Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotobieleniu
26 lutego 2010
W niniejszym artykule opiszemy procedurę pomiaru współczynników dyfuzji z wykorzystaniem wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Rozpoczniemy od ustawienia lasera wzdłuż drogi optycznej do próbki i określenia odpowiednich parametrów eksperymentalnych, a następnie przejdziemy do generowania i wreszcie dopasowywania krzywych odzyskiwania fluorescencji.
Procedurę wielofotonowej fluorescencji i powrotu po fotobleachingu można łatwo zademonstrować na próbce swobodnie dyfundujących cząsteczek barwnika fluorescencyjnego. Najpierw do próbki kierowana jest wiązka lasera o niskim natężeniu, aby wygenerować referencyjny poziom fluorescencji cząsteczek D w objętości ogniskowej lasera.
Następnie wysyłany jest krótki, wysokointensywny błysk lasera w celu fotowybielenia części cząsteczek barwnika w objętości ogniskowej. Na koniec wiązkę lasera osłabia się do poprzedniego poziomu niskiej intensywności i monitoruje fluorescencję w miarę jak fotowybielone cząsteczki dyfundują na zewnątrz i są zastępowane przez wciąż fluorescencyjne cząsteczki spoza objętości ogniskowej. Powstała krzywa fluorescencji w funkcji czasu jest analizowana w celu wyznaczenia współczynnika dyfuzji.
Witajcie, nazywam się Kelly Sullivan i reprezentuję laboratorium Edwarda Browna w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie w Rochester. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak przeprowadzić wielofotonową analizę powrotu fluorescencji po fotobleachingu. Technikę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania dyfuzji w biologicznych systemach in vitro oraz in vivo.
Zacznijmy. Na początek ustaw pożądaną długość fali lasera i umieść odpowiedni filtr przed photomultiplier tube lub PMT. Następnie, aby uniknąć uszkodzenia komórki pcal, dostosuj moc lasera do 200 milliwatts lub mniej.
Przed komórką pcal znajdują się dwa lustra ustawione w konfiguracji cyfry cztery. Lustra te są niezbędne i wystarczające do wyrównania wiązki lasera przechodzącej przez komórkę pcal. Ustaw przesunięcie napięcia w kontrolerze polaryzacji komórki pcal na zero, a następnie dostosuj tor wiązki lasera tak, aby laser był wycentrowany względem przedniego i tylnego okna komórki pcal.
Użyj lustra znajdującego się przed układem w konfiguracji „czwórki” (figure four), aby wycentrować wiązkę w przednim oknie, oraz lustra znajdującego się za układem, aby wycentrować wiązkę w tylnym oknie. Następnie ustaw napięcie przyłożone do kryształu ogniwa pcal na wartość maksymalną. Odpowiednia wartość zależy od długości fali i znajduje się w instrukcji obsługi ogniwa pcal.
Ustaw lustra przedstawione na rysunku cztery, znajdujące się przed ogniwem pcal, tak aby zmaksymalizować moc wyjściową z ogniwa pcal. Następnie zredukuj napięcie przyłożone do kryształu do zera i dostrój przesunięcie napięcia (voltage offset) w kontrolerze polaryzacji, aby zminimalizować moc wyjściową z ogniwa pcal. Przywróć moc lasera padającą na ogniwo pcal do wartości wymaganej dla danego eksperymentu.
Przechodząc teraz do mikroskopu, należy precyzyjnie ustawić ostrość obrazu na ustandaryzowanej próbce fluorescencyjnej. W tym przypadku wykorzystujemy utrwalone fluorescencyjne ziarna pyłku. Po ustawieniu ostrości należy zamknąć obudowę mikroskopu i dostosować moc lasera do poziomu odpowiedniego dla obrazowania próbki, zmieniając napięcie przyłożone do kryształu ogniwa pcal.
Na koniec wyłącz światła i włącz PMT. Rozpocznij powtórne skanowanie obrazu zestandaryzowanej próbki i reguluj lustra znajdujące się za ogniwem pcal, aż do uzyskania ostrego obrazu próbki. Teraz przejdźmy do określania bezpiecznej mocy monitora i ogniskowania w obrębie próbki.
Na potrzeby tego filmu wykorzystamy próbkę wodnego barwnika umieszczoną w zagłębieniu szkiełka przedmiotowego i przykrytą szkiełkiem nakrywką. Osłabcie wiązkę lasera do niskiej, lecz wystarczającej mocy, aby wywołać fluorescencję w próbce. Szczelnie zamknijcie mikroskop i przekierujcie sygnał wyjściowy z PMT do licznika fotonów.
Wyłącz światło, włącz PMT i rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu mikroskopu. Ustaw licznik fotonów tak, aby całkowanie odbywało się w skali czasowej znacznie dłuższej niż przewidywany czas powrotu fluorescencji, i zarejestruj odpowiednią liczbę punktów danych. Zwiększ moc i pobierz kolejną serię danych z licznika fotonów.
Kontynuuj zwiększanie mocy, aż przyrost liczby fotonów zacznie wyraźnie maleć. W odniesieniu do wykresu wzrostu mocy, logarytm liczby fotonów jest przedstawiony jako funkcja logarytmu mocy. Jakiekolwiek odchylenie od nachylenia równego dwa wskazuje na fotowyblakanie.
Podczas monitorowania należy wybrać odpowiednią moc monitora, która znajduje się poniżej tej wartości odcięcia. Teraz ustalmy parametry wejściowe dla skalera wielokanałowego oraz generatora impulsów. W generatorze impulsów.
Ustaw czas wstępnego wyblaknięcia (pre-teach time) na wartość od jeden do dwóch razy większą niż przewidywany czas połowicznego powrotu, a czas wyblaknięcia (bleach time) na 1/10 przewidywanego czasu połowicznego powrotu w skalerze. Ustaw szerokość przedziału (bin width) na około połowę czasu trwania wyblaknięcia oraz ustal liczbę przedziałów na zapis (bins per record) w taki sposób, aby iloczyn wybranej szerokości przedziału i liczby przedziałów na zapis był większy niż przewidywany całkowity czas powrotu. Dodając do tego czasy wstępnego wyblaknięcia i wyblaknięcia, wróć do generatora impulsów i ustaw częstotliwość sekwencji wstępnego wyblaknięcia i wyblaknięcia na wartość nieco mniejszą niż odwrotność iloczynu szerokości przedziału i liczby przedziałów na zapis.
Na koniec ustaw liczbę zapisów na skan w skalowalniku w oparciu o intensywność sygnału przy wybranej mocy monitorowania. Teraz ustaw moc monitorowania na bezpieczny poziom, a moc wybielania na około 200 milliwatów powyżej progu wybielania ustalonego podczas testu wybielania monitorującego. Obie te moce są ustawiane jako różne napięcia przy uszczelnieniu kryształu ogniwa al, a następnie wyłącz światła w mikroskopie.
Włącz PMT. Rozpocznij skanowanie punktowe w oprogramowaniu do obrazowania. Następnie uruchom generator impulsów i skaler.
Aby przeanalizować otrzymaną krzywą powrotu, należy zaznaczyć trzy istotne punkty: fluorescencję przed wybielaniem, fluorescencję bezpośrednio po wybielaniu oraz fluorescencję na końcu zestawu danych. Wartości fluorescencji sprzed wybielania i bezpośrednio po nim należy wykorzystać do dokładniejszego oszacowania czasu połowy powrotu.
Teraz, stosując zasady opisane w poprzednich krokach, należy zaktualizować wartości dla wybielania wstępnego (prebleach) oraz czasu trwania początku szerokości (begin width). Wykorzystaj nową krzywą i kontynuuj dostrajanie parametrów do momentu, aż wynikowa krzywa wykaże silne wybielanie i płynną regenerację. Sprawdź nasycenie wzbudzenia, wykreślając logarytm parametru głębokości wybielania w funkcji logarytmu mocy.
Każde odchylenie od nachylenia równego dwóm wskazuje na nasycenie wzbudzenia. Należy dobrać taką moc wybielania, która zapewni silne wybielenie, ale nie spowoduje nasycenia. Po ustaleniu odpowiednich parametrów należy kontynuować pomiary krzywych wielofotonowej regeneracji fluorescencji po fotowybielaniu (MP FRAP) dla badanej próbki.
Teraz zaprezentujemy reprezentatywne wyniki zarówno surowych danych MP FRAP, jak i znormalizowanej krzywej MP F FRAP, która została dopasowana w celu wyznaczenia współczynnika dyfuzji. Surowe dane MP F FRAP wykazują silne wybielenie oraz gładki powrót sygnału. W celu dopasowania danych, pełny powrót zgłoszono dla drugiej połowy zbioru danych. Najpierw normalizujemy powrót do średniej fluorescencji przed wybieleniem, a następnie przeprowadzamy nieliniowe dopasowanie metodą najmniejszych kwadratów.
W odniesieniu do odpowiedniego modelu. Oba zestawy danych uzyskano w wodnym roztworze fluoresceiny, co pozwoliło wyznaczyć współczynniki dyfuzji. Zgodnie z literaturą, właśnie zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia eksperymentu wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotoblaknięciu.
Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować ostrożność i ustawić parametry eksperymentalne, w szczególności czas wybielania oraz moc wybielania i monitorowania, w bezpiecznych granicach określonych w protokole. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł opisuje procedurę pomiaru współczynników dyfuzji przy użyciu wielofotonowego odzyskiwania fluorescencji po fotowybielaniu. Proces ten obejmuje ustawienie lasera wzdłuż toru optycznego do próbki oraz dopasowanie krzywych odzyskiwania fluorescencji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Mikroskopia fluorescencyjna
- Pomiar dyfuzji
- Techniki fotowybielania
Wprowadzenie
- Wielofotonowy powrót fluorescencji po fotoblokowaniu jest techniką stosowaną do badania dyfuzji molekularnej.
- Metoda ta pozwala na wgląd w dynamikę cząsteczek fluorescencyjnych w próbce.
- Zrozumienie współczynników dyfuzji jest niezbędne w wielu zastosowaniach biologicznych.
- Procedura ta ma zastosowanie do próbek z wolno dyfundującymi cząsteczkami barwnika fluorescencyjnego.
Cel badania
- Przedstawienie procedury pomiaru współczynników dyfuzji.
- Zapewnienie szczegółowej metodologii dla badaczy w tej dziedzinie.
- Pogłębienie zrozumienia dynamiki molekularnej w systemach biologicznych.
Zastosowane metody
- Wiązka lasera o niskiej intensywności generuje referencyjny poziom fluorescencji.
- Błysk lasera o wysokiej intensywności powoduje fotowybielenie części cząsteczek barwnika.
- Fluorescencję monitoruje się w miarę dyfuzji i zastępowania fotowybielonych cząsteczek.
- Krzywe powrotu fluorescencji są analizowane w celu wyznaczenia współczynników dyfuzji.
Główne wyniki
- Procedura ta pozwala na skuteczne pomiary współczynników dyfuzji cząsteczek fluorescencyjnych.
- Krzywe powrotu fluorescencji dostarczają ilościowych danych na temat dynamiki molekularnej.
- Metoda jest powtarzalna i może być stosowana do różnych próbek.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia oddziaływań molekularnych w kontekstach biologicznych.
Wnioski
- Wielofotonowy pomiar powrotu fluorescencji po fotobieleniu (FRAP) jest cenną techniką pomiaru współczynników dyfuzji.
- Opisana metodologia może być wykorzystywana przez badaczy do studiowania dynamiki molekularnej.
- Dalsze zastosowania tej techniki mogą poszerzyć naszą wiedzę na temat procesów biologicznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Pomiar współczynników dyfuzji za pomocą dwufotonowej regeneracji fluorescencji po fotoblakowaniu dostarcza ilościowych informacji na temat dynamiki molekularnej w systemach biologicznych, wspierając walidację celów oraz ograniczanie ryzyka mechanistycznego we wczesnej fazie odkrywania leków. Technika ta umożliwia powtarzalną, bezetykietową ocenę transportu makromolekularnego, co wpływa na opracowywanie testów i pewność prognostyczną w procesach identyfikacji wiodących związków. Jej zastosowalność zarówno w systemach in vitro, jak i in vivo zwiększa ciągłość translacyjną i zmniejsza niepewność biologiczną w podejmowaniu decyzji przedklinicznych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikacja hipotez terapeutycznych poprzez ilościowe określanie zachowania dyfuzyjnego makrocząsteczek w systemach istotnych dla przebiegu choroby.
- Wartość operacyjna: Umożliwienie redukcji ryzyka biologicznego poprzez bezpośredni pomiar mobilności cząsteczkowej w środowiskach natywnych lub modyfikowanych.
- Wartość prognostyczna: Wsparcie selekcji projektów w portfolio poprzez dostarczenie wskaźników dyfuzyjnych, które korelują z zaangażowaniem celu i kinetyką wiązania.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Gotowość do analizy: Przygotowuje zwalidowane systemy biologiczne do dalszego screeningu poprzez ustalenie bazowych parametrów dyfuzji.
- Powtarzalność: Dostarcza ilościowe odczyty fluorescencyjne, które wspierają standaryzację analizy pomiędzy poszczególnymi seriami pomiarowymi i laboratoriami.
- Skalowalność: Integruje się z platformami automatyzacyjnymi, takimi jak LabVIEW, w celu zwiększenia przepustowości w kampaniach screeningu substancji wiodących.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Znaczenie dla chorób: Ma zastosowanie w biologicznych systemach in vivo, umożliwiając ocenę dyfuzji w środowiskach przypominających tkanki.
- Ciągłość translacyjna: Łączy etap odkryć z procesami przedklinicznymi, zapewniając spójne odczyty biofizyczne w różnych systemach modelowych.
- Postęp z uwzględnieniem ryzyka: Wspiera decyzje o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez ilościowe określenie właściwości transportu molekularnego, które wpływają na dystrybucję leku i dostęp do celu.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od wczesnej walidacji celu, poprzez identyfikację związku wiodącego, aż po ocenę przedkliniczną, dostarczając danych biofizycznych niezbędnych do projektowania i optymalizacji cząsteczek.
- Biologia odkrywcza: Wspiera testowanie hipotez poprzez pomiar zmian dyfuzji makromolekularnej w warunkach eksperymentalnych, co pozwala wyjaśnić zachowanie szlaków i celów terapeutycznych.
- Przesiewy: Umożliwia przygotowanie testów poprzez standaryzowane pomiary powrotu fluorescencji, które zapewniają spójną ocenę związków.
- Analityka: Generuje ilościowe współczynniki dyfuzji za pomocą dopasowania metodą najmniejszych kwadratów krzywych powrotu, co umożliwia obiektywne porównywanie wariantów molekularnych.
- Badania translacyjne: Zapewnia ciągłość przedkliniczną poprzez umożliwienie pomiarów dyfuzji zarówno w układach in vitro, jak i in vivo, wspierając ekstrapolację wyników między różnymi skalami.
- Wykorzystanie korporacyjne: Służy jako wielokrotnego użytku platforma biofizyczna do oceny dynamiki molekularnej w ramach wielu projektów i klas celów.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zapewnia pewność prognostyczną w walidacji punktów uchwycia poprzez ograniczenie niejednoznaczności mechanistycznej w zakresie mobilności i oddziaływań cząsteczkowych.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzację i powtarzalność dzięki zdefiniowanym parametrom lasera, protokołom wybielania oraz zautomatyzowanej akwizycji danych.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową, umożliwiając wczesną redukcję ryzyka dla punktów uchwycia na podstawie biofizycznych profili opartych na dyfuzji.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację skorygowaną o ryzyko poprzez identyfikację punktów uchwycia o korzystnych charakterystykach transportu cząsteczkowego dla dalszego rozwoju.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w zakresie mikroskopii dwufotonowej, technik fotoblkowania oraz kwantyfikacji fluorescencji.
- Zależy od oprzyrządowania, w tym od laserów impulsowych, ogniw Pockelsa, liczników fotonów oraz kompatybilnych systemów skanujących.
- Wymaga standaryzacji mocy lasera, czasu trwania fotoblkowania oraz ustawień szerokości przedziału (bin width) pomiędzy użytkownikami i ośrodkami.
- Wiąże się z koniecznością uwzględnienia adaptacji przy przejściu z modeli barwników w roztworach wodnych do złożonych próbek biologicznych, takich jak komórki lub tkanki.
- Ograniczone przez konieczność stosowania znakowania fluorescencyjnego lub wykorzystania fluorescencji wewnętrznej, co może wymagać optymalizacji w przypadku celów o niskiej liczności.
