Izolacja i namnażanie mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) szczura oraz separacja MSC pochodzących z pojedynczych kolonii

Mezenchymalne komórki macierzyste, w skrócie MSCs, są izolowane od samicy szczura szczepu rag dolly w wieku od sześciu do ośmiu tygodni i hodowane w 10 centymetrowej płytce Petriego, aż osiągną około 80% konfluencji. W celu wzbogacenia populacji MSCs, komórki barwi się przeciwciałami pierwszorzędowymi sprzężonymi z biotyną, a następnie stosuje kuleczki magnetyczne sprzężone ze streptawidyną. Tak oznakowane komórki są następnie rozdzielane na dwie frakcje – negatywną i pozytywną – za pomocą magnetycznego sortowania komórek (MACS).

Następnie przeprowadzono analizę cytometryczną w celu potwierdzenia ekspresji markerów powierzchniowych. Na koniec zastosowano cylindry do klonowania, aby uzyskać MSC pochodzące z pojedynczych kolonii. Cześć, jestem Lee z laboratorium Christiny Chang w Departamencie Inżynierii Chemicznej i Inżynierii Materiałowej na Uniwersytecie Michigan State.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę izolacji i namnażania komórek macierzystych chy oraz otrzymywania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania zachowań proliferacyjnych i różnicowania się czerwonych komórek macierzystych. Przejdźmy zatem do szczegółów.

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) zostaną wyizolowane z samicy szczura linii Sprague Dawley w wieku od sześciu do ośmiu tygodni. Aby rozpocząć tę procedurę, należy odciąć kości udowe oraz piszczele z tylnych kończyn uśpionego zwierzęcia. Należy usunąć skórę i mięśnie, umieścić wypreparowane kości udowe i piszczele w 70% izopropanolu na kilka sekund, a następnie przenieść je do 1X DPBS.

Poniższe kroki należy wykonać w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Najpierw przenieść kość udową i piszczelową do szalki o średnicy 10 centymetrów zawierającej DMEM. Następnie, przytrzymując każdą kość pęsetą, rozciąć nożyczkami oba końce.

Do strzykawki o pojemności 3 ml przymocuj igłę o rozmiarze 22 G i napełnij ją pożywką DMEM. Wprowadź igłę do jednego z otwartych końców kości i wypłucz szpik do probówki o pojemności 50 ml. Powtórz czynność dwa lub trzy razy dla każdej kości, aż do całkowitego pozyskania szpiku.

Ponownie zawiesić komórki, a następnie przepuścić zawiesinę komórkową przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm w celu usunięcia resztek kostnych i agregatów krwi. Odwirować komórki przy 200 ×g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Po usunięciu supernatantu za pomocą aspiracji, ponownie zawiesić komórki w 25 mL pożywki do wysiewu MSC.

10 ml zawiesiny komórkowej do każdej z dwóch szalek hodowlanych o średnicy 10 cm. Inkubować szalki w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jeden do dwóch tygodni. Gdy wcześniej wyizolowane MSC szczura osiągną konfluencję na poziomie około 80%, odessać medium i dodać od czterech do pięciu ml trypsyny EDTA do każdej szalki.

Przenieś szalki z powrotem do inkubatora i inkubuj przez około pięć minut. Aby umożliwić odklejenie komórek, dodaj taką samą ilość pożywki hodowlanej w celu inaktywacji trypsyny. Zbierz zawiesiny komórkowe do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj komórki przy 200 g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut.

W tej części zademonstrujemy wzbogacenie populacji MSCs za pomocą dwóch markerów powierzchniowych: CD 54 oraz CD 90. Wykorzystamy do tego magnes BD I, będący magnesem do separacji komórek firmy BD Biosciences. Należy rozpocząć od resuspensji osadu komórkowego w buforze do barwienia komórek do stężenia 20 milionów komórek na mililitr.

Następnie do zawiesiny komórkowej dodaj biotynilowane przeciwciało CD 54 oraz biotynilowane przeciwciało CD 90 i delikatnie wymieszaj; po inkubacji w lodzie przez 15 minut przemyj znakowane komórki nadmiarową objętością buforu BD IMAG 1X. Odwiruj znakowane komórki przy 200 $\times$g w temperaturze 4 °C przez pięć minut. Przygotuj cząsteczki streptawidyny BD imag, dokładnie wstrząsając je w wirówce typu vortex, a następnie dodaj 40 µL cząsteczek na każde 10 milionów komórek.

Dokładnie wymieszaj cząstki z znakowanymi komórkami i inkubuj komórki w temperaturze od 6 do 12 °C przez 30 minut. W czasie inkubacji opisz probówkę z okrągłym dnem, która posłuży do zbierania frakcji pozytywnej. Po zakończeniu inkubacji doprowadź objętość znakowania do stężenia 20 milionów komórek na mililitr.

Przy użyciu jednego buforu Expedia I mag. Przenieś znakowane komórki do probówki na zbiór frakcji pozytywnej. Umieść probówkę z frakcją pozytywną na magnesie BDI i pozostaw ją na sześć minut.

Następnie, gdy probówka z frakcją pozytywną wciąż znajduje się na magnesie BDI, należy usunąć nadsącz za pomocą szklanej pipety Pasteura. Następnie należy zdjąć probówkę z frakcją pozytywną z magnesu BDI i umieścić ją w lodzie. Należy dodać 1 mL schłodzonego do temperatury 4°C buforu XBDI mag i resuspendować komórki poprzez delikatne mieszanie.

Umieścić probówkę ponownie na magnesie BDI i pozostawić na dwie do czterech minut. Usunąć supernatant za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Powtórzyć płukanie zgodnie z wcześniejszym opisem.

Powtórz czynność jeszcze raz. Na koniec usuń nadpłyn za pomocą nowej szklanej pipety Pasteura. Następnie wyjmij probówkę z urządzenia magnetycznego BDI.

Resuspenduj komórki w 1 mL pożywki hodowlanej i przenieś zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 50 mL zawierającej 25 mL pożywki. Przenieś komórki do kolby kwadratowej o wymiarach 175 cm² w celu ich utrzymania oraz do szalki 10 cm do cytometrii przepływowej.

Aby rozpocząć procedurę separacji MSC pochodzących z pojedynczych kolonii, wysiej komórki w zagęszczeniu od 50 do 100 komórek na płytkę 10 cm i inkubuj w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez jeden do dwóch tygodni. W tym okresie od jednego do dwóch tygodni obserwuj dobrze odseparowane kolonie za pomocą mikroskopu odwróconego. Gdy kolonie osiągną wystarczający rozmiar, przekraczający 100 komórek w każdej kolonii, zaznacz je markerem niezmywalnym na spodzie płytki.

Podczas wyboru kolonii do oznakowania należy upewnić się, że w jej pobliżu nie znajdują się inne kolonie. Odessać pożywkę i raz przemyć szalkę przy użyciu X-D-P-B-S, posługując się pincetą. Pobrać sterylny cylinder do klonowania i ostrożnie umieścić go wokół oznakowanej kolonii.

Powtarzaj tę czynność, aż nad każdą zaznaczoną kolonią zostanie umieszczony cylinder do klonowania. Do każdego cylindra dodaj 100 µL trypsyny EDTA i przenieś szalkę z powrotem do inkubatora. Po pięciu minutach sprawdź pod mikroskopem, czy komórki zaokrąglają się.

Gdy komórki się odkleją, dodaj taką samą ilość pożywki hodowlanej, aby zneutralizować trypsynę. Wymieszaj zawiesinę komórkową za pomocą mikropipety 200 µL, a następnie przenieś zawiesinę do szalki 60 mm zawierającej 3 mL uprzednio ogrzanej pożywki hodowlanej. Opisz szalki i umieść je z powrotem w inkubatorze po ich izolacji jako komórki adherentne do plastiku.

MSCs powinny być widoczne następnego dnia po wysiewaniu. W miarę dalszej proliferacji komórek, konfluencja powinna przypominać obraz widoczny w tym kontraście fazowym, gdzie większość komórek ma kształt wrzecionowaty lub gwiaździsty. Przeniesienie hodowli jest wskazane, gdy komórki osiągną około 80% konfluencji.

Po trypsynizacji oddzielone komórki powinny mieć okrągły kształt i unosić się w medium. Po wzbogaceniu populacji MSC za pomocą magnetycznej separacji komórek przeprowadzana jest cytometria przepływowa w celu weryfikacji ekspresji markerów powierzchniowych. Jeśli wzbogacenie przebiegło pomyślnie, komórki powinny wykazywać pozytywne barwienie dla markerów MSC, CD 54 i CD 90, ale negatywne dla markera HSC CD 45; jako kontrole negatywne stosuje się kontrole izotypowe IgG two A i IgG one.

Gdy komórki są osadzone z odpowiednią gęstością klonalną, powinny powstać kolonie wywodzące się z pojedynczych komórek, jak pokazano w tym przykładzie. Następnie można użyć cylindrów do klonowania, aby odseparować kolonie, a komórki pochodzące z tych kolonii można hodować oddzielnie. W tych dwóch przykładach komórki pochodzące z jednej kolonii mają wrzecionowaty kształt, podczas gdy komórki pochodzące z drugiej kolonii są okrągłe.

Przedstawiliśmy sposób izolacji i wzbogacania przypadkowych oraz powszechnych komórek macierzystych, a także metodę otrzymywania komórek pochodzących z pojedynczych kolonii. Podczas tej procedury ważne jest pamiętanie o usunięciu skrzepów krwi i resztek kostnych w trakcie izolacji. Należy zastosować optymalną ilość przeciwciał podczas wzbogacania oraz dokładnie oznaczać dobrze wyizolowane kolonie podczas separacji kolonii.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.