Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji

Oznaczanie reaktywności i miana surowicy za pomocą testu hemaglutynacji. Hemaglutynacja to reakcja zachodząca pomiędzy rozpuszczalnymi przeciwciałami a antygenami cząsteczkowymi. Mogą to być komórki lub cząsteczki nośnikowe.

Epitopy na powierzchni nośnika umożliwiają przeciwciałom wiązanie i sieciowanie nośników, co prowadzi do powstania złożonej sieci zwanej kompleksem antygen-przeciwciało. Hemaglutynacja jest specyficzną formą aglutynacji, w której przeciwciała wiążą się z erytrocytami, które pełnią rolę antygenu cząsteczkowego. Erytrocyty są użytecznymi celami, ponieważ są łatwo dostępne, a wyniki można bez trudu zaobserwować gołym okiem.

Próbki surowicy poddaje się rozcieńczaniu seryjnem, a następnie przenosi do płytki UBO z 96 dołkami. Następnie dodaje się zawiesinę erytrocytów. Gdy przeciwciała występują w wysokim stężeniu, dochodzi do ich wiązania z erytrocytami, co prowadzi do powstania rozbudowanej sieci.

W miarę jak sieć ta osiada pod wpływem grawitacji, przyjmuje kształt płytki ubo. Patrząc z góry, widoczna jest szeroka warstwa erytrocytów. Jest to dodatnia reakcja hemaglutynacyjna.

Gdy poziomy przeciwciał są niskie, sieć nie może się utworzyć, a erytrocyty przyjmują kształt płytki UBO i koncentrują się u podstawy, tworząc mały osad. Jest to ujemna reakcja hemaglutynacji. Ten schemat przedstawia reakcję dodatnią.

Komórki, osiadając, tworzą sieć, dostosowując się do kształtu płytki z dnem w kształcie litery U. Po lewej i prawej stronie widoczny jest widok z góry, na którym widać szeroką warstwę erytrocytów. W przypadku obecności umiarkowanej ilości przeciwciał, zaobserwowana zostanie formacja przypominająca litery.

Aglutynacja hemoglobiny pozwala również na badanie reaktywności różnych próbek surowicy względem znanego antygenu. Można również wyznaczyć miano próbki surowicy. Miano to ostatnie rozcieńczenie, przy którym zaobserwowano reakcję dodatnią.

Zazwyczaj im wyższe stężenie przeciwciał w próbce surowicy, tym wyższy miano. Ten schemat przedstawia ujemną reakcję hemaglutynacji. Obecność przeciwciał jest niewystarczająca do sieciowania erytrocytów.

W miarę jak komórki osiadają pod wpływem grawitacji, przesuwają się wzdłuż ścianki dołka, tworząc na dnie zwarty pellet. Schemat po prawej stronie przedstawia erytrocyty widziane z góry. Do tego eksperymentu będzie potrzebna jedna płytka 96-dołkowa z dnem w kształcie litery U.

Niezbędne jest użycie płytek z dnem w kształcie litery U, ponieważ płytki z płaskim dnem nie pozwolą na sedymentację komórek w pellet, co uniemożliwi interpretację wyników. Pipetą należy nanieść 50 µL surowicy testowej, 1% zawiesiny komórek Riva oraz roztwór buforu soli PBS do każdej studzienki w rzędzie. Do studzienek od 1 do 12 należy nanieść 50 µL buforu soli PBS.

Służy on jako rozcieńczalnik. Teraz należy nanieść 50 µL surowicy do dołka A1. Jest to pierwsze rozcieńczenie dwukrotne.

Używając mieszadła, należy upewnić się, że próbka surowicy jest dokładnie wymieszana. Po wymieszaniu odpipuj 50 µL z dołka A1 i przenieś do dołka A2. Jest to drugie rozcieńczenie 1:2, co daje końcowe rozcieńczenie czterokrotne.

Kontynuuj tę serię rozcieńczeń, korzystając z dołków od trzeciego do jedenastego. Do dołka 12 nie dodawaj żadnego surowicy, ponieważ służy on jako ujemna kontrola z roztworem soli fizjologicznej. Następnie pobierz 50 µL dokładnie wymieszanej 1% zawiesiny komórek Riva i przenieś do dołków od A1 do A12.

Po dodaniu komórek przykryć płytkę i delikatnie nią stuknąć, aby zapewnić wymieszanie próbek i komórek. Następnie inkubować w temperaturze 37°C przez 60 minut. Odpowiedni będzie inkubator z nawilżaniem.

Podczas 60 minutowego okresu inkubacji będą zachodzić oddziaływania antygen-przeciwciało, a komórki zaczną osiadać. Wyświetlany materiał wideo to film poklatkowy z całego 60 minutowego okresu. Jest to zbliżenie na dołki od piątego do dziesiątego.

Zbadaliśmy już studni środkową 12, która w tym doświadczeniu służyła jako kontrola VBS. Komórki utworzyły zwarty osad, co wskazuje na prawidłowe działanie testu. Studnie pięć i sześć są przykładami pozytywnej hemaglutynacji.

Studnia numer siedem stanowi przykład pośredniego wyniku aglutynacji, natomiast studnie osiem, dziewięć i 10 są ujemne pod kątem hemaglutynacji. Na podstawie tego wyniku miano zostanie określone na podstawie rozcieńczenia dla studni numer siedem, ponieważ była to ostatnia studnia, w której zaobserwowano reakcję dodatnią.