Mikroskopia rozproszeniowa optyczna oparta na dwuwymiarowych filtrach Gabora

W tym filmie mikroskopia rozproszeniowa jest wykorzystywana do ilościowej oceny fragmentacji mitochondriów podczas apoptozy. Chociaż mikroskopia rozproszeniowa w ramach niniejszego protokołu zazwyczaj nie wymaga fluorescencji, obrazy fluorescencyjne zostaną wykonane w celu walidacji. Po skonfigurowaniu systemu obrazowania komórki zostaną znakowane barwnikiem MIT tracker green i poddane działaniu staurosporyny w celu indukcji apoptozy.

Dane optyczne są pozyskiwane w celu wykrycia zmian w orientacji organelli komórkowych w ciągu dwóch godzin. Początek fragmentacji mitochondriów można zmierzyć przy użyciu danych o rozpraszaniu optycznym, które wykazują spadek stopnia orientacji cząstek podkomórkowych. Następnie dane są walidowane poprzez korelację danych o rozpraszaniu optycznym z fluorescencyjnymi obszarami zawierającymi mitochondria.

Witam, jestem Nada Bustani z Laboratorium Bio-Optyki w Katedrze Inżynierii Biomedycznej na Uniwersytecie Rutgers. Jestem Rob Pak z Laboratorium Bio-Optyki, a ja jestem Deen, również z Laboratorium Bio-Optyki. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę ilościowej analizy dynamiki morfologicznej struktur subkomórkowych przy użyciu metody, która nie opiera się na barwnikach fluorescencyjnych.

Stosujemy tę technikę w naszym laboratorium do badania dynamicznych zmian w strukturze subkomórkowej podczas apoptozy lub programowanej śmierci komórki. Przejdźmy zatem do pracy. Rozpocznij tę procedurę od wysterylizowania dłoni w rękawiczkach 70% etanolem.

Następnie w komorze z wyłączonym oświetleniem umieść przygotowany 100 nM roztwór stokowy miot tracker green oraz uprzednio ogrzane podłoże do hodowli komórek BAEC, a wszystkie powierzchnie wysterylizuj. Następnie pod okapem umieść sześciodołkową płytkę hodowlaną z komórkami wysianymi na szkiełkach podstawowych. Użyj pipety Pasteura podłączonej do linii próżniowej.

Usunąć pożywkę komórkową z dołków. Następnie natychmiast dodać dwa mililitry oznakowanej pożywki do każdego dołka w celu oznakowania mitochondriów w komórkach. Przykryć płytkę do hodowli tkanek, aby zapobiec ekspozycji na bezpośrednie światło pomieszczenia, i szybko umieścić komórki z powrotem w inkubatorze.

Inkubować przez 45 minut w temperaturze 37°C. Najpierw przygotować układ optyczny, włączając lampę łukową rtęciową. Następnie włączyć komputer, kamery mikroskopowe i laser oraz podłączyć cyfrowe urządzenie mikro-lustrzane (DMD) w dyfuzorze obrotowym.

Następnie należy spojrzeć przez okular mikroskopu, aby sprawdzić, czy wiązka laserowa została odpowiednio wyrównana. Pole widzenia powinno być jasno oświetlone światłem laserowym. Aby załadować próbkę, należy nanieść jedną lub dwie małe krople olejku imersyjnego na obiektyw imersyjny 63 x, gdy znajduje się on w najniższym położeniu.

Następnie umieść na stoliku preparat z siatką linii rozmieszczonych w regularnych odstępach 10 µm, tzw. gradi, i podnieś obiektyw tak, aby olej złapał ostrość. Następnie ustaw ostrość na sześciokątną krawędź pola kondensora. Zatrzymaj się, gdy zostanie ona wyrównana w centralnym oświetleniu Kohlera.

Sześciokątna krawędź powinna być wycentrowana w okularze i ostro ustawiona. Następnie, za pomocą pokręteł ustawiających przysłonę kondensatora, wycentruj pole przysłony kondensatora w polu widzenia. Uruchom program IP lab i wprowadź ustawienia niezbędne do pracy kamery.

Upewnij się, że kamera jest ustawiona w trybie przesyłania klatek (frame transfer mode). Uruchom polecenie acquire focus, aby rozpocząć podgląd na żywo. Następnie ustaw prefiks indeksu oraz lokalizację plików, w której będą zapisywane obrazy.

Następnie uruchom obrazowanie RS. Skonfiguruj ustawienia kamery CoolSnap. Tryb taktowania powinien zostać ustawiony na normalny.

Uruchom oprogramowanie DMD. Wybierz ciemną przesłonę w menu skryptów. Następnie kliknij ładowanie i resetowanie.

Aby uruchomić skrypt ręcznie, ustaw pasek optyki mikroskopu w oknie widoku na LSM. Spowoduje to przesłanie obrazu przez DMD w wyrównanej optyce, projektując obraz w ciemnym polu na CCD kamery Cascade five 12.

Obraz w ciemnym polu powinien pojawić się w podglądzie na żywo w programie IP lab. W razie potrzeby ustaw ostrość obrazu w podglądzie na żywo. Ustaw czas ekspozycji na wartość wystarczająco wysoką, aby zapewnić co najmniej 10 000 zliczeń sygnału na obrazie.

Następnie wykonaj zdjęcie pola widzenia, korzystając z polecenia acquire single po zakończeniu akwizycji. Użyj polecenia save as indexed, aby zapisać obraz na dysku. Obraz GTI służy do pomiaru wielkości pola widzenia.

Przesuń teraz próbkę GTI tak, aby znajdowała się poza polem widzenia i widoczne było tylko tło. Wykonaj obraz tła pola z czasem ekspozycji wystarczającym do uzyskania co najmniej 5 000 counts. Obraz ten pomoże w odjęciu tła z obrazów niefiltrowanych.

Aby uzyskać obrazy tła przefiltrowane filtrami Gabora, załaduj skrypt Banku Filtrów Gabora (Gabor Filter Bank) do oprogramowania sterującego DMD. Uruchom cały skrypt, aby zapisać filtry w pamięci wewnętrznej DMD. Po zbuforowaniu całego skryptu proces ten może potrwać kilka minut.

Użyj znaczników startu i stopu w oprogramowaniu DMD, aby upewnić się, że w danej chwili załadowany jest tylko jeden zestaw filtrów odpowiadający jednemu filtrowi typu Gabor. Uruchom skrypt, aby pozyskać filtrowane obrazy tła. Podgląd obrazu na żywo powinien zmienić się z pola ciemnego na obraz filtrowany.

W przypadku tego filtra otwórz w programie IP lab skrypt akwizycji z dysku. Dostosuj czas ekspozycji tak, aby uzyskać co najmniej 2000 zliczeń. Podczas uruchamiania skryptu DMD wyłącz podgląd na żywo w programie IP lab i uruchom skrypt akwizycji.

Operacja ta automatycznie pobierze indeks i zapisze przefiltrowany obraz na dysku. Po pobraniu pierwszego obrazu należy zatrzymać działanie skryptu w programie DMD. Następnie należy usunąć użyte polecenia ze skryptu.

Następnie należy wymienić markery startu i stopu na początku i na końcu kolejnego zestawu filtrów. Powtórz proces akwizycji w laboratorium IP, aż do wykorzystania całego banku filtrów oraz pozyskania i zapisania wszystkich obrazów po filtrowaniu. Przygotuj się do wysiewania komórek, podłączając lutownicę na blacie laboratoryjnym i podgrzewając medium L 15 do 37 °C.

Przygotuj stanowisko pracy, kładąc ręcznik papierowy oraz chusteczkę Kim wipe, aby wchłonąć wszelkie rozlane medium i utrzymać obszar w czystości. Przygotuj kilka knotów, odrywając i skręcając chusteczki Kim wipe. Knoty będą służyć do odciągania cieczy przez płytkę z komórkami.

Następnie, używając metalowego uchwytu na próbkę, należy przygotować tzw. kanapkę (cell sandwich). Za pomocą strzykawki nałóż cienką warstwę smaru próżniowego wokół górnego obwodu otworu w obrobionej metalowej płytce, prowadząc go mniej więcej do połowy długości rowków po każdej stronie. Ostrożnie przyłóż czyste szkiełko nakrywki nr 1 do nałożonego smaru.

Odwróć płytkę i nałóż smar wokół otworu. Wyłącz oświetlenie w pomieszczeniu, mając na dłoniach rękawiczki egzaminacyjne NI wysterylizowane etanolem. Wyjmij komórki z inkubatora.

Wyjmij z płytki sześciodołkowej szkiełko przykrywowe, które zostanie użyte w doświadczeniu. Ostrożnie osusz szkiełko przykrywowe. Następnie dociśnij szkiełko przykrywowe stroną komórkową do natłuszczonej metalowej płytki nad otworem obserwacyjnym.

Umieszczenie komórek pomiędzy płytkami. Należy upewnić się, że nie pozostały pęcherzyki powietrza oraz że smar utworzył wodoszczelną uszczelkę, umożliwiającą wprowadzenie medium. Następnie należy odwrócić płytkę i pipetować po 200 µL jednorazowo.

Do przestrzeni między górną szkiełkiem nakrywką a płytką metalową, przez szczelinę, należy dodać uprzednio ogrzane pożywkę L 15, aż ciecz prawie osiągnie szczelinę po przeciwnej stronie. Następnie należy wypłukać komórki, przykładając knot do przeciwległej szczeliny i pipetując dodatkowe 200 µl pożywki do wnętrza układu. Pożywka przepłynie z jednej strony na drugą, podczas gdy knot będzie usuwał starą pożywkę.

Należy uważać, aby podczas tego etapu nie powstały pęcherzyki powietrza w cieczy. Powtórz ten proces od dwóch do trzech razy, używając nowego knotka do każdego płukania. Teraz ponownie odwróć płytkę, podtrzymując ją za krawędzie, aby zatrzymać ciecz w zbiorniku komórki.

Zanurz lutownicę w zlewce z veapem, aby szybko roztopić niewielką ilość veapu, który przylgnie do grotu lutownicy. Za pomocą grotu lutownicy ostrożnie nanieś roztopiony veap wzdłuż krawędzi dolnego szkiełka nakrywkowego. Kontynuuj zanurzanie i nakładanie materiału na całym obwodzie szkiełka nakrywkowego, uszczelniając je z płytką metalową.

Tworzy to szczelne połączenie mechaniczne, dzięki czemu szkiełko nakrywkowe nie oddzieli się od płytki podczas obserwacji. Należy usunąć wszelkie pozostałości z dolnej powierzchni szkiełka nakrywkowego, zwijając chusteczkę Kimwipe w kuleczkę i przecierając nią szkiełko.

Wsuń szkiełko nakrywkowe jednym płynnym ruchem, aby zapewnić jego maksymalną czystość w centrum, w miejscu, które będzie obserwowane. Umieść płytkę sześciodołkową z powrotem w inkubatorze. Przenieś płytkę z komórkami do laboratorium optyki i zamocuj ją na obiektywie.

Podobnie jak wcześniej, należy odnaleźć pole widzenia z komórkami o zdrowym wyglądzie i wykonać obraz w ciemnym polu. Następnie należy ustawić mikroskop w trybie DIC, upewniając się, że czasy ekspozycji są odpowiednie. Następnie należy wykonać obraz DIC za pomocą kamery kaskadowej.

W tej konfiguracji obrazy fluorescencyjne są pozyskiwane za pomocą kamery cool SNAP, podczas gdy mikroskop jest nadal ustawiony w trybie DIC. Ustaw VAR mikroskopu na jeden x, a okno widoku na 100% binokular i przekieruj obraz z okularu do kamery. Umieść niebieską diodę LED nad kondensorem, aby oświetlić pole widzenia.

Następnie obejrzyj pole widzenia w obrazie RSS i dostosuj ostrość. W razie potrzeby wykonaj obraz DIC i zapisz go na dysku. Zauważ, że pole widzenia różni się od tego uzyskanego za pomocą kamery kaskadowej.

Obrazy te będą musiały zostać zarejestrowane podczas fazy analizy eksperymentu. Następnie przesuń kostkę filtra fluorescencyjnego na pozycję roboczą i wykonaj obraz fluorescencyjny, krótko włączając wzbudzenie fluorescencji za pomocą migawki mikroskopu, a następnie wyłącz je niezwłocznie po zakończeniu akwizycji. Aby zminimalizować fotowybielanie, zapisz obraz fluorescencyjny na dysku.

Aby uzyskać obrazy filtrowane, przywróć mikroskop do ustawień pola i skieruj światło przez port LSM. Podobnie jak wcześniej, uruchom cały skrypt banku filtrów Gabriela, aby zakończyć akwizycję danych dla jednego punktu czasowego, gdy komórki wciąż znajdują się na stoliku i bez zakłócania pola widzenia. Zastosuj metodę odprowadzania cieczy (wicking method), aby zastąpić zwykłe podłoże L 15 podłożem zawierającym 1 µM roztwór STS.

W trakcie eksperymentu należy dodawać kolejne porcje pożywki, aby zapobiec wysychaniu, pipetując medium do wgłębienia w płytce komórkowej bez zdejmowania jej ze stolika i bez zaburzania pola widzenia. Następnie powtórz te kroki dla kolejnych punktów czasowych aż do zakończenia eksperymentu. Zebrane dane będą obejmować dużą liczbę przefiltrowanych obrazów, które muszą zostać przetworzone w celu wyekstrahowania danych o strukturach subkomórkowych.

Przedstawiono tutaj dwa przykładowe eksperymenty. Ta rycina obrazuje sekwencyjne zdjęcia próbki morskich okrzemek. Orientacja cech jest wyraźnie widoczna.

W obrazowaniu w ciemnym polu. Obrazy przefiltrowane optycznie, oznaczone jako pięć równych 0 stopni do pięciu równych 160 stopni, przedstawiono obok niefiltrowanego obrazu próbki. Dla porównania, zestaw dziewięciu obrazów okrzemka przefiltrowanych filtrem Gabora został przetworzony piksel po pikselu w celu określenia orientacji obiektu.

Dla każdego piksela maksymalny sygnał podzielono przez sygnał średni w funkcji orientacji filtra, aby uzyskać wartość współczynnika kształtu (aspect ratio). Tutaj współczynnik kształtu bliski jedności, zaznaczony kolorem niebieskim, występuje w obszarach, w których nie ma preferowanego kąta odpowiedzi. Wyższe wartości, zaznaczone kolorem czerwonym, wskazują obszary, w których występuje silniejsza odpowiedź dla preferowanego kąta.

Jasność i istotność kodu całkowitej odpowiedzi filtru Gabora oraz orientacja filtra, dająca maksymalny sygnał w każdym pikselu, odpowiadają kierunkowi prostopadłemu do orientacji leżącego u podstaw obiektu. Orientacja cząstek substruktury została zakodowana na wykresie wektorowym (quiver plot), gdzie każda linia ściśle zgadza się z lokalną orientacją obiektu widoczną w niefiltrowanym polu ciemnym. Wykres wektorowy przedstawia orientację obiektów o intensywności odpowiedzi przekraczającej 10% maksimum.

Te obrazy w ciemnym polu i obrazy filtrowane optycznie przedstawiają pole zawierające żywe komórki śródbłonka bydlęcego; obrazy filtrowane były następnie pozyskiwane co 20 minut przez okres trzech godzin po zastosowaniu staurosporyny jako induktora apoptozy. Tutaj, w górnym panelu pokazano mapę współczynnika proporcji, a w dolnym panelu obrazowanie fluorescencyjne mitochondriów w funkcji czasu. Barwa kolorystyczna reprezentuje stopień orientacji; podobnie jak wcześniej, te wykresy czasowe porównują spadek stopnia orientacji współczynnika proporcji cząstek w komórkach śródbłonka traktowanych staurosporyną, a poszczególne ślady reprezentują przebiegi czasowe w obrębie pojedynczych komórek.

Orientacja kropli jest ograniczona do obszarów komórek, które pokrywają się z obszarami fluorescencyjnymi. W ten sposób osiągnięto walidację względem fluorescencji. Zostaje ona zarchiwizowana.

Zatem w kolejnych eksperymentach pomiary mitochondrialne można przeprowadzić, pomijając etapy obrazowania fluorescencyjnego i korzystając bezpośrednio z metody rozpraszania optycznego. Właśnie pokazaliśmy, jak monitorować fragmentację mitochondriów podczas apoptozy, wykorzystując sygnatury rozpraszania światła oparte na filtrach Gabora. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest odpowiednie przygotowanie próbki oraz upewnienie się, że układ optyczny jest prawidłowo wyrównany i skalibrowany.

Przejdźmy zatem do obserwacji i współpracy z eksperymentami UI.