Programowana stymulacja elektryczna u myszy

Zanurzoną w narkozie mysz przymocowuje się taśmą do podgrzewanej platformy w pozycji na plecach. Wydziela się prawą żyłę szyjną i podwiązuje jej koniec proksymalny. Do żyły wprowadza się cewnik OC Apolar 1.1 French, a następnie przesuwa go do prawego przedsionka i prawej komory serca.

Na koniec dystalny koniec żyły zostaje podwiązany, aby zabezpieczyć położenie cewnika i zapobiec krwawieniu. Cześć, nazywam się Naali i pracuję w laboratorium dr. Zvera w Katedrze Fizjologii Molekularnej i Biofizyki w Baylor College of Medicine. Dzisiaj przedstawimy procedurę programowania stymulacji elektrycznej u myszy.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania arytmii indukowanych u myszy. Przejdźmy zatem do pracy. Przed operacją kanulacji i wprowadzenia cewnika, użyj maszynki do strzyżenia, aby ogolić futro znieczulonej myszy od linii szyi do poziomu środka klatki piersiowej.

Zdezynfekuj pole operacyjne 10% roztworem povidonu jodowego. Umieść mysz w pozycji na plecach i przytwierdź jej kończyny taśmą do elektrod EKG firmy ECG Electrodes Incorporated. W przypadku deski grzewczej zalecamy system zawierający sondę temperatury rektalnej podłączoną do maty grzewczej sterowanej przez system analizatora termicznego, tak aby temperatura ciała była utrzymywana na poziomie 37 ± 1 °C.

Po potwierdzeniu za pomocą odcisku palca, że mysz jest całkowicie znieczulona, wykonaj nacięcie o długości pół cala na prawo od linii środkowej, z końcem dystalnym na poziomie obojczyka. Oddziel tkankę podskórną, ślinianki oraz tkanki limfatyczne za pomocą rozwarstwiania tępego. Aby uwidocznić prawą żyłę szyjną, zwiąż proksymalny koniec żyły szwem 6-0.

Umieść kolejny szew pod żyłą na końcu dystalnym widocznego segmentu. Następnie rozpocznij komputerową akwizycję danych w celu zapisu powierzchniowego EKG. Podłącz cewnik do zewnętrznego stymulatora w trybie rejestracji.

Następnie, używając mikronozyciórek, wykonaj niewielkie nacięcie w kierunku podłużnym żyły, delikatnie pociągając za szew proksymalny. Aby pomóc w utrzymaniu żyły w linii prostej, wprowadź cewnik do wyciągania 1,1 French Octo przez żyłę do prawego przedsionka i komory. Prawidłowe położenie cewnika weryfikuje się poprzez wizualizację kształtów fal czterech wewnątrzsercowych elektrogramów na poziomie wierzchołka prawej komory, podstawy prawej komory, węzła przedsionkowo-komorowego oraz prawego przedsionka; na koniec zawiąż szew dystalny, aby zabezpieczyć położenie cewnika i zapobiec ewentualnemu krwawieniu podczas stymulacji przedsionka.

Para elektrod umieszczona w przedsionku zostaje przełączona z trybu rejestracji na tryb stymulacji, podczas gdy pozostałe pary elektrod pozostają w trybie rejestracji. Aby ustalić, czy mysz wykazuje zwiększoną podatność na arytmie przedsionkowe, przeprowadza się programowaną stymulację elektryczną prawego przedsionka. W pierwszej kolejności określa się próg stymulacji przedsionka, stosując impulsy prądu o czasie trwania co najmniej 52 millisecond przy różnych podstawowych długościach cyklu (BCL), aby sprawdzić spójność przechwytywania bodźca.

BCL początkowego pociągu impulsów jest nieco niższy od wewnętrznego BCL i zostaje zmniejszony o 10 milisekund. Typowa amplituda prądu wymagana do wychwytu bodźca wynosi od 100 do 200 mikroamperów. Po zastosowaniu 15-sekundowego pociągu stymulacji przedsionkowej przy BC wynoszącym 100 milisekund, należy zmierzyć czas powrotu węzła zatokowego lub SNRT, który definiuje się jako odstęp między ostatnim bodźcem w pociągu stymulacji a początkiem pierwszego spontanicznego skurczu zatokowego.

Aby określić skuteczny okres refrakcji przedsionków (A ERP), należy zastosować serię pociągów stymulacji przedsionkowej przy stałym BCLS z jednym bodźcem i krótszym bodźcem przedwczesnym S dwa. Odstęp S jeden do S dwa jest stopniowo zmniejszany o 2 ms w każdym pociągu stymulacji, od 70 ms do 20 ms, z okresem regeneracji wynoszącym co najmniej 30 s pomiędzy każdym protokołem stymulacji. A ERP definiuje się jako najdłuższy odstęp sprzężenia S jeden do S dwa dla przedsionków, które nie wygenerowały propagowanego skurczu po bodźcu S dwa.

Podobne zastosowanie pociągów stymulacji przedsionkowej i bodźców przedwczesnych jest wykorzystywane do wyznaczenia efektywnego okresu refrakcji węzła przedsionkowo-komorowego AV NERP. AV NERP definiuje się jako najdłuższy odstęp sprzężenia S1-S2, przy którym stymulacja przedwczesna dostarczona do przedsionka wywołuje potencjał hissa, ale nie wywołuje kompleksu QRS. Indukowalność arytmii przedsionkowych, w tym migotania przedsionków, może być badana za pomocą protokołu stymulacji seryjnej (burst pacing), w którym stosuje się serię dwusekundowych serii impulsów.

Pierwsze dwa dwusekundowe serie mają długość cyklu (CL) wynoszącą 40 ms, a każda kolejna dwusekundowa seria ma CL krótszy o 2 ms od serii poprzedniej, aż do osiągnięcia końcowego CL wynoszącego 20 ms. Po zakończeniu wszystkich protokołów stymulacji akwizycja danych zostaje zatrzymana. W przypadku końcowych badań EP węzeł jest delikatnie poluzowany, aby uwolnić cewnik.

Poniżej przedstawiamy reprezentatywne zapisy EKG powierzchniowego oraz elektrogramów wewnątrzsercowych u myszy. To EKG powierzchniowe wykazuje regularny rytm zatokowy z częstotliwością około 540 uderzeń na minutę. Kolejne cztery elektrogramy przedstawiają bipolarną rejestrację elektrogramów wewnątrzsercowych na poziomie prawego przedsionka.

Węzeł przedsionkowo-komorowy, podstawa prawej komory oraz wierzchołek prawej komory. Fala a w zapisie elektrogramu wewnątrzsercowego na poziomie prawego przedsionka odpowiada załbie P w powierzchniowym EKG. Fala V w elektrogramie komorowym odpowiada zespołowi QRS w powierzchniowym EKG.

Następnie przedstawiamy reprezentatywne powierzchniowe zapisy CCG oraz elektrogramy wewnątrzsercowe u myszy, u której rozwinęła się migotanie przedsionków po zastosowaniu powierzchniowej stymulacji seryjnej przedsionków. W zapisie CCG odstęp RR jest nieregularny i nie występują wyraźne załamki P. Z kolei elektrogram przedsionkowy wykazuje szybkie, nieregularne sygnały przedsionkowe, co jest zgodne z obrazem migotania przedsionków.

Elektrogram komorowy ma niższą częstotliwość, zbliżoną do odstępów RR w odprowadzeniach powierzchniowych. Właśnie pokazaliśmy, jak zaprogramować stymulację elektryczną u myszy; wykonując tę procedurę, należy pamiętać o unikaniu rozległych krwawień oraz utrzymaniu temperatury ciała w normalnym zakresie od 36 do 37 °C. Ponadto należy dążyć do zminimalizowania narażenia na isofluran, ponieważ ekspozycja na ten środek trwająca dłużej niż dwie godziny lub zastosowanie wyższego stężenia może doprowadzić do upośledzenia funkcji serca i układu oddechowego u myszy.

W związku z tym zalecamy, aby wszystkie rozpoczęte procedury zostały ukończone w ciągu dwóch godzin. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.