Badanie pul pul pęcherzyków synaptycznych z wykorzystaniem fotokonwersji barwników styrylowych

W niniejszym filmie zaprezentowano procedurę konwersji fotoindukowanej barwnika Styro Dye FM 1 43. Aby zbadać pule pęcherzyków synaptycznych u drosophila melanogaster, w pierwszej kolejności przeprowadzana jest dyssekcja larw muszki owocówki w celu odsłonięcia mięśni brzusznych, które stanowią preparat złącza nerwowo-mięśniowego (NMJ). Preparaty inkubuje się w buforze zawierającym FM D, pokazany tutaj na szaro, który znakuje błonę komórkową.

Następnie poddaje się je stymulacji elektrycznej lub chemicznej, aby wywołać fizyczną fuzję, po której następuje internalizacja błony pęcherzyka. Stymulowana egzocytoza zostanie zabarwiona barwnikiem FM D. Następnie wypłukuje się pozakomórkowy barwnik FM, usuwając go z błony plazmatycznej, a tkankę utrwala pod wpływem ciągłego oświetlenia o wysokim natężeniu. Barwnik ulega całkowitemu wybieleniu, a czarny kolor pojawia się w wyniku precypitacji diaminobenzydyny.

Osad ten można następnie zwizualizować za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej. Witajcie, jestem Philippe o Paso z laboratorium Sylvii Olli w Europejskim Instytucie Neuronauki w Gießen w Niemczech. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę fotokonwersji FM w złączu nerwowo-mięśniowym.

W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania recyklingu pęcherzyków synaptycznych. Zatem zacznijmy. Pracując pod mikroskopem stereoskopowym, należy najpierw przymocować larwę drosophila grzbietem do góry w szalce pokrytej agarozą.

Przykryj preparat solą fizjologiczną dla drosofil za pomocą igły strzykawki, a następnie nacinaj stronę grzbietową wzdłuż za pomocą nożyczek do sekcji. Następnie usuń organy wewnętrzne. W kolejnym kroku rozciągnij preparat i ponownie przypnij go do szalki Petriego.

Następnie można wykorzystać kilka mięśni brzusznych, aby chronić barwniki FM stosowane w tej procedurze przed blaknięciem. Procedurę tę należy przeprowadzać w warunkach słabego oświetlenia. Przykryć unieruchomiony preparat drosophila roztworem soli dla drosophila zawierającym 90 millimolar KCl oraz 10 micromolar FM.1 43 w celu chemicznej stymulacji nerwów.

Po stymulacji inkubować przez jedną minutę w temperaturze pokojowej. Usunąć roztwór stymulujący i, pracując pod wyciągiem chemicznym, dwukrotnie zanurzyć szalkę z przypiętą muszką owocniczką w zlewce wypełnionej 100 mililitrami soli fizjologicznej dla drosophila, aby usunąć pozakomórkowy barwnik FM 1 43.

Utrwal preparat złącza nerwowo-mięśniowego w 2,5% glutaraldehydzie w soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS przez 45 minut w temperaturze pokojowej. Przemyj preparat raz w PBS, a następnie wyjmij go z naczynia typu cigar dish i zanurz w 100 mM chlorku amonu na 15 minut, aby zneutralizować wolne grupy aldehydowe pozostałego utrwalacza glutaraldehydowego.

Używając zwykłego PBS, wypłucz roztwór chlorku amonu, umieść preparat złącza nerwowo-mięśniowego w nowej szalce typu cigar i zanurz go w przefiltrowanym roztworze diaminobenzydyny (DAB) o stężeniu 1,5 mg/mL w PBS, a następnie inkubuj przez 30 minut w temperaturze 4 °C. Umieść próbkę pod mikroskopem fluorescencyjnym wyposażonym w źródło światła w postaci lampy rtęciowej z obudową lampy zawierającą lustro odbijające, korzystając z suchego obiektywu o stosunkowo małym powiększeniu.

Zlokalizuj próbkę. Następnie, korzystając z normalnego kostki filtrów do wzbudzenia niebieskiego i fluorescencji zielonej, ustaw sygnał fluorescencyjny w ostrości. Złącza nerwowo-mięśniowe pojawiają się jako jasne punkty na mięśniach.

Następnie, korzystając z tego samego zestawu filtrów fluorescencyjnych, naświetlaj próbkę z maksymalną intensywnością do całkowitego wybielenia FM D. Przy użyciu obiektywu 20x czas od 30 do 45 minut powinien być wystarczający. Należy jednak pamiętać, że czas fotokonwersji zależy od intensywności oświetlenia, stopnia penetracji DAB do preparatu oraz zastosowanego obiektywu.

Po naświetleniu należy zbadać próbkę w świetle przechodzącym. Jeśli nastąpiła fotokonwersja, powinien być widoczny ciemnobrązowy osad. Należy wrócić do mikroskopu stereoskopowego, a następnie za pomocą nożyczek wyciąć z larwy miejsce, w którym doszło do fotokonwersji.

Powróć do stereomikroskopu sekcyjnego. Następnie za pomocą nożyczek wytnij z larwy obszar, który został zidentyfikowany na zdjęciu. Teraz, pracując pod dygestorium i stosując odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym rękawice i ochronę oczu, umieść próbkę w probówce do wirówki zawierającej PBS.

Przygotuj 300 µL 1%tlenku osmu na każdą próbkę. Następnie umieść próbkę w szklanej kolbie z plastikową zatyczką i dodaj przygotowany roztwór tlenku osmu w celu utrwalenia preparatu. Podczas inkubacji próbki przygotuj oddzielne roztwory zawierające 30, 50, 70, 90, 95 i 100% etanolu.

Przemyj próbkę od czterech do pięciu razy w roztworze PBS, po pięć minut każdego mycia. Po każdym myciu użyj plastikowego PE do pipety, aby przenieść próbkę do nowej kolby. Po ostatnim myciu przenieś próbkę do czystej kolby szklanej.

Następnie odwodnij próbkę, umieszczając ją w serii roztworów etanolu. Rozpocznij od inkubacji w 1 mL 30% etanolu. Po pięciu minutach usuń etanol za pomocą pipety Pasteura i zastąp go 1 mL 50% etanolu.

Kontynuuj odwadnianie, inkubując preparat złącza nerwowo-mięśniowego w roztworach 70%, 90%, a następnie 95%. Próbkę inkubuje się następnie w 95% roztworze etanolu dwa razy, a po odwadnianiu trzy razy w 100% etanolu. Dodaj dwa mililitry żywicy EIN w stosunku jeden do jednego do etanolu i umieść próbkę w inkubatorze rotacyjnym.

Od dwóch do czterech godzin w temperaturze pokojowej po rotacji w 100% ein, a następnie umieścić próbkę w otwartej kolbie, aby pozostały etanol odparował przez cztery do sześciu godzin. Wlać świeży EIN do formy. Dodać preparaty i inkubować w temperaturze 60 °C przez 36 godzin.

Po przygotowaniu preparatów zatopionych w EIN, należy użyć ultramikrotomu w celu wykonania przekrojów o grubości od 50 do 80 nanometrów przy użyciu noża diamentowego. Próbki są cięte na cienkie sekcje. Sekcje wypływają na kąpiel wodną noża, a następnie mogą zostać przeniesione na standardowe siatki EM.

Preparaty są teraz gotowe do obrazowania z wykorzystaniem konwencjonalnych procedur EM. Izolowane złącza nerwowo-mięśniowe z Drosophila Melan gaster zostały stymulowane wysokim stężeniem potasu, a zinternalizowane membrany zabarwiono przy użyciu FM 1 43, jak pokazano tutaj.

Fluorescencję zakończenia nerwowego można obserwować przy użyciu konwencjonalnego mikroskopu fluorescencyjnego w układzie epi. Podczas ciągłego oświetlania barwnik ulega całkowitemu wybieleniu, a przy dalszej iluminacji pojawia się czarny kolor w wyniku precypitacji dinobenzyny. To zakończenie nerwowe zawiera pęcherzyki synaptyczne, jednak żaden z nich nie został poddany fotokonwersji.

Może to być spowodowane niewystarczającym oświetleniem lub słabym przenikaniem DIA amino benzyny do tkanki. Z kolei zbyt silne oświetlenie skutkuje całkowitym przyciemnieniem obrazu, przez co pęcherzyki lub organelle stają się nierozpoznawalne; przy odpowiednim natężeniu oświetlenia widoczna jest fotokonwersja. Na tym mikrografie przedstawiono zakończenie presynaptyczne, w którym widoczna jest grupa ciemnych pęcherzyków, co wskazuje na fotokonwersję FM.

Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić fotokonwersję pęcherzyków synaptycznych znakowanych barwnikiem fem. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zawsze starannie kalibrować czasy naświetlania dla etapu konwersji. To wszystko.

Dziękujemy za oglądanie. Powodzenia w przeprowadzeniu eksperymentów.