Inżynieria białek przenikających przez błony komórkowe

W ciągu ostatnich 15 lat manipulowanie funkcjami komórkowymi było możliwe dzięki klasycznym podejściom, takim jak transfekcja DNA lub transdukcja wirusowa. Wyewoluowała jednak kolejna metoda. Transdukcja białek pozwala na bezpośrednie dostarczenie biologicznie aktywnego białka do komórek ssaków przy użyciu małych peptydów połączonych z białkiem docelowym, co sprzyja jego pobraniu przez komórkę.

Ponieważ nie wykorzystuje się DNA, zapobiega się ryzyku agenezy wywołanej przez czynnik zewnętrzny. W przeciwieństwie do wspomnianych wyżej metod klasycznych, transdukcja białek umożliwia dostarczanie białek w sposób mierzalny.

Ponadto można modulować małe populacje komórek, jak i komórki niedzielące się, takie jak neurony pomitotyczne. W celu wydajnej ekspresji białka rekombinowanego zalecamy zastosowanie systemu wektorowego Paciz. Jest to modularny system wektorowy składający się z wariantu N-końcowego i C-końcowego.

Oba wektory umożliwiają łatwą insercję genu zainteresowania w celu oczyszczania białka. Zintegrowano w nich znacznik histydynowy oraz domenę transdukcji białek. W naszym przypadku jest to domena z wirusa HIV, która wspomaga pobieranie komórkowe w celu dystrybucji wewnątrzkomórkowej.

Sygnał lokalizacji jądrowej dopełnia wektor; ze względów kontrolnych tagi fuzyjne można po prostu usunąć. Ponadto układ tych tagów może mieć istotny wpływ na właściwości białek fuzyjnych. Wpływ na wydajność i czystość, a także na rozpuszczalność i funkcję biologiczną, nie jest przewidywalny.

Witajcie, nazywam się Bernard Mus i pracuję w grupie Inżynierii Komórek Macierzystych w Instytucie Neurobiologii Rekonstrukcyjnej w Bonn, w Niemczech. Cześć, nazywam się Christoph P i również jestem członkiem laboratorium Hoovera. Nasza grupa badawcza intensywnie wykorzystuje technikę transdukcji białek do bezpośredniego wprowadzania biologicznie aktywnych białek do różnych komórek ssaków, a dzisiaj chcemy przeprowadzić Was przez proces ekspresji i oczyszczania białek w bakteriach e coli oraz z nich.

Następnie chcielibyśmy pokazać, jak zastosować stałe białko fuzyjne w hodowli komórkowej, aby zilustrować całą procedurę: ekspresję, oczyszczanie i zastosowanie. Wykorzystujemy miejsce-specyficzną rekombinację Cree do modyfikacji genetycznej mysich komórek macierzystych onic. Dobrze. Zaczynajmy.

Aby zaszczepić hodowlę nocną, wykorzystujemy uprzednio przekształcone bakterie przechowywane w zamrażarce z glicerolem w temperaturze -80°C. Bakterie te zawierają już wektor kodujący dla rekombinacji. Za pomocą końcówki pipety pobieramy niewielką ilość bakterii i przenosimy ją do naczynia zawierającego pożywkę do hodowli nocnej.

Kultura nocna składa się z pożywki LB uzupełnionej glukozą do stężenia końcowego 0.5% oraz 50 µg insuliny carbonic na ml. Zlewkę umieszczono następnie w inkubatorze w temperaturze 37 °C w celu ekspresji specyficznej dla miejsca rekombinazy Cree. Do kultury ekspresyjnej w dużej skali stosujemy podgrzaną wcześniej pożywkę TB.

Aby przyspieszyć ekspresję, zaleca się stosowanie pożywki TB ogrzanej do 37 °C, co odpowiada temperaturze podczas ekspresji rekombinowanego białka. Następnie do pożywki TB dodajemy glukozę do stężenia końcowego 0,5%. Glukoza zapobiega zwiększonej ekspresji podstawowej białka fuzyjnego podczas wzrostu kultury ekspresyjnej przed indukcją. Na koniec do kultury ekspresyjnej dodaje się ampicylinę do stężenia końcowego 100 µg/ml, aby zapewnić czystość kultury zawierającej wyłącznie bakterie, które nadal posiadają plazmid kodujący białko.

Możemy teraz pobrać kulturę nocną i zaszczepić kulturę ekspresyjną w stosunku 1:50. Zlewki zostają następnie przeniesione do inkubatora ustawionego na temperaturę 37 °C. Należy regularnie pobierać próbki w celu pomiaru gęstości optycznej w trakcie procesu ekspresji.

Gdy tylko kultura osiągnie gęstość optyczną 1,5, bakterie poddaje się indukcji końcową stężeniem 0,5 millimolar IPTG. Po jednej godzinie indukcji kulturę ekspresyjną przenosi się do probówek, a następnie zbiera za pomocą wirowania. W tym celu używamy rotora SLA 3000.

Wirówkę ustawiono na prędkość 5 000 obr./min na 10 minut w temperaturze 4°C. Następnie odrzuca się nadsącz, a osad bakteryjny można przechowywać w nieskończoność w temperaturze -20°C. Zamrożone osady resuspendsuje się w buforze Lizza, stosując objętość odpowiadającą jednemu litrowi hodowli ekspresyjnej.

Używamy 10 ml buforu Lizza i czekamy około 15 minut, aż roztwór stanie się jednorodny. Następnie do każdego ml zawiesiny dodaje się jeden miligram lizozymu. Roztwór miesza się przez 20 minut, aby umożliwić enzymowi rozbicie bakterii.

Następnie dodaje się Benzonase w rozcieńczeniu 1:1000 na kolejne 15 minut, co spowoduje rozcięcie DNA i uzyskanie roztworu o niskiej lepkości. Na koniec używa się sonikatora, aby zapewnić lizę komórek. Program jest uruchamiany na jedną i pół minuty przy mocy 45% po zakończeniu certyfikacji.

Należy pamiętać o pobraniu próbki na każdym etapie, w postaci surowego lizatu lub do analizy SDS-PAGE procesu oczyszczania. Bardzo ważne jest teraz dodanie 1 ml lodowatego buforu TSB na każdy 1 mL zawiesiny, ponieważ białko w formie zdenaturowanej może mieć tendencję do wytrącania się w zapasach z glicerolem. Jeśli ten krok zostanie pominięty, roztwór należy krótko wymieszać, po czym surowy lizat jest gotowy do wirowania.

W tym celu wykorzystujemy rotor SS 34. Wirówka pracuje z prędkością 17 000 RPM przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po zakończeniu wirowania supernatant ostrożnie przeniesiono do nowych probówek Falcon o pojemności 50 ml.

Następnie do supernatantu należy dodać zawiesinę niklową Anti A. Anti A jest kluczowym odczynnikiem dla prawidłowego oczyszczania białek fuzyjnych z tagiem histydynowym. Histydyna tworzy kompleks z jonami niklu, co umożliwia oczyszczanie powinowactwa; teraz delikatnie wstrząsaj probówkami przez 60 minut w temperaturze 40 °C.

Po upływie jednej godziny można nanieść zawiesinę na kolumny 20 ML i pozwolić roztworowi przepłynąć siłami grawitacji. W przypadku produkcji na dużą skalę możliwe jest rozdzielenie zawiesiny na kilka kolumn. Następnie kolumnę przemywamy dwukrotnie buforem zawierającym 15 millimolar innersole.

Ilość naniesionego buforu zależy od objętości żywicy. Dwa ml niklu NTA odpowiadają jednemu ml żywicy w celu płukania. Po płukaniu nakładamy na kolumnę pięciokrotność objętości żywicy w buforze płuczącym, po czym jesteśmy gotowi do elucji białka.

W związku z tym stosujemy bufor elucyjny o stężeniu 250 milimolarnożowym immuno. Zauważcie, jak kolor żywicy zmienia się na zielony. Ze względu na wysokie stężenia białka CRE, frakcja OID czasami staje się mętna.

Aby temu zapobiec, wymieszaj roztwór i dodaj dodatkowy bufor lizujący; wszystkie frakcje są teraz łączone, a następnie przenoszone do probówki do lizy. Liza usunie ole; pierwszy etap dializy jest przeprowadzany przeciwko buforowi zawierającemu wysoką koncentrację soli. Po jednej godzinie bufor z wysoką zawartością soli zostaje wymieniony, a procedura dializy jest stosowana przez noc.

Następnego dnia rurkę do dializy wyjmuje się z buforu o wysokim stężeniu soli i przenosi do buforu glicerolowego. Po trzech do pięciu godzinach bufor glicerolowy zostaje wymieniony i dializę przeprowadza się ponownie przez noc. Lizę w buforze glicerolowym uzyskamy w formie roztworu zapasu o co najmniej trzykrotnie zwiększonym stężeniu.

Roztwór zapasowy można teraz przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka lat bez utraty aktywności. W celu zapewnienia kontroli jakości można nałożyć zebrane próbki do elektroforezy SDS-PAGE na żel, a następnie go zabarwić. W przypadku białka fuzyjnego Cree, jest ono wykrywalne jako wyraźny prążek w frakcji OID. Aby zastosować odpowiednie stężenie rekombinowanego białka Cree, należy określić jego stężenie za pomocą testu Redforda.

Sposób wprowadzania trwałych białek do komórek ssaków. Przede wszystkim należy przygotować komórki docelowe, aby uzyskać najwyższą wydajność transdukcji białek. W przypadku komórek rosnących w formie zwartych kolonii, należy zasiać komórki w monowarstwie w gęstości, która zapewni 80 do 90% konfluencji warstwy komórkowej w dniu następnym.

Oddziel komórki w sposób somatyczny i przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek na pięć godzin przed badaniem. Przygotowanie zawiesiny pojedynczych komórek przed transdukcją białka jest istotne, ponieważ w przeciwnym razie przetransdukowane zostaną jedynie komórki znajdujące się na powierzchni kolonii. Odessij medium i krótko obejrzyj komórki przy użyciu PPS przed rozpoczęciem obróbki.

Usunąć pozostałe medium wzrostowe zawierające serum. Po odessaniu nakładki PPS opłukać komórki i pozostawić je do inkubacji przez trzy do pięciu minut. Następnie sprawdzić pod mikroskopem, czy wszystkie kolonie zostały rozdzielone na pojedyncze komórki.

Z powyższych powodów jest to kluczowy etap transdukcji białek do komórek drożdży. Przenieść oderwane komórki do probówki. Umieścić probówkę w wirówce i odwirować komórki, odessać nadsącz i resuspenderć komórki.

W medium wzrostowym rozcieńczyć komórki do odpowiedniej liczby. Zależy to oczywiście od wielkości naczynia do hodowli tkankowej. Inkubować komórki w szalce przez dodatkowe pięć godzin.

Zapewni to komórkom powietrznym wystarczająco dużo czasu na przytwierdzenie się do dna i wzrost adherentny. Zapasy z trzech rzędów klas można przechowywać w temperaturze -20 °C przez ponad dwa lata. Podczas pracy z rekombinowanym stałym białkiem fuzyjnym komórek, posiadanie takiego roztworu zapasu, który można wykorzystać na żądanie, jest bardzo korzystne.

Podczas oczekiwania na przytwierdzenie komórek do naczynia, można przygotować medium do transdukcji, po prostu rozcieńczając odpowiednią objętość roztoku białka z zapasów w odpowiednim medium. Ponieważ roztwór zapasowy nie jest jeszcze sterylny, medium do transdukcji musi zostać poddane filtracji sterylizującej przed zastosowaniem. Zalecamy użycie strzykawki, którą można przykręcić do filtra wiążącego białka.

Końcowe stężenie kompleksów creek zależy od typu komórek lub dodatków do pożywki. Na przykład surowica wywiera silny negatywny wpływ na wydajność transdukcji. Można temu przeciwdziałać, stosując pożywki bezsurowicze lub zwiększając stężenie kompleksów creek.

Wyznaczamy optymalne warunki zapewniające najwyższą wydajność rekombinacji. Stężenia hydratu dobieramy w zakresie od 0,5 do 10 µM. Zalecamy przetestowanie różnych czasów inkubacji od 6 do 18 godzin.

Po pięciu godzinach inkubacji wyjmij komórki docelowe i odessij medium transferowe. Następnie zastąp je medium do transdukcji białek i umieść komórki z powrotem w inkubatorze na noc. Następnie krótko przemyj komórki przy użyciu PPS i zmień medium do transdukcji białek na zwykłe medium ES.

48 godzin po inkubacji komórek można wykryć trwałą ekspresję genu Cre za pomocą XUL. Barwienie komórek z pozytywnym fenotypem beta świadczy o pomyślnym poddaniu ich inżynierii genetycznej poprzez rekombinację specyficzną dla miejsca. Raport Cre.

Komórki zawierają konstrukt Lae wykorzystujący CRE po rekombinacji zapośredniczonej przez pre. Wycięta zostaje sekwencja stop flankowana przez lock P, co aktywuje gen reporterowy luxe sterowany przez promotor team. Aby ocenić wydajność rekombinacji w uprzednio traktowanych komórkach reporterowych air, komórki muszą zostać utrwalone.

Odssać medium, przemyć komórki dwukrotnie PBS, pokryć komórki 4% PFA i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przemyć komórki ponownie trzykrotnie PBS. Po odsaniu PBS z ostatniego etapu mycia, dodać do dołków roztwór barwiący Xal i inkubować komórki przez noc w temperaturze 37 stopni w inkubatorze.

Następnego dnia aktywność Beal można monitorować poprzez obecność niebieskich komórek. Wydajność rekombinacji można określić na podstawie liczby niebieskich kolonii. W optymalnych warunkach powinni Państwo być w stanie osiągnąć wydajność rekombinacji powyżej 90%. W dzisiejszym materiale pokazaliśmy, jak ekskresjonować i oczyszczać specyficzną dla miejsca rekombinazę query z E. coli.

W niniejszym badaniu dowodowym udało nam się zindukować rekombinację w większości soli. To wszystko. Powodzenia w Państwa eksperymentach.