.

Zacznij od odessania naddatku z wirowanych komórek. Odczekaj, aż ciecz opadnie po wstępnym odessaniu, a następnie odessaj ponownie, aby usunąć jak największą ilość pożywki, nie naruszając osadu komórkowego. Resuspenduj osad komórkowy w roztworze polimeru, aby zapobiec powstawaniu pęcherzyków powietrza.

Powoli pipetuj roztwór w górę i w dół około 10 razy, co powinno wystarczyć do równomiernego rozprzestrzenienia komórek. W przypadku reakcji addycji typu mical, użyj końcówki do pipety z szerokim otworem, aby dodać odpowiednią objętość roztworu sieciującego do komórki polimerowej. Wymieszaj. Ustaw pipetę na pożądaną objętość pojedynczego żelu.

Pipetuj roztwór w górę i w dół w celu homogenizacji, a następnie wprowadź go do form w końcówkach strzykawkowych. Wykonaj ten krok szybko, aby zapewnić równomierne rozłożenie komórek, i inkubuj przez 10 do 30 minut w komorze laminarnej w celu sieciowania. W przypadku sieciowania rodnikowego inicjowanego światłem.

Przenieś odpowiednią objętość do form w postaci końcówek strzykawki. Naświetlaj strzykawki światłem UV w celu sieciowania rodnikowego przez 10 minut przy długości fali 365 nanometrów. Dla polimerów funkcjonalizowanych ACRL powszechnie stosuje się światło UV o natężeniu 4 miliwatów na centymetr kwadratowy.

Należy wykonać ten krok szybko, aby zminimalizować osiadanie komórek przed ekspozycją na światło UV. Po sieciowaniu należy zanurzyć żele w dołkach płytki do hodowli tkankowej zawierających pożywkę do inkubacji i analizy. Sieciowanie hydrożelu można również przeprowadzać sekwencyjnie.

Najpierw dodaj funkcjonalizowany barwnik, metylowaną ruminę, do stężenia końcowego 20 nanomolar w żelu. Barwnik pomaga w wizualizacji wzoru, ponieważ wbudowuje się preferencyjnie w obszary żelu o radykalnym sieciowaniu. Następnie rozpocznij reakcję polimeryzacji typu mic, która daje ułamek teoretycznych wiązań sieciujących dla następujących etapów.

W przypadku sieciowania rodnikowego należy użyć maski zaprojektowanej w programie takim jak Adobe Photoshop lub Illustrator i wydrukowanej bezpośrednio na folii transparentnej. Wymiary maski muszą być dopasowane do okrągłej górnej części strzykawki. Za pomocą wysterylizowanej pęsety należy nałożyć sterylną maskę bezpośrednio na powierzchnię żelu, a następnie naświetlić go w celu przeprowadzenia sieciowania żelu.

Poniżej przedstawiono HMC w hydrożelach na bazie HA godzinę po enkapsulacji. Ponieważ syntetyzowane hydrożele są zazwyczaj przezroczyste, morfologię komórek można wizualizować za pomocą mikroskopii świetlnej. Te same komórki poddano ocenie żywotności 24 godziny po enkapsulacji, wykorzystując fluorescencyjny zestaw do barwienia komórek żywych i martwych.

Do detekcji żywych komórek wykorzystaliśmy calcium M, a do martwych komórek atherium homodimer, obserwując żywotność przekraczającą 95%. Użyliśmy również testu alamar blue w celu określenia poziomu proliferacji komórek, mierzonego na podstawie stopnia metabolizowania odczynnika testowego przez komórki, co skutkuje zmianą barwy. Barwienie komórek przeprowadzono na H HMCs siedem dni po enkapsulacji w degradowalnym i adhezyjnym hydrożelu na bazie HA, stosując standardowe procedury fiksacji i permeabilizacji.

Aktyna komórkowa jest widoczna przy użyciu phalloidyny znakowanej fluoresceiną, a jądra komórkowe wybarwiono DAPI. Immunobarwienie przeciwko kulinie stosuje się do wizualizacji adhezji ogniskowych w obrębie macierzy hydrożelowej. Barwienie histologiczne wykonuje się po odwodnieniu, zatopieniu w parafinie i cięciu hydrożeli zgodnie ze standardowymi protokołami w przypadku polimeryzowanych radykalnie hydrożeli HA zawierających enkapsulowane HMSC.

Po jednym tygodniu hodowli wykonano barwienie hematoksyliną w celu zaznaczenia jąder komórkowych oraz ASIN w celu zaznaczenia tkanki łącznej A, a barwniki niebieskie zastosowano do wybarwienia glikozaminoglikanów. Do ilościowego oznaczenia różnicowania enkapsulowanych komórek macierzystych wykorzystano Realtime PCR. Po odjęciu tła poziom ekspresji badanego genu określa się na podstawie liczby cykli, w których osiągnięto próg fluorescencji, w porównaniu z pasywnym sygnałem referencyjnym, którym jest konstytutywnie aktywny gen housekeepingowy. W ten sposób zaprezentowaliśmy metodę enkapsulacji komórek w hydrożelach 3D oraz badanie zachowania komórek w żelach.

Podczas stosowania tych procedur ważne jest zapewnienie pełnej sterylności materiałów, zarówno poprzez długoterminowe przechowywanie sterylnych roztworów buforowych i odczynników, jak i sterylizację za pomocą bakteriobójczej lampy UV. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.