Przygotowanie oligomerów β-amyloidu1-42 i indukcja upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa
14 lipca 2010
Jedną z cech choroby Alzheimera jest podwyższony poziom peptydu Aβ1-42. W niniejszym materiale przedstawiamy protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ1-42, które upośledzają długotrwałe wzmocnienie synaptyczne w hipokampie, będące komórkowym korelatem pamięci. Procedura ta jest przydatna do badania mechanizmów patologii indukowanej przez Aβ oraz do przesiewowego badania leków.
Syntetyczny beta amyloid 1 42 zostaje resuspendowany w HFIP w celu monomeryzacji peptydu, a następnie skoncentrowany do postaci filmu w celu oligomeryzacji. Film zostaje RESUSPENDOWANY w DMSO, rozcieńczony w buforze fosforanowym i inkubowany przez noc. Na koniec peptyd oligomeryczny zostaje rozcieńczony buforem rejestrującym i perfundowany na świeże skrawki hipokampa, gdzie ocenia się wpływ ekspozycji na beta amyloid na plastyczność synaptyczną.
Witamy w laboratorium Avio Orio na Uniwersytecie Columbia w Nowym Jorku. Dziś przedstawimy zoptymalizowaną przez nas procedurę przygotowania oligomerów beta-amyloidu, która opiera się na protokole pierwotnie zaproponowanym przez Steina i współpracowników w 2003 roku. W tym laboratorium wykorzystujemy tę procedurę do badania dysfunkcji synaptycznych indukowanych przez beta-amyloid.
Zacznijmy zatem. Pozostaw fiolkę z liofilizowanym proszkiem beta-amyloidu w temperaturze pokojowej przez 30 minut, aby uniknąć kondensacji po otwarciu jej pod wyciągiem.
Zamknąć fiolkę i wymieszać na wirówce typu vortex; za pomocą strzykawki Hamiltona szybko podzielić roztwór w równych częściach pomiędzy trzy polipropylenowe probówki do mikrocentryfugi o niskim stopniu wiązania. Zamknąć probówki i inkubować przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, aby umożliwić stabilizację peptydów; otworzyć probówki i umieścić je w koncentratorze próżniowym (SpeedVac) w celu zagęszczenia roztworu. Wirować z prędkością 800 Gs pod próżnią przez około 15 minut.
Należy upewnić się, że temperatura nie przekroczy 25 °C, aby uniknąć degradacji białek. Wirowanie jest zakończone, gdy na dnie probówki pojawi się przejrzysta, sucha warstwa peptydowa. Warstwa ta może być trudna do zauważenia; należy zamknąć probówki i przechowywać niewykorzystane alikwoty w temperaturze -80 °C przez maksymalnie sześć miesięcy. W dygestorium należy resuspender warstwę peptydową w DMSO do końcowego stężenia 5 mM, a następnie poddać działaniu myjki ultradźwiękowej w łaźni wodnej przez 10 minut.
Aby zapewnić całkowite resuspensowanie peptydu, należy przechowywać alikwoty po 1,6 µL roztworu beta-amyloidu o stężeniu 5 mM w temperaturze -20 °C. Każda alikwota powinna zostać rozmrożona tylko raz; w dniu poprzedzającym eksperyment rozmrozić jedną alikwotę roztworu beta-amyloidu 5 mM i dodać 98,4 µL sterylnego buforu fosforanowego do uzyskania końcowej objętości 100 µL, wymieszać w wstrząsarce wortex przez 30 sekund i inkubować w temperaturze 4 °C przez 12 godzin. Aby umożliwić rozpoczęcie agregacji przed eksperymentem, inkubować świeży lizat hipokampa przez 90 minut.
W standardowym buforze rejestracyjnym elektrodę stymulującą umieszcza się na kolaterałach Shafera, a elektrodę rejestrującą na stratum radium. Po uzyskaniu odpowiedzi i ustabilizowaniu linii bazowej przez 10 minut, należy rozcieńczyć beta-amyloid do stężenia 200 nano molar. W buforze rejestracyjnym beta-amyloid wiąże się nieswoiście ze szkłem, dlatego należy w maksymalnym stopniu wykorzystywać tworzywa sztuczne.
Przez 20 minut perfunduj plastry roztworem beta-amyloidu. Zastosuj preferowaną stymulację tonu X. Na przykład, w przypadku stymulacji theta burst bezpośrednio po tetanizacji, powróć do perfuzji standardowym buforem rejestracyjnym.
Monitoruj zapis przez co najmniej dwie godziny po tężcu, aby potwierdzić indukcję LTP i zaobserwować efekty działania beta-amyloidu. Właśnie pokazaliśmy, jak przygotować oligomeryczny beta-amyloid 1-42 w celu indukcji upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że nadmierne wysuszenie filmu peptydowego może prowadzić do niepełnej agregacji.
Kluczowe jest również stosowanie tworzyw sztucznych w przypadku roztworów beta-amyloidu, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu peptydów. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia protokół przygotowania syntetycznych oligomerów Aβ 1-42, o których wiadomo, że upośledzają one długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (Long-Term Potentiation) w hipokampie, będące kluczowym mechanizmem związanym z pamięcią. Procedura ta jest niezbędna do badania patologii indukowanej przez Aβ oraz do celów przesiewania leków.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórkowa
- Badania nad chorobą Alzheimera
Wprowadzenie
- Choroba Alzheimera charakteryzuje się podwyższonym poziomem peptydu Aβ 1-42.
- Oligomery Aβ 1-42 są powiązane z dysfunkcją synaptyczną.
- Długotrwałe wzmocnienie synaptyczne (LTP) jest komórkowym korelatem pamięci.
- Zrozumienie wpływu Aβ może pomóc w opracowywaniu leków.
Cel badania
- Aby przedstawić szczegółowy protokół syntezy oligomerów Aβ 1-42.
- Aby zbadać mechanizmy upośledzenia synaptycznego indukowanego przez Aβ.
- Aby ułatwić przesiewową analizę leków pod kątem potencjalnych terapii choroby Alzheimera.
Zastosowane metody
- Resuspensja syntetycznego beta-amyloidu w HFIP.
- Koncentracja peptydu do postaci filmu w celu ligandyzacji.
- Resuspensja w DMSO i inkubacja w buforze fosforanowym.
- Ocena ekspozycji beta-amyloidu na ostrych skrawkach hipokampa.
Główne wyniki
- Przygotowane oligomery Aβ 1-42 skutecznie upośledzają plastyczność synaptyczną.
- Protokół ten pozwala na uzyskanie powtarzalnych wyników w badaniu dysfunkcji synaptycznych.
- Wyniki przyczyniają się do zrozumienia roli Aβ w patologii choroby Alzheimera.
- Potencjalne zastosowania w przesiewaniu leków do leczenia choroby Alzheimera.
Wnioski
- Protokół syntezy oligomerów Aβ 1-42 jest skuteczny i niezawodny.
- Badanie to pogłębia zrozumienie wpływu Aβ na procesy związane z pamięcią.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tych wynikach w celu zbadania opcji terapeutycznych.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Upośledzenie plastyczności synaptycznej hipokampa indukowane oligomerycznym β-amyloidem1-42 stanowi solidny, istotny z punktu widzenia choroby model do badań nad wczesnym stadium choroby Alzheimera. Paradygmat ten umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka oraz zwiększenie pewności predykcyjnej w walidacji celów terapeutycznych i przesiewaniu związków pod kątem dysfunkcji synaptycznych. Podejście to wspiera selekcję projektów w portfolio poprzez wyjaśnienie translacyjnego znaczenia potencjalnych interwencji ukierunkowanych na patologię wywołaną przez amyloid.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Umożliwia badanie dysfunkcji synaptycznych wywołanych przez amyloidy w kontrolowanym systemie ex vivo.
- Wspiera funkcjonalną walidację celów poprzez ilościowe określenie upośledzenia LTP po ekspozycji na oligomeryczne β-amyloid.
- Ułatwia weryfikację mechanizmów w ramach hipotez dotyczących choroby Alzheimera na poziomie synaptycznym.
- Zapewnia platformę pozwalającą na uzyskanie wiarygodnych wyników prognostycznych podczas oceny związków we wczesnych etapach badań.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Ustanawia powtarzalny test do ilościowego określania upośledzenia plastyczności synaptycznej w skrawkach hipokampa.
- Standaryzuje przygotowanie i aplikację oligomerycznego β-amyloidu w celu uzyskania spójnych wyników testu.
- Umożliwia wiarygodną ocenę związków kandydackich pod kątem ich zdolności do łagodzenia zaburzeń LTP.
- Wspiera skalowalność i ponowne wykorzystanie platformy w ramach inicjatyw wysokoprzepustowego przesiewu.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z mechanizmami istotnymi dla choroby, które są zaangażowane we wczesną patologię choroby Alzheimera.
- Zapewnia ciągłość od stopnia zaangażowania celu molekularnego do funkcjonalnych wyników synaptycznych.
- Umożliwia podejmowanie decyzji o dalszym rozwoju z uwzględnieniem ryzyka poprzez powiązanie efektów działania związku z translacyjnymi biomarkerami stanu zdrowia synaps.
- Wspiera wybór i walidację modeli przedklinicznych dla późniejszych badań in vivo.
Integracja rurociągów i przepływów pracy
Metoda ta stanowi pomost pomiędzy wczesną fazą odkryć a walidacją przedkliniczną, umożliwiając testowanie hipotez, ograniczanie ryzyka związanego z celem terapeutycznym oraz ilościową ocenę funkcji synaptycznej w odpowiedzi na ekspozycję na amyloidalne białka.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia weryfikację hipotezy zerowej w zakresie indukowanego przez amyloid upośledzenia synaptycznego oraz wyjaśnienie powiązań w szlakach sygnałowych.
- Przesiewy: Dostarcza standaryzowany, powtarzalny test do oceny związków w kontekście zaburzeń LTP.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty plastyczności synaptycznej dla wiarygodnego porównania statystycznego między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki ex vivo z biomarkerami istotnymi dla choroby oraz przedklinicznymi punktami końcowymi.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje powtarzalny schemat postępowania dla ciągłej walidacji celów i kampanii przesiewowych w portfelach badań nad neurodegeneracją.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną w walidacji celów terapeutycznych w chorobie Alzheimera.
- Wartość operacyjna: Poprawia standaryzację, powtarzalność i skalowalność testów upośledzenia synaptycznego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji typu go/no-go oraz efektywność kapitałową poprzez skupienie się na funkcjonalnych wynikach istotnych z punktu widzenia choroby.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację skorygowaną o ryzyko oraz rozwój zasobów w obszarze neurodegeneracji.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w pracy z peptydami, przygotowywaniu skrawków hipokampa oraz rejestracji elektrofizjologicznej.
- Wymaga dostępu do specjalistycznej aparatury do pomiaru LTP oraz systemów kontrolowanej perfuzji.
- Konieczna jest rygorystyczna standaryzacja protokołów przygotowania peptydów i analiz w obrębie zespołu badawczego.
- Może wymagać adaptacji dla różnych systemów modelowych lub klas związków, w zależności od ich rozpuszczalności i właściwości wiązania.
- Ograniczenia praktyczne obejmują zmienność agregacji peptydów oraz wrażliwość na warunki eksperymentalne.
