Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Niniejszy protokół wykorzystuje regulowany promotor, który umożliwia kontrolowaną ekspresję białek. W tym doświadczeniu stosujemy wysokokopiowy plazmid typu 2-mikronowe, który wykazuje ekspresję domeny N2 pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę. Przekształcone zostają za jego pomocą komórki drożdży typu dzikiego.

Plazmidy i transformanty wyselekcjonowano na płytkach pozbawionych uol. Po nocnej inkubacji w pożywce selektywnej komórki zsynchronizowano poprzez zahamowanie wzrostu indukowane brakiem kortyzolu.

Wreszcie, ekspresja jest indukowana poprzez przeniesienie komórek do pożywki pozbawionej metioniny podczas eksperymentu w szeregu czasowym. Stężenie białka monitoruje się za pomocą techniki western blotting, a rozwój fenotypu morfologicznego za pomocą mikroskopii. Cześć, jestem Claudia z Wydziału Nauk Biologicznych Uniwersytetu Purdue.

Nazywam się Bari Muji i pracuję w laboratorium AL. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy rozwoju fenotypu morfologicznego w zależności od stężenia białka w indukcie ciała. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium do badania morfologicznych i molekularnych aspektów fenotypu podziału komórkowego, który obserwuje się podczas nadekspresji domeny N2 endocytycznego białka adaptacyjnego absent two.

Zacznijmy zatem. Niniejszy protokół rozpoczyna się od konstrukcji szczepu drożdży, który będzie wykazywał ekspresję białka będącego przedmiotem zainteresowania. W naszym przypadku przeprowadzono transformację szczepu drożdży typu dzikiego W 3 0 3 plazmidowym DNA o wysokiej liczbie kopii, zawierającym nth two pod kontrolą promotora tłumionego przez metioninę; 2 mM metioniny hamuje aktywność promotora met 25.

Podczas gdy pożywka pozbawiona metioniny pozwala na maksymalną ekspresję, wybierz sześć kolonii z szalki zawierającej niedawno przekształcone komórki i zaszczep w 50 ml pożywki selektywnej z 0,2 mM metioniny w kolbie stożkowej; inkubuj przez noc w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM. Następnego ranka oszacuj gęstość komórek, mierząc gęstość optyczną kultury przy 600 nm. Przenieś odpowiednik 20 OD 600 nm na ml komórek do sterylnej probówki do wirowania i zbierz je poprzez odwirowanie.

Resuspenduj komórki w pożywce YPD, mieszając je na wortexie, aby zsynchronizować cykl komórkowy do końcowego stężenia 15 µg/mL, korzystając z roztworu stokowego o stężeniu 1 mg/mL w DMSO. Inkubuj przez cztery godziny w temperaturze 30 °C przy wstrząsaniu z prędkością 200 RPM. Po czterech godzinach sprawdź odsetek komórek zatrzymanych w fazie mitozy.

Po obejrzeniu preparatu pod mikroskopem i policzeniu liczby komórek z pączkami o tej samej wielkości, należy przejść do następnego kroku. Tylko w przypadku, gdy zatrzymanie przekracza 90%, zebrać komórki poprzez wirowanie przy 2200 RPM przez pięć minut. Po trzykrotnym przemyciu lodowatą wodą, zawiesić osad w pożywce selektywnej pozbawionej metioniny, przy gęstości komórkowej wynoszącej około 0,5 OD 600 nanometrów na mililitr.

Przenieś połowę objętości komórek do nowej sterylnej probówki i dodaj metioninę do końcowej stężenia 0,2 millimolar. Służyć to będzie jako kontrola efektów wynikających z podstawowego poziomu ekspresji białek. Wróć obie kultury do inkubatora ustawionego na 30 stopni Celsjusza.

Komórki analizuje się pod kątem rozwoju fenotypu co godzinę przez sześć godzin w każdym punkcie czasowym. Przenieś jeden mililitr zawiesiny komórkowej z każdej hodowli do sterylnej probówki do wirowania i odwirowuj komórki, odessaj nadsącz i resuspenduj osad w 70 µL pożywki. Następnie dodaj 30 µL błękitu metylowego z roztworu zapasowego o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej wodzie.

Następnie nanieś pipetą około 6 µL tej zawiesiny na czystą szkiełko przedmiotowe i przykryj kroplę szkiełkiem cover slip. Delikatnie dociśnij szkiełko cover slip, aby utworzyć cienką, jednorodną warstwę komórek między szklanymi powierzchniami. Podziel pole pod szkiełkiem cover slip na dziewięć kwadrantów i wykonaj trzy zdjęcia z każdego kwadrantu.

Liczba komórek w jednym polu nie powinna przekraczać 30, aby umożliwić dokładną kwantyfikację. Należy policzyć liczbę komórek wykazujących badany fenotyp, którymi w tym przykładzie są pączkujące komórki drożdży z wydłużonymi i/lub złączonymi pączkami, które nie oddzieliły się od siebie. Liczymy również liczbę martwych komórek, zidentyfikowanych po niebieskim kolorze, ponieważ defekt podziału komórkowego został wywołany przez nth.

Nadekspresja prowadzi do śmierci komórek, co pozwala na wizualizację specyficznych defektów fenotypowych w każdym punkcie czasowym. Do sterylnej probówki do wirówki przeniesiono 1 mL kultury i zebrano komórki poprzez wirowanie. Osad komórkowy zawieszono w 100 µL roztworu Calwhite o stężeniu 1 mg/mL w sterylnej wodzie i inkubowano przez pięć minut w temperaturze pokojowej, w ciemności.

Barwienie bielą wapniową umożliwia wizualizację ściany komórkowej. Osad należy przemyć trzykrotnie 1×PBS. Ostateczny osad zawiesza się w 100 µL PBS.

Obserwuj komórki pod mikroskopem i wykonaj zdjęcia przy powiększeniu 100x, używając optyki UV do wizualizacji ściany komórkowej. Aby zwizualizować septynę znakowaną GFP, wykonaj zdjęcia przy użyciu filtra FS E. Ilościowo określ odsetek komórek z defektami ściany komórkowej i nieprawidłową lokalizacją septyny, stosując wcześniej opisaną metodę polegającą na podzieleniu szkiełka podstawowego na dziewięć kwadrantów i wykonaniu trzech zdjęć na każdy kwadrant w celu przeliczenia. Mikroskopia pojedynczych komórek drożdży wymaga zastosowania podłoży agarowych z zatopionym medium; aby przygotować podłoże agarowe.

Najpierw należy oczyścić szkiełko przedmiotowe z wgłębieniem za pomocą 70% alkoholu i pozostawić do wyschnięcia. W tym czasie w mikrofalówce należy zagotować 0,06 g agros w 5 ml selektywnego podłoża pozbawionego metioniny, aż do całkowitego i szybkiego rozpuszczenia agros. Następnie na szkiełko należy nanieść pipetą 200 µl pożywki zawierającej agros.

W zagłębieniu należy odwrócić kolejne czyste szkiełko przedmiotowe, upewniając się, że pod spodem nie pozostały pęcherzyki powietrza. Po zestaleniu żelu należy płynnym ruchem przesunąć górne szkiełko w stronę przeciwną do szkiełka z zagłębieniem, przez cały czas utrzymując równoległość ich powierzchni. Zapewnia to, że powierzchnia warstwy agarozy jest zlicowana z powierzchnią szkiełka z zagłębieniem.

Oczyść obszar slajdu wokół łoża agarowego delikatną chusteczką. Slajd jest teraz gotowy do użycia po upływie czterech godzin. Przenieś 1 mL komórek z hodowli do sterylnej probówki typu microfuge i zbierz je poprzez wirowanie.

Odssać supernatant i zawiesić komórki ponownie w 100 µL świeżej pożywki selektywnej pozbawionej metioniny. Na krawędziach szkiełka nakrywnego nanieść wazelinę. Następnie nanieść kroplę zawiesiny komórkowej na środek warstwy agarosy i rozprowadzić ją równomiernie, delikatnie dociskając szkiełko nakrywne.

Uszczelnij krawędzie szkiełka nakrywki i utrwal jego pozycję, smarując brzegi lakierem do paznokci. Po wyschnięciu lakieru umieść preparat na podgrzewanym stole mikroskopu. Używamy mikroskopu Zeiss Axio 200 M wyposażonego w monochromatyczną cyfrową kamerę Zeiss Axio camm, MRM, aby wybrać pole widzenia zawierające nie więcej niż 10 komórek w odpowiednich odstępach, ponieważ z czasem pole to stanie się zbyt gęste.

W miarę podziału komórek należy wykonywać zdjęcie pola widzenia co pięć minut przez około pięć godzin. Aby uniknąć wielokrotnej korekty ostrości, programujemy oprogramowanie do akwizycji obrazów tak, aby automatycznie pobierało kilka obrazów w osi Z w każdym punkcie czasowym.

Obraz z najlepszą ostrością zostanie wybrany później do montażu filmu. Aby zapewnić komórkom odpowiednią temperaturę, oprócz podgrzewanych stołików zastosowano zewnętrzne źródło ciepła, pozostawiając włączone prześwietlające białe światło mikroskopu przez cały czas obrazowania. Regresję fenotypową można badać poprzez montaż obrazów w film przy użyciu oprogramowania Image J. Poniżej przedstawiono reprezentatywne wyniki nadekspresji badanego białka. Numer dwa.

W pierwszej kolejności określono ekspresję białka nth two w trakcie przebiegu eksperymentu. Lizaty z komórek wykazujących ekspresję HA nth two analizowano metodą western blotting przy użyciu monoklonalnego przeciwciała anty-HA. Jak pokazuje immunoblot, komórki hodowane w obecności 0,2 mM metioniny wykazują minimalną ekspresję białka. Natomiast komórki hodowane w pożywce pozbawionej metioniny wykazują stały wzrost stężenia S two w czasie trwania eksperymentu.

Następnie przeanalizowano komórki hodowane przez sześć godzin w obecności lub przy braku metioniny, ponieważ niskie stężenie nth dwa nie jest w stanie wywołać fenotypu podziału komórkowego lub wyłącznie śmierci komórkowej. Niewielki odsetek komórek jest martwy, co wskazuje ich niebieski kolor po barwieniu błęknitem metylenowym. Analogicznie, liczba jąder na komórkę, ściana komórkowa oraz organizacja septyn są prawidłowe, zgodnie z oczekiwaniami.

W przeciwieństwie do tego, nadekspresja M2 prowadzi do masywnego defektu podziału komórkowego i śmierci komórek, co objawia się obecnością długich łańcuchów połączonych, wydłużonych pączków, które zachowują niebieski kolor po barwieniu błękitem metylenowym. Większość komórek fenotypowych jest wielojądrowa, co wykazuje barwienie DPI. Barwienie Calcofluor white wykazuje obecność skupisk nieprawidłowych fragmentów ściany komórkowej.

Ponadto septyna jest w dużym stopniu błędnie zlokalizowana i zdezorganizowana. Ilościowe określenie fenotypu w funkcji czasu przedstawiono na tym wykresie, gdzie otwarte kółka reprezentują 0 mM metioniny, a pełne kółka reprezentują 0,2 mM metioniny. Widzimy tutaj, że wraz z narastaniem stężenia nth two w komórkach w czasie, rośnie odsetek komórek wykazujących fenotyp podziału komórkowego.

Komórki kontrolne hodowane w obecności 0,2 mM metioniny wykazują, że rozwój fenotypu jest funkcją podwyższonego stężenia białka, a nie warunków hodowli komórkowej. Na koniec rozwój fenotypu po nadekspresji nth dwa został utrwalony za pomocą mikroskopii wideo time-lapse.

Po czterech godzinach nth, dwie komórki z nadekspresją wykazują łagodny fenotyp morfologiczny podziału komórkowego. W miarę trwania filmu obserwujemy nieprawidłowe i wydłużone okresy wzrostu pączka apikalnego, co prowadzi do powstania bardzo wydłużonych pączków. Obserwujemy również przypadki pojawiania się nowych pączków przed wystąpieniem procesu separacji komórek.

Dodatkowo zaobserwowano, że pąki wyłaniają się z kilku obszarów komórki macierzystej, co prowadzi do powstania wyglądu rozgałęzionego. Właśnie pokazaliśmy, jak charakteryzować i analizować rozwój fenotypu morfologicznego w zależności od stężenia białka w drożdżach pączkujących. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o pelletowaniu komórek przy zalecanych prędkościach wirowania, ponieważ zbyt wysokie prędkości mogą uszkodzić komórki.

Ważne jest również pamiętanie o dodaniu błękitu metylenowego i chlorku bezpośrednio przed obrazowaniem, ponieważ są one toksyczne dla komórek linii Light East. Dziękujemy za oglądanie i powodzenia w eksperymentach.