Protokół identyfikacji gatunków ryb w oparciu o DNA

System identyfikacji gatunków ryb to prosta, szybka i dokładna metoda oparta na analizie DNA, służąca do identyfikacji gatunków ryb obecnych w danej próbce. Próbki ryb są traktowane proteinazą K w celu uwolnienia kwasów nukleinowych do roztworu. Następnie izoluje się genomowe DNA ryb i poddaje je amplifikacji PCR przy użyciu starterów wiążących się z sekwencjami występującymi we wszystkich genomach ryb.

Produkty PCR są następnie trawione trzema różnymi enzymami restrykcyjnymi i rozdzielane na bioanalizatorze Agilent 2100. Długości fragmentów powstałych w reakcjach trawienia mogą zostać wykorzystane do określenia gatunku ryby za pomocą polimorfizmu długości fragmentów restrykcyjnych lub oprogramowania do dopasowywania wzorów RFLP. Cześć, jestem Rachel Formosa z Agilent Technologies.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę identyfikacji gatunków ryb w oparciu o analizę DNA. Procedura ta jest metodą przesiewową, która pozwala na identyfikację gatunków ryb obecnych w próbkach świeżych, mrożonych, mielonych, gotowanych, suszonych lub przetworzonych w inny sposób. Cały proces można zrealizować w czasie krótszym niż jeden dzień roboczy.

Niniejszą procedurę stosujemy do badania autentyczności owoców morza, co jest niezwykle istotne dla branży rybnej, ponieważ podstawianie gatunków oraz błędne etykietowanie mogą mieć znaczące konsekwencje ekonomiczne, środowiskowe oraz w zakresie bezpieczeństwa żywności. Ponadto identyfikacja gatunków ryb na podstawie wyglądu oraz innych tradycyjnych metod może być szczególnie trudna. Po przetworzeniu ryby badania DNA dostarczają znacznie bardziej dokładnych i wiarygodnych wyników.

Zacznijmy zatem. Rozpocznij przygotowywanie próbek do ekstrakcji DNA, umieszczając od 10 do 1000 mg każdej próbki surowej lub gotowanej tkanki ryb w probówkach do mikrocentryfugi o pojemności 1.5 ml dla każdej ryby. Dodaj 220 µL świeżo przygotowanego roztworu proteinazy K i wymieszaj poprzez pipetowanie w górę i w dół.

Inkubować probówki w temperaturze 65 °C przez 10 minut, a następnie wirować przez trzy do pięciu minut przy 14 000 G, aby zbić na dno wszystkie niestrawione tkanki. Następnie ostrożnie przenieść 150 µL każdego supernatantu do nowej probówki o pojemności 1,5 ml, unikając pobierania materiału niestrawionego z dna oraz warstwy tłustej znajdującej się na górze. Supernatant zostanie teraz wykorzystany do ekstrakcji genomicznego DNA.

Ekstrakcję genomowego DNA rozpocznij od dodania 500 µL buforu wiążącego kwasy nukleinowe do każdej próbki. Spowoduje to zwiększenie całkowitej objętości próbki do 650 µL. Próbki mieszaj w wortexie do uzyskania homogenicznej zawiesiny.

Następnie należy przenieść każdą próbkę do kolumienki wiążącej DNA, która została umieszczona w jednej z dostarczonych w zestawie probówek o pojemności 2 ml. Następnie należy zatrzasnąć nakrętkę probówki na górnej części kolumienki. Próbki należy wirować przez jedną minutę przy 14 000 G, aby załadować DNA na matrycę kolumienki.

Po wirowaniu wyjmij kubeczki do wirowania, odlej filtrat i umieść kubeczki z powrotem w probówkach zbiorczych. Dodaj 500 µL buforu do płukania z wysokim stężeniem soli (1x). Zakręć probówki i ponownie poddaj je wirowaniu po zakończeniu wirowania.

Odlać filtrat i ponownie umieścić kolumienki wirówkowe w probówkach zbiorczych. Następnie dodać 500 µL 80% etanolu. Zamknąć probówkę zakrętką i wirować z prędkością 14,000 G przez jedną minutę.

Powtórz płukanie etanolem jeszcze dwa razy po trzecim płukaniu w 80% etanolu, a następnie odrzuć filtraty. Umieść wirówki w probówkach odbiorczych i tym razem wiruj przez dwie minuty, aby osuszyć matrycę włókien. Następnie przenieś wirówki do probówek zbierających o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj 100 µL buforu elucyjnego do każdego spin cupa, bezpośrednio na matrycę z włókien wewnątrz naczynia. Następnie zatrzaśnij nakrętki probówek do zbierania na spin cupach i inkubuj je w temperaturze pokojowej przez jedną minutę. Po inkubacji wiruj próbki z maksymalną prędkością przez jedną minutę.

Następnie należy wyrzucić wkładkę wirówki i zakręcić probówki. Jeśli zmierzy się stężenia DNA, spodziewane są wartości w zakresie od 5 ng/µL do 500 ng/µL. DNA można teraz przechowywać w temperaturze 4 °C do jednego miesiąca; w celu długoterminowego przechowywania należy umieścić DNA w temperaturze -20 °C lub -80 °C.

Przeprowadź reakcję PCR, korzystając z primerów i odczynników zawartych w zestawie odczynników P-C-R-R-F-L-P. Zgodnie z dołączonym protokołem pisemnym zaleca się analizę każdej próbki, w tym kontroli pozytywnej i kontroli bezmatrycowej, w dwóch powtórzeniach podczas przebiegu PCR. Przygotuj mieszaniny master mix enzymów restrykcyjnych do trawień z użyciem DTE E one HAE three oraz NL three, łącząc kolejno następujące składniki: 1,5 µL sterylnej wody destylowanej, 0,5 µL buforu enzymatycznego 10 x oraz 0,5 µL enzymu 10 x.

Przygotować mieszaninę odczynników fourex three w ilości wystarczającej dla wszystkich próbek oraz jednej dodatkowej objętości reakcyjnej. Następnie rozdzielić 2,5 µL do każdej probówki reakcyjnej opisanej nazwą próbki i enzymu. Po zakończeniu reakcji PCR wyjąć próbki z termocyklera i umieścić je w lodzie.

Do każdej z trzech probówek z trawieniem restrykcyjnym dla danej reakcji dodać 2,5 µL każdego produktu PCR. DDE jedna, HAE trzy oraz NLA trzy. Następnie wymieszać w wortexie.

Krótko odwiruj i inkubuj mieszaniny trawienne w temperaturze 37 °C przez dwie godziny. Jeśli jest to bardziej dogodne, inkubację można przeprowadzić przez noc. Po trawieniu inkubuj reakcje w temperaturze 65 °C przez 15 minut.

Następnie do każdej probówki należy dodać 1 µL 60 mM EDTA w celu przerwania reakcji i wymieszać na wortexie. Korzystając z zestawu odczynników do bioanalizatora Agilent, należy przygotować produkty trawienia restrykcyjnego i nanieść je do dołków chipa DNA zgodnie z instrukcją do zestawu. W przypadku każdej próbki wszystkie trzy trawienia powinny zostać naniesione na ten sam chip.

Następnie należy wymieszać chip w wortexie i wprowadzić go do urządzenia. Po zakończeniu analizy należy przejść do kontekstu testu i wybrać kartę podsumowania chipa. W polu nazwy próbki należy wprowadzić nazwę próbki dla wszystkich 12 studni chipa, aby zidentyfikować gatunki ryb dla testowych próbek DNA.

Uruchom program dekodujący RFLP, klikając plik. Następnie otwórz plik XAD. Pojawi się okno dialogowe otwierania.

Teraz należy wybrać plik XAD dla użytego chipu DNA. Następnie kliknij „Open”, aby wyświetlić listę próbek załadowanych na chip. Wybierz trzy trawienia odpowiadające pierwszej próbce DNA.

W kolumnie enzym określ enzymy restrykcyjne, które zostały użyte w polu opisanym jako min peak height as percent of lower marker. Wartość domyślna to 10%, jeśli jest wymagana. Wartość tę można obniżyć, aby zidentyfikować pominięte małe piki, lub podwyższyć, aby odrzucić piki wynikające z niespecyficznego szumu w elektroferogramie.

Po wprowadzeniu wszelkich korekt wartości minimalnej wysokości piku, kliknij reintegrate. Następnie kliknij calc w dolnej części okna dialogowego. Dane dotyczące długości fragmentów uzyskane z analizy bioanalizatorem zostaną automatycznie wprowadzone do pól oprogramowania.

Następnie z rozwijanej listy wyników w lewym górnym rogu ekranu wybierz dice. Jeśli próbka ryb składa się z jednego gatunku ryb lub mieszaniny, a w przypadku gdy próbka może być mieszaniną, tabela na dole ekranu o nazwie combined score list. Najlepsze dopasowania gatunków na podstawie wyników wszystkich trzech reakcji trawienia.

Idealne dopasowania z wynikiem jeden są wyróżnione na zielono. Bliskie dopasowania są wyróżnione na żółto w górnej części ekranu. Dolna wartość progowa określa minimalną wielkość fragmentu użytego w analizie, a wartość tolerancji dopasowania określa, jak bliska długości fragmentu przewidywanego musi być długość fragmentu, aby został on uznany za dopasowanie.

Wyświetlone wartości są ustawieniami domyślnymi i mogą zostać zmienione. Powtórz te kroki w celu analizy pozostałych próbek DNA znajdujących się na końcówce. Próbki DNA od czterech różnych gatunków ryb zostały wyizolowane, powielone i poddane trawieniu zgodnie z metodą opisaną w tym filmie.

Przedstawiono obraz żelu z bioanalizatora dla próbek po trawieniu restrykcyjnym, uzyskany przy użyciu urządzenia Agilent Bioanalyzer i dekodera RFLP. Do identyfikacji gatunków ryb zastosowano wzorce zakrzywień generowane przez oprogramowanie. Pierwsza próbka została prawidłowo zidentyfikowana jako pstrąg, druga jako tuńczyk, a trzecia jako ryba skalna.

Ostatnia próbka służy jako specyficzny kod. Właśnie zaprezentowaliśmy, jak przeprowadzić identyfikację gatunków ryb w oparciu o DNA, wykorzystując metodę P-C-R-R-F-L-P firmy Agilent. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest unikanie zanieczyszczeń krzyżowych próbek, ponieważ metoda ta jest bardzo czuła.

To wszystko. Teraz wiedzą już Państwo, jak szybko, łatwo i dokładnie zidentyfikować gatunki ryb obecne w próbkach. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.