Wielokolorowe analizy cytometryczne odpowiedzi immunologicznej komórkowej u makaków rezus

W niniejszym filmie przedstawiono procedurę stymulacji i barwienia mononuklearnych komórek krwi obwodowej, czyli pbmc. W celu przeprowadzenia wielokolorowej analizy cytometrii przepływowej, Alec Watts wyjaśnia, że pbmc wyizolowane z pełnej krwi nanosi się na płytki do hodowli tkankowej. Komórki są stymulowane chemicznie lub biologicznie w celu wywołania odpowiedzi immunologicznej.

Po stymulacji dodaje się koktajl przeciwciał w celu identyfikacji typów komórek na podstawie ekspresji markerów powierzchniowych. Następnie komórki są poddawane permeabilizacji, a dodawany jest inny koktajl przeciwciał w celu wykrycia ekspresji cytokin wewnątrzkomórkowych; następnie komórki są analizowane za pomocą cytometrii przepływowej, aby określić profile cytokinowe dla konkretnych subpopulacji PBMC. Cześć, jestem Amy Courtney z laboratorium dr. Jagana SAS w Katedrze Immunologii w University of Texas MD Anderson Cancer Center.

Cześć, jestem Hong, również z laboratorium. Dzisiaj zaprezentujemy analizę wielobarwną cytometrią przepływową w odpowiedziach limfocytów T. Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania komórkowych odpowiedzi immunologicznych u makaków rezus.

Zacznijmy. Rozpocznij ten protokół, używając komory licznikowej (hemocytometru) w celu oznaczenia liczby żywych komórek pbmc z Reuss Maca metodą wykluczania barwnika trypanu niebieskiego. Pracuj w laminarnym dygestorium reus.

Zawieś komórki w pełnej pożywce w stężeniu 10 milionów komórek na mililitr do niespecyficznej stymulacji, dodając 100 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej studni płytki 96-dołkowej do hodowli tkanek. Następnie dodaj 100 mikrolitrów pożywki zawierającej PMA i CIN, aby uzyskać całkowitą objętość 0,2 mililitra, przy końcowym stężeniu 50 nanogramów na mililitr PMA i 500 nanogramów na mililitr CIN; do studni kontroli negatywnej dodaj 100 mikrolitrów samej pełnej pożywki do każdej z nich. Inkubuj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w nawilżonej atmosferze z 5% carbon dioxide przez 1,5 godziny.

Dodaj felden A do hodowli do końcowej stężenia 10 µg/mL i inkubuj przez dodatkowe 4,5 godziny. Felden A jest dodawany do trapp cytokines w aparacie gold G w celu zwiększenia widoczności podczas barwienia immunocytochemicznego; po stymulacji odwiruj próbki, aby usunąć medium, a następnie przemyj, dodając 200 µL zimnego buforu do płukania w cytometrii przepływowej i wirując przy niskiej prędkości. Powtórz to przemywanie, a następnie resuspenduj w 50 µL buforu do płukania w cytometrii przepływowej.

Komórki są teraz gotowe do barwienia w celu oznaczenia ekspresji markerów powierzchniowych w każdej studni z zawiesiną komórek. Dodaj 1 µL barwnika fluorescencyjnego Live Dead Fixable Aqua, przygotowanego zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubuj w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut podczas inkubacji komórek.

Przygotuj w mikroprobówkach roztwory barwiące, które zostaną wykorzystane do barwienia. Najpierw przygotuj koktajl barwiący, zawierający odpowiednio następujące składniki: miareczkowane przeciwciała monoklonalne znakowane fluorescencyjnie, anty-CD3 PE SCI 7, anty-CD8 Alexa 700, anty-CD28 per CCP SCI 5.5, anty-CD95 APC oraz anty-CD4 Pacific Blue w buforze do płukania Inflow Wash Buffer.

Następnie należy przygotować kontrole kompensacji, które posłużą do wyznaczenia współczynników przenikania sygnału każdego poszczególnego barwnika do pozostałych detektorów; w tym celu przygotowuje się osobne probówki z każdym przeciwciałem koniugowanym z fluorochromem jako pojedynczym barwieniem. Na koniec należy przygotować barwienia typu fluorescence minus one (FMO), łącząc wszystkie odczynniki z wyjątkiem tego, który jest przedmiotem analizy. Posłuży to do wyznaczenia granicy między populacją pozytywną a negatywną poprzez powtórzenie pomiarów poziomu autofluorescencji oraz danych obecnych w próbkach w pełni barwionych.

Po inkubacji komórek z barwnikiem żywe/martwe, przemyj je raz zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej, aby usunąć nadmiar barwnika, a następnie odessaj bufor. Następnie dodaj przygotowane roztwory barwiące. Inkubuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 30 minut.

Przemyj barwione komórki zimnym buforem do płukania w cytometrii przepływowej, aby usunąć nadmiar przeciwciał. Następnie dodaj 100 µL roztworu do fixacji i permeabilizacji BD na co najmniej 10 minut. Przechowuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności do 24 godzin aż do momentu ich użycia lub przejdź do znakowania cytokin wewnątrzkomórkowych w celu ich identyfikacji.

Najpierw poddaj komórki permeabilizacji w 100 µL buforu do przemywania 1x perm. Inkubuj przez 10 minut w temperaturze 4 °C w ciemności podczas inkubacji komórek. Przygotuj przeciwciała do barwienia, kontrole kompensacji oraz kontrole FMO w buforze do przemywania 1x perm, analogicznie jak poprzednio.

Po inkubacji komórek przez 10 minut, odwiruj je i usuń bufor do płukania 1x perm. Dodaj odpowiednie przeciwciała barwiące. Następnie inkubuj komórki z przeciwciałami przez 60 minut w temperaturze 4 °C w ciemności.

Przemyj komórki dwukrotnie roztworem do permeabilizacji. Po ostatnim płukaniu ponownie zawieś komórki w 1% Paraformaldehydzie w DPBS w celu ich utrwalenia. Przechowuj komórki w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności do momentu użycia, nie dłużej niż przez 24 godziny.

Po zabarwieniu komórek należy użyć cytometru przepływowego LSR II lub CytoDP do przeprowadzenia analizy FACS. Następnie dane analizuje się za pomocą oprogramowania FlowJo lub podobnego. Skład PBMC w reus Maca określono za pomocą analizy FACS.

Na tym rysunku przedstawiono schemat bramkowania wykorzystany do analizy różnych subpopulacji limfocytów T u reprezentatywnego zwierzęcia. Limfocyty wyodrębniono najpierw za pomocą bramkowania rozpraszania w przód FSC względem rozpraszania bocznego SSC, a następnie zidentyfikowano żywe limfocyty na podstawie populacji SSC i AQUA-ujemnej. Następnie zidentyfikowano limfocyty T poprzez ekspresję CD3; w obrębie populacji limfocytów T CD3-dodatnich określono również populacje CD4-dodatnie/CD8-ujemne oraz CD4-ujemne/CD8-dodatnie.

Komórki T CD4+ i CD8+ zostały następnie podzielone na różne subpopulacje na podstawie ekspresji CD28 i CD95, wyróżniając komórki naiwne, pamięci centralnej oraz pamięci efektorowej. Na tej rycinie przedstawiono produkcję interferonu gamma oraz IL-2 w niepobudzonych oraz pobudzonych PMA i ionomycyną (CIN) komórkach T CD4+ oraz ich subpopulacjach.

Zwróć uwagę na odrębne profile cytokin wywołane stymulacją w każdej podgrupie. Pokażemy Państwu, jak przeprowadzić wieloparametryczną analizę cytometryczną PBMC.

Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przygotować zarówno kontrole kompensacji jednobarwnej, jak i kontrole FMO (fluorescent minus one). Obie te kontrole są niezbędne do prawidłowej analizy danych z cytometrii przepływowej. Więcej informacji na temat wyboru kontroli kompensacji znajduje się w naszym protokole pisemnym.

Należy również pamiętać, że podczas stosowania przeciwciał znakowanych fluorescencyjnie ważne jest zasłonięcie próbek, aby chronić je przed ekspozycją na światło. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.