Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Niniejszy protokół przedstawia bioinformatyczną metodę wideo do pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych poprzez analizę filmów time-lapse zarejestrowanych w inkubatorze icon bio station CT, wyposażonym w kamerę do obrazowania wideo. Kolonie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (HESC) są hodowane do 70% konfluencji, przesiewane i inkubowane przez 48 godzin, po czym kolonie HESC są filmowane przez kolejne 48 godzin w urządzeniu Biot ct. Szybkość wzrostu jest określana przy użyciu ulepszonej segmentacji i procedur pomiarowych opracowanych w oprogramowaniu CL quant.

Procedury zostały zwalidowane poprzez porównanie z programem Adobe Photoshop, narzędziem do analizy obrazu, które umożliwia precyzyjne ręczne dopasowanie masek do każdej kolonii. Rozwijająca się dziedzina bioinformatyki wideo może być wykorzystana do automatyzacji przetwarzania, analizy i wydobywania danych biologicznych z filmów mikroskopowych. Cześć, nazywam się Serena Lin i pochodzę z laboratorium dr. Prou Talbota w Katedrze Biologii Komórki i Neuronauki na Uniwersytecie Kalifornijskim w Riverside.

Cześć, jestem Sean Fino, również z laboratorium Talbot. Cześć, jestem TI Satish z programu studiów doktoranckich w zakresie biologii komórkowej, molekularnej i rozwojowej. Dzisiaj pokażemy Państwu, jak mierzyć wzrost kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu narzędzi bioinformatyki wideo.

Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium w celu pomiaru wpływu toksyn środowiskowych na zachowanie ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Zademonstrujemy tę procedurę w naszym nowym centrum zasobów komórek macierzystych. Zatem zacznijmy.

Aby przygotować HESC do analizy wideo, należy hodować HESC na płytkach sześciodołkowych pokrytych matrigelem do uzyskania 70% konfluencji, odessać medium z jednego dołka zawierającego HESC i przepłukać go dwukrotnie 1 mL PBS. Następnie dodać 1 mL Accutane i inkubować przez jedną minutę w temperaturze 37°C w 5% CO2. Następnie do dołka należy dodać od 10 do 12 szklanych kulek i delikatnie potrząsać płytką, aż kolonie całkowicie się odłączą.

Zneutralizuj Accutane, używając jednego mililitra pożywki do utrzymania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub pożywki warunkowanej fibroblastami embrionalnymi myszy. Zbierz oddzielone komórki bez kulek do probówki stożkowej o pojemności 15 mililitrów i wiruj przy 200 G przez trzy minuty. Odlej nadsącz i rozbij osad 500 mikrolitrami świeżej pożywki do utrzymania ludzkich embrionalnych komórek macierzystych lub M-T-E-S-R. Nalej po 100 mikrolitrów zawiesiny HESC kroplami do wielu studzienek płytki 12-studzienkowej powlekanej Matrigelem.

Delikatnie kołysz płytkę w przód i w tył, a następnie obserwuj hodowle pod mikroskopem świetlnym, aby upewnić się, że agregaty komórkowe są równomiernie rozłożone w dołkach. Umieść płytkę w inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide na 48 godzin, aby zapewnić płaskie przytwierdzenie komórek i ich odpowiedni wzrost umożliwiający łatwą wizualizację. Po 48 godzinach odessać pożywkę i przemyć dołki 500 µL PBS w celu usunięcia nieprzytwierdzonych komórek, a następnie dodać do każdego dołka 500 µL pożywki M-T-E-S-R.

Natychmiast umieść płytkę w urządzeniu Biot CT i rozpocznij zbieranie obrazów time-lapse. Staraj się wybierać pola z pojedynczymi, odizolowanymi koloniami, które prawdopodobnie nie zrosną się z innymi koloniami. W niniejszym protokole komórki są rejestrowane wideo przez dodatkowe 48 godzin z odstępami siedmiominutowymi między klatkami.

Aby najpierw stworzyć recepturę segmentacji, należy ręcznie przejrzeć cały film, aby upewnić się, że zawiera on pojedynczą kolonię, która pozostaje w ostrości przez cały okres nagrywania. Następnie należy otworzyć kreator segmentacji w oprogramowaniu CL quants i kliknąć przycisk „next”. Należy wybrać odpowiedni kanał obrazu i kliknąć przycisk „next”.

Wybierz opcję soft matching i kliknij Next. Zaznacz jeden lub dwa interesujące obszary, obrysowując krawędź zewnętrzną aż do centralnej części kolonii. Obszar ten powinien być jak najmniejszy, ale reprezentatywny dla całej kolonii.

Nie wybieraj zbyt wielu obszarów, ponieważ może to doprowadzić do niedokładnego nałożenia maski. Kliknij przycisk „Dalej”. Wybierz opcję „Nie chcę obszarów”, obrysowując fragmenty, które nie stanowią części kolonii ani tła.

Obszary te zawierają wzorce, które należy wyeliminować, takie jak zanieczyszczenia i martwe komórki. Kliknij Dalej. Wybierz tło, zaznaczając okręgiem obszary, które nie są koloniami, zanieczyszczeniami ani martwymi komórkami.

Tło powinno być jednolite i prawdopodobnie występować w każdej klatce. Zazwyczaj wybieramy szare tło wokół kolonii. Kliknij przycisk „Dalej”.

Jeśli maska nie pokrywa dokładnie obszaru zainteresowania, nad obszarem tym powinna wyświetlić się kolorowa maska. Zakres progu segmentacji w prawym dolnym rogu ekranu można zwiększyć lub zmniejszyć, jeśli wymagana jest zmiana maski. Wybierz opcję aktualizacji obszarów dopasowania miękkiego.

Pozwala to na zmianę obszarów pożądanych, niepożądanych lub tła. Jeśli maska jest satysfakcjonująca, wybierz opcję zastosuj próg (apply threshold) oraz zapisz moją maskę (save my mask). Następnie kliknij przycisk dalej.

Maska zostanie następnie wyświetlona w innym kolorze. Wybierz opcję finish. Przepis powinien zostać wyświetlony w prawym górnym rogu oprogramowania jako segmentation recipe.

W razie potrzeby zmień nazwę przepisu, klikając prawym przyciskiem myszy i wprowadzając nową nazwę. Aby zastosować przepis, kliknij prawym przyciskiem myszy i najedź kursorem.

Zastosuj recepturę. Pojawi się menu umożliwiające wybór liczby klatek do wykorzystania. Ustaw interwał klatek na co 20 klatek, aby zapewnić wierność maski.

Przeprowadź losową, ręczną kontrolę 10% klatek, do których zastosowano maskę, aby stworzyć przepis wzmocnienia (enhancement recipe) eliminujący niepożądane obszary w pozostałościach. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder z przepisami wzmocnienia, a następnie wybierz opcję „Nowy”. Nowy przepis wzmocnienia powinien zostać wyświetlony na podstawie oryginalnego pola widzenia.

Najedź kursorem myszy na ikony na pasku narzędzi, aby zidentyfikować przycisk przełączania modułu ulepszeń znajdujący się po prawej stronie obrazu, a następnie kliknij go. Wybierz rozwijane menu etykietowania. Wybierz etykietowanie dla połączonych, wybierz etykietowanie dla połączonych dwóch.

Powinien pojawić się nowy pasek zadań. Pobierz początkową maskę z przepisu segmentacji i przeciągnij ją do pola wejściowego. Pasek powinien teraz wyświetlać numer maski wejściowej.

Przeciągnij ikonę z numerem maski wejściowej do ikony maski zero. Znajdź opcję min size w pasku zadań i dostosuj liczbę, aż zostanie wyświetlony tylko obszar zainteresowania. Pamiętaj, aby klikać przycisk execute przy każdej próbie dopasowania.

Gdy regulacja minimalnego rozmiaru będzie satysfakcjonująca, kliknij poprzedni przepis wzmacniania u dołu ekranu i wybierz opcję zapisz w przepisie. Oprogramowanie wyświetli teraz monit o nadpisanie wybranego przepisu; wybierz tak. Sprawdź przepis wzmacniania, stosując tę samą procedurę, co w przypadku weryfikacji segmentacji plamek.

Jeśli wyniki segmentacji i ulepszania obrazu są satysfakcjonujące, przejdź do tworzenia szablonu pomiarowego. Aby rozpocząć, wybierz opcję create measurement template na prawym pasku narzędzi. W oknie pomiarów przesuń kursor nad grafikę komórki.

Przytrzymaj klawisz Ctrl i zaznacz komórkę w sekcji morfologii, odznacz parametr domyślny i zaznacz parametr pola. Następnie wyjdź z okna szablonu. Wybierz ikonę.

Utwórz recepturę pomiarową. Zmień nazwę receptury. Przejdź do karty szablonów i wybierz ją. W prawym górnym rogu przeciągnij i upuść wcześniej utworzony szablon pomiarowy do okna pomiarowego.

Kliknij tak, aby kontynuować w oknie receptury pomiarowej, a następnie wybierz mapowanie kanałów. Następnie wybierz mapowanie masek dla całych komórek. Następnie wybierz opcję całych komórek. Aby uzyskać ulepszoną maskę, wybierz recepturę pomiarową w karcie receptury.

W głównym oknie wybierz ikonę zapisu w oknie przepisu pomiarowego. Następnie zamknij okno. Potem zamknij i ponownie otwórz pole widzenia. Kliknij prawym przyciskiem myszy folder listy przepisów, a następnie kliknij „nowy” i przeciągnij przepisy w kolejności ich wymagania do listy przepisów, wybierz opcję blokowania listy przepisów i uruchom przepisy sekwencyjnie na danych wideo przy użyciu programu Adobe Photoshop.

Przeanalizowano co dwudziestą klatkę obrazu tych samych kolonii. Ręcznie otwórz klatkę obrazu kolonii w programie Adobe Photoshop. Kliknij narzędzie różdżka w pasku narzędzi.

Kliknij obszar wokół kolonii, tak aby cały obszar był zaznaczony z wyjątkiem regionu kolonii. Upewnij się, że przerywana linia wokół kolonii ściśle przylega do jej obwodu, a nie znajduje się wewnątrz niej. Jeśli przerywana linia nie pokrywa się z obwodem, odpowiednio zmień wartość tolerancji w górnym pasku narzędzi.

Kliknij przycisk edycji w trybie szybkiej maski na pasku narzędzi, a następnie kliknij kolonię, aby została zaznaczona. Przejdź do menu rozwijanego w oknie i wybierz histogram. Pamięć podręczna powinna być ustawiona na wartość jeden.

Jeśli wartość cache wynosi dwa, kliknij znak wykrzyknika przy wyrażeniu, aby zmienić wartość cache na jeden. Zapisz wartość piksela w arkuszu kalkulacyjnym. Powtórz powyższy proces dla każdej 20. klatki.

Dane zebrane przy użyciu oprogramowania Photoshop i CL quant można następnie nanieść na wspólny wykres. Nasz protokół ilościowego oznaczania wzrostu kolonii HESC demonstruje jedno z zastosowań bioinformatyki wideo w problematyce biologicznej. Poniżej przedstawiamy wykres porównujący przyrost wielkości kolonii w ciągu 48 godzin, wyznaczony przy użyciu oprogramowania CL quant oraz programu Adobe Photoshop.

Wykres przedstawia pięć różnych kolonii, z których każda została przeanalizowana za pomocą obu pakietów oprogramowania. Każda kolonia jest reprezentowana przez inny kolor. Linie ciągłe zostały wyznaczone przy użyciu oprogramowania sail quant, natomiast linie przerywane zostały wyznaczone przy użyciu programu Photoshop.

Wykres surowych danych pokazuje, że obie metody pomiaru są ze sobą zgodne, biorąc pod uwagę fakt, że kolonie mają różną wielkość początkową. Na niniejszej rycinie dane przedstawiono ponownie jako procentowy wzrost wielkości kolonii. Szybkości wzrostu są zbliżone niezależnie od początkowej wielkości kolonii, a obie metody analizy dają podobne wyniki.

Poniższy wykres przedstawia wartości średnie z poprzednich danych dotyczących procentowej zmiany wzrostu kolonii HESC. Wykres ten wyraźnie wskazuje na dobrą zgodność między analizą przeprowadzoną przy użyciu bioinformatyki wideo a programem Adobe Photoshop. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem narzędzi bioinformatyki wideo.

Podczas wykonywania tej procedury z użyciem mikroskopii kontrastowej należy upewnić się, że w obrazie znajduje się halo wokół kolonii, co umożliwi precyzyjną selekcję kolonii przez oprogramowanie. Należy również pamiętać, że zamiast zaprezentowanego protokołu można zastosować inne metody hodowli, inkubacji i rejestracji wideo. Po opracowaniu i walidacji skryptów analiza będzie przebiegać znacznie szybciej i z mniejszą zmiennością doświadczalną niż w przypadku analizy manualnej.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.