Pierwotne ludzkie komórki nabłonka oskrzeli hodowane z eksplantatów

W niniejszym artykule opisujemy protokół hodowli i ekspansji ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z bezpośrednio wyizolowanych segmentów oskrzeli ludzkich. Protokół ten składa się z pięciu sekcji: kodowania i nacinania, płyt hodowlanych o średnicy stu milimetrów, przygotowania tkanki oskrzelowej, transplantacji eksplantów tkanki oskrzelowej, pasażowania ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z rozwojem rzęsek oraz hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli na wkładkach transwell. Przed rozpoczęciem należy pamiętać, że wszystkie etapy są wykonywane w komorze z laminarnym przepływem powietrza.

Jeśli nie zaznaczono inaczej, należy zapoznać się z sekcją materiałów, odczynników i przygotowań, aby upewnić się, że wszystkie niezbędne elementy zostały przygotowane. Następujące etapy: kodowanie, hodowla roztworów zapasowych, medium, roztwory do dysocjacji, powlekanie i drapanie, powinny być wykonywane w płytkach hodowlanych o średnicy 100 mm w optymalnych warunkach.

Zachować pełną sterylność. Przygotować sterylne płytki hodowlane o średnicy 100 mm oraz roztwór powlekający. Za pomocą pipety BST nanieść 2 ml roztworu powlekającego na płytkę 100 mm, a następnie delikatnie nią potrząsać, aby równomiernie pokryć dno płytki.

Należy upewnić się, że roztwór powlekający równomiernie pokrywa dno płytki. Pozostały roztwór należy odpipetować i wykorzystać do powleczenia drugiej płytki o średnicy 100 mm. Czynność tę należy powtórzyć dla tylu płytek, ile jest wymagane.

Liczba potrzebnych płytek zależy od liczby eksplantów tkankowych. Należy upewnić się, że roztwór powlekający równomiernie pokrywa dno płytek, zgodnie z demonstracją.

Przykryj płytki ich pokrywkami. Pozostaw płytki do wyschnięcia w inkubatorze na jedną do dwóch godzin i odessaj nadmiar roztworu przed wykorzystaniem do eksplantacji tkanki oskrzeli. Niewykorzystane powlekane płytki hodowlane można umieścić w sterylnym worku i przechowywać w temperaturze 4 °C do późniejszego użycia.

Użyj sprayu do czyszczenia, małych ostrych nożyczek, skalpela i pęsety odkawezionych 70% ethanol, a następnie wprowadź do BSC płytki z naniesionymi nacięciami, dociskając mocno skalpel, aby utworzyć głębokie, małe nacięcia w kształcie XS, co najmniej cztery na płytkę. Jeśli nacięcia nie będą wystarczająco głębokie, fragmenty tkanki nie osadzą się w strzykawkach i będą dryfować. Poza obszarem BSC umieść tkankę w naczyniu typu P3. Dokładnie wypłucz wyizolowaną ludzką tkankę oskrzelową w Bss.

Otwórz fragmenty oskrzeli. Przenieś tkankę do BS, a następnie przełóż ją do sterylnej 100 mm płytki hodowlanej z chłodnym medium DMEM/F-12 z dodatkiem 1% antybiotyku i przeciwgrzybiczego.

Za pomocą pincety umieść jeden fragment wyciętej tkanki w centrum każdego nacięcia X i dociśnij. Pozostaw fragmenty tkanki lub eksplanty X na kilka sekund, aby przylgnęły do płytki. Następnie delikatnie dodaj 10 ml pełnej pożywki. Jeśli po dodaniu pożywki tkanka wypływa, użyj pincety, aby wcisnąć ją w rowki nacięcia X lub wykonaj nowe nacięcie X. Konieczne może być wykonanie nowych nacięć X, jeśli rowki nie są wystarczająco głębokie.

Umieść płytki w inkubatorze i wymieniaj pożywkę co trzy do czterech dni, aż tkanki będą gotowe do transplantacji. Proces ten trwa około czterech tygodni, do momentu gdy wokół tkanek urośnie wystarczająca liczba komórek nabłonkowych, pokrywając obszary o wielkości od jednego do dwóch centymetrów. Użyj powlekanych i porysowanych płytek o średnicy stu milimetrów.

Ponieważ niektóre eksplanty tkankowe mogą nie przetrwać, liczba płytek zależy od liczby przenoszonych fragmentów tkanki. W przypadku stosowania płytek, które zostały wcześniej pokryte i przechowywane w temperaturze 4°C, należy doprowadzić je do temperatury pokojowej przed użyciem. Za pomocą pęsety ostrożnie pobrać tkankę z pierwotnej płytki, umieścić ją w centrum osi na nowej płytce i delikatnie docisnąć. Tkanki bez widocznego przerostu należy odrzucić.

Pozostaw tkankę do przyprzylgnięcia do płytki. Po kilku sekundach dodaj pożywkę i inkubuj. Dodaj opisane wcześniej dla X explan.

Do każdej 100 mm płytki do hodowli tkankowej należy dodać 2 ml roztworu zapasowego trypsyny i EDTA. Rozcieńczyć roztwór zapasowy w 6 ml sterylnego 0,01 M PBS, tak aby 2 ml roztworu zapasowego przypadało na 6 ml PBS, co zapewni końcowe stężenie trypsyny wynoszące 250 µg/ml oraz EDTA wynoszące 100 µg/ml. Po przeniesieniu eksplantów na nową płytkę, odessać medium z płytek zawierających pierścienie komórek o szerokości 1-2 cm.

Do każdej płytki o średnicy 100 mm dodaj 8 ml ciepłych, rozcieńczonych kropel i roztworu edt. Następnie umieść płytki w inkubatorze w temperaturze 37 °C na 3 do 15 minut. Sprawdzaj często.

Zbyt długie działanie trypsyny uszkodzi komórki. Sprawdź płytki pod mikroskopem, aby upewnić się, że większość komórek została odklejona; komórki przyjmą okrągły kształt i oddzielą się, jak pokazano w powiększeniu 8x. Dodaj 10% FBS w pożywce na płytkę, aby dezaktywować roztwór EDTA.

Połączyć objętości ze wszystkich płytek w jednej probówce lub w osobnych probówkach dla różnych tkanek. Policzyć komórki, używając komory licznikowej Hema Cytometer; wirować z prędkością 100 g przez pięć minut. Na dnie probówki utworzy się granulat komórkowy; resuspender granulat komórkowy w pełnym medium do pożądanej koncentracji komórek.

Przenieść od 2 do 3 milionów komórek do każdej kolby T 75 i dodać odpowiednią ilość pełnej pożywki. Inkubować i wymieniać pożywkę. Co trzy do czterech tygodni komórki w kolbach D 75 osiągają stan subkonfluencji.

Po około czterech tygodniach komórki należy zdjąć i namnożyć lub wykorzystać przy subkonfluencji, aby zapobiec starzeniu. Rozpocznij od przygotowania przepuszczalnych membran transwelli. Użyj wkładów o średnicy 6,5 mm, które pasują do wieloodrywnych płytek 24-dołkowych.

Dodać pożywkę po obu stronach membrany. 600 µm od spodu oraz 100 µm od góry. Inkubować przez jedną godzinę w inkubatorze do hodowli komórkowych.

Ostrożnie usuń pożywkę z obu stron membrany. Zacznij od objętości bazalnej, ponieważ membrana może zostać łatwo uszkodzona. Pożywkę należy pipetować po ściance insertu hodowlanego, stosując zalecaną objętość.

Zaniechanie tego kroku spowoduje wyciek medium do innych studzienek z wysianymi komórkami. Po preinkubacji wspornika przepuszczalnego ostrożnie pipetuj zawiesinę komórkową na stronę apikalną membrany w studzienkach o średnicy 6,5 mm, nakładając 0,1 ml zawiesiny komórkowej na stronę apikalną membrany. Pipetuj 0,6 ml medium na stronę bazalną membrany.

Dokarmić komórki od strony apikalnej i bazalnej przez 10 dni. Aby uzyskać dobrze zróżnicowaną hodowlę, wymieniać medium dwa razy w tygodniu. Stosując zademonstrowaną metodę, usunąć objętość bazalną.

Najpierw, aby uzupełnić objętość nadstrefową, dodaj 0,6 ml pożywki po stronie podstawnej membrany. Metoda ta sprzyja adhezji komórek do membrany i zapobiega ich długotrwałej ekspozycji na powietrze. Szybko wymień pożywkę i umieść próbkę z powrotem w inkubatorze.

W 10. dniu utwórz granicę powietrze-ciecz (air liquid interface), usuwając medium AAL i wymieniając 0,6 ml medium po stronie podstawnej membrany. Utrzymuj komórki w warunkach granicy powietrze-ciecz przez sześć tygodni, zmieniając media dwa razy w tygodniu. Komórki rzęsiste zaczną pojawiać się cztery tygodnie po utworzeniu granicy.

Interfejs ciecz-powietrze. Komórki osiągną jednorodną różnicowanie w komórki rzęskowe. Sześć tygodni po utworzeniu interfejsu ciecz-powietrze dla ucha.

Ludzkie segmenty oskrzelowe ze zdrowymi komórkami nabłonkowymi z preparatów i przeszczepów. W naszym badaniu pomyślne hodowle z preparatów tkanki oskrzelowej uzyskano w ośmiu z dziewięciu przypadków. Ponieważ jedna z hodowli z preparatów uległa zakażeniu, pierścienie komórek nabłonkowych osiągnęły promień od jednego do dwóch centymetrów w ciągu trzech do czterech tygodni.

Udane eksplanty X hodowano ponownie do sześciu razy. Wszystkie udane hodowle wykazywały oznaki migracji komórek w ciągu 48 godzin od rozpoczęcia transplantacji, lub eksplanty X, jak pokazano w B, miały wygląd brukowany, który jest charakterystyczny dla tych komórek nabłonkowych, jak pokazano w B. W kolejnych rysunkach immunobarwienie preparatów cytologicznych komórek z eksplantu oraz komórek wysianych na szkiełka nakrywki wykazało, że wszystkie komórki były pozytywne w kierunku specyficznej dla nabłonka cytokeratyny; tutaj przedstawiono ludzkie subkultury komórek oskrzelowych hodowanych do stanu subkonfluencji w kolbach T 75. Należy zwrócić uwagę na wygląd brukowany.

Ludzkie subkultury komórek oskrzelowych wykazywały jednolite dodatnie barwienie immunocytochemiczne dla keratyny i E.Cad. Barwienie immunocytochemiczne ze swoistymi przeciwciałami przeciwko innym typom komórek nie wykazało żadnych oznak kontaminacji kultur fibroblastami, komórkami mezenchymalnymi lub śródbłonkowymi. Więcej szczegółów znajduje się na rysunku 5 oraz w jego opisie w tekście. Komórki hodowane na przepuszczalnych membranach poliestrowych lub transwellach z interfejsem ciecz-powietrze różnicowały się w nabłonek rzęskowy, co zostało tutaj zademonstrowane; należy zutylizować komórki i ich pasaże, jeśli zaczną pojawiać się komórki o innej morfologii niż przedstawiona tutaj. W niniejszym protokole przedstawiliśmy szczegółowe metody hodowli i ekspansji pierwotnych ludzkich komórek nabłonka oskrzelowego.

Badania oparte na ludzkich komórkach są niezbędne do określenia istotnych szlaków mechanizmów chorób płuc u ludzi oraz do badań toksykologicznych i farmakologicznych nowych leków. Mamy nadzieję, że opisane tutaj metody zachęcą Państwa do hodowli ludzkich komórek nabłonka oskrzeli z eksplantów i wykorzystania tych komórek w systemach badawczych. Dziękujemy i życzymy powodzenia.