Model myszy z przewlekłą infekcją Salmonella

Ogólnym celem niniejszej procedury jest opracowanie modelu myszy z chroniczną infekcją salmonellą. Osiąga się to najpierw poprzez przygotowanie roztworu salmonelli. Drugim krokiem procedury jest podanie myszom przez zgłębnik streptomyciny, a następnie salmonelli, lub podanie samej streptomyciny.

Trzecim krokiem procedury jest wyizolowanie salmonelli z odchodów myszy oraz wykrycie zakażenia salmonellą w jelicie myszy przy użyciu płytek BL chroma. Końcowym etapem procedury jest obserwacja i zapisanie masy ciała myszy oraz odnotowanie zmian w witalności po zakażeniu salmonellą. W rezultacie można uzyskać wyniki wykazujące, że zakażenie salmonellą może zostać ustanowione w jelitach myszy, którym podano salmonellę drogą zgłębnika.

Cześć, jestem Michelle P z laboratorium dr. Johnsona w Katedrze Medycyny na Uniwersytecie w Rochester. Jestem również z laboratorium Sun, a ja jestem Y z laboratorium Sun. Dzisiaj zaprezentujemy procedurę tworzenia modelu masy zakażonej Alytic Lennar.

Procedurę tę stosujemy w naszym laboratorium do badania transdukcji sygnałów w interakcjach między gospodarzem a bakteriami oraz procesów tumorogenezy. Zacznijmy zatem. Przed przystąpieniem do eksperymentu należy przygotować odpowiednią liczbę płytek z pożywką Luria-Bertani lub bulionem LB dla każdego szczepu Salmonella, które będą wykorzystywane w trakcie całego badania.

Płytki można przechowywać w lodówce przez kilka miesięcy. Następnie należy przygotować kulturę salmonelli. Wyjmij fiolkę ze stokiem salmonelli mrożoną w temperaturze -80 °C i pozostaw ją do rozmrożenia na blacie, aby wysiać salmonellę.

Wypal pętlę szczepiącą w palniku i zanurz ją w rozmrożonym materiale bakteryjnym. Wykonaj ruchy zygzakowate pętlą na górnej jednej trzeciej płytki LB. Ponownie wypal pętlę i obróć płytkę.

Wykonaj zygzakową smugę, przecinając poprzednie linie, aby rozprowadzić bakterie na drugiej jednej trzeciej płytki. Powtórz tę czynność jeszcze raz. Ponownie wysterylizuj pętlę w płomieniu.

Należy uważać, aby pętla nie przebiła agaru. Kolonie należy inkubować przez noc w inkubatorze w temperaturze 37 °C. Jeśli procedura zostanie przeprowadzona prawidłowo, na płytce z salmonellą w co najmniej jednej sekcji powinny pojawić się pojedyncze kolonie.

Następnego dnia. Wybierz klon z płytki LB, używając sterylnego wykałaczką lub pętlą bakteriologiczną, i przenieś go do 7 ml LB w probówce o pojemności 12 ml. Inkubuj probówkę w wytrząsarce w temperaturze 37 °C przez około pięć godzin.

Użyj 0,05 ml tej kultury do inokulacji 50 ml LB w probówce typu Falcon. Inkubuj w temperaturze 37°C bez wytrząsania przez około 18 godzin.

Wirować 50 ml nocnej kultury bakterii w temperaturze pokojowej przy 5 000 RPM przez 10 minut, a następnie odlać nadsącz. Następnie do probówki dodać 1,5 ml soli buforowej Hanksa (HBSS) w celu resuspensji bakterii, co odpowiada stosunkowi 100 części LB do 3 części HBSS. Następnie uzupełnić całkowitą objętość do 15 ml za pomocą HBSS, zachowując stosunek LB do HBSS wynoszący 1:10.

Każda mysz wymaga 100 µL rozcieńczonej kultury salmonelli, lub od 1×10⁶ do 1×10⁸ jednostek tworzących kolonie (CFU) przed rozpoczęciem gavage; na cztery godziny przed eksperymentem należy odstawić myszom wodę i pokarm. Następnie, bezpośrednio przed gavage, należy przygotować roztwór streptomycyny, rozcieńczając 7,5 mg sproszkowanej streptomycyny w 100 µL HBSS. W przypadku każdej wstrzykiwanej myszy należy przygotować dodatkową objętość roztworu, aby uwzględnić straty przed gavage myszy.

Najpierw przygotować igłę do podawania z 100 µL roztworu streptomycyny. Wyjąć z klatki pierwszą mysz w celu wykonania zgłębnika i trzymać ją przodem do blatu laboratoryjnego. Mocno chwycić kciukiem i palcem środkowym skórę nad barkiem myszy, rozciągając głowę i szyję palcem wskazującym, aby przełyk był prosty.

Kieruj kulistą końcówką igły podawczej wzdłuż podniebienia w stronę prawej strony tylnej części gardła. Następnie delikatnie wprowadź ją w dół do przełyku i wstrzyknij 100 µL roztworu streptomycyny. Nie powinno być odczuwalnego oporu.

Powtórz ten proces u wszystkich myszy eksperymentalnych i kontrolnych poddawanych badaniom. Około 20 godzin po podaniu strp de m i gavage oraz na cztery godziny przed podaniem salmonelli drogą gavage, odstaw wodę i pokarm myszom, które otrzymają salmonellę doustnie. Podaj każdej myszy roztwór salmonelli w HBSS w ilości 100 µL w ten sam sposób, co poprzednio.

Po podaniu doustnym przez zgłębnik przenieś każdą mysz do nowej klatki, aby rozpocząć zbieranie kału. Zaczynając około ośmiu godzin po gavage, usuwaj kał z klatki natychmiast po jego wydaleniu. Zbierz 100 mg kału mysiego jako próbkę eksperymentalną.

Pobierać próbki codziennie lub co tydzień, w zależności od czasu trwania badania, w celu analizy kału pod kątem obecności salmonelli. Przenieść próbkę kału do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml z 1 ml PBS, wymieszać intensywnie w wirówce typu vortex, a następnie wirować przez 10 minut przy 800 RPM. Przenieść nadsącz do czystej probówki 1,5 ml i wirować przy 6 000 RPM przez pięć minut.

Odlej supernatant i dodaj 200 µL PBS do osadów, a następnie wymieszaj w wstrząsarze wirowym (vortex), aby je resuspenderować. Następnie wykryj salmonellę za pomocą płytki BB l roag. Na każdą płytkę nanieś od 10 do 100 µL roztworu z kałem, rozprowadzając go na powierzchni płytki zgodnie z opisem w sekcji drugiej.

Gatunki salmonelli wykazują bordowy kolor ze względu na różnice metaboliczne w obecności wybranych chromogenów. Należy policzyć kolonie salmonelli na płytce, aby porównać stopień zakażenia u poszczególnych myszy. W tej procedurze eksperymentalnej wykorzystano samice myszy C 57 black six w wieku od sześciu do siedmiu tygodni, wolne od specyficznych patogenów.

Myszy zainfekowano bakteriami salmonella oraz streptomycyną w roztworze HBSS. Grupę kontrolną myszy poddano gavage z samą streptomycyną. Wykorzystane szczepy salmonella obejmowały szczep dziki salmonella typhimurium, A TCC 1 4 0 2 8 S FP C, niepatogenny szczep mutant salmonella oraz trzy szczepy FPC z laboratorium dr. Jamesa Maderą, niosące związany z wirulencją gen AAV R age w niskokopiowym plazmidzie PSKW 29. Zastosowanie tego protokołu pozwala na wykrycie kolonizacji salmonella tyrian w jelitach myszy.

Przewlekłą infekcję Salmonella mierzono poprzez analizę kału, a próbki masy ciała oraz tkanki jelitowej pobrano w celu przeprowadzenia barwienia immunofluorescencyjnego. Zazwyczaj utrata masy ciała i śmierć następują w ciągu czterech tygodni po infekcji. Przedstawione są tutaj proporcje przeżywalności cztery tygodnie po infekcji.

Po przeżyciu czterech tygodni od zakażenia, myszy przybierają na wadze, a liczba zgonów maleje w ciągu pozostałych 23 tygodni. Ogólnie ponad 65% myszy zakażonych szczepami salmonelli FSY fsy, A VRA null lub fsy. A VRA heterozygote jest w stanie przeżyć ponad sześć miesięcy z trwałą infekcją salmonellą w jelitach.

Po ostrej infekcji osobniki, które przeżyły, nadal były nosicielami salmonelli, co można było wykryć sześć miesięcy po zakażeniu, stosując metodę opisaną w niniejszym protokole. Analiza immunofluorescencyjna próbek tkanek z jelita myszy wykazuje inwazję salmonelli w błonie śluzowej jelita 27 tygodni po zakażeniu. Na tym obrazie jądra komórkowe są zabarwione na niebiesko, a zainfekowana salmonella jest widoczna w kolorze zielonym.

Jak pokazano w grupie kontrolnej, nie występuje jasnopomarańczowego barwienia, co wskazuje na brak kolonizacji przez salmonellę. Natomiast u myszy zainfekowanych salmonellą w 27. tygodniu po infekcji, w błonie śluzowej jelit widoczne jest jasnopomarańczowe barwienie. Wykazuje to trwałość infekcji salmonellą u myszy poddanych wstępnemu leczeniu streptomycyną.

Właśnie pokazaliśmy, jak indukować przewlekłą infekcję w modelu mysim. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o świeżym przygotowaniu hodowli do pasażowania, zastosowaniu prawidłowej techniki pasażowania oraz wykryciu obecności ANA, aby upewnić się, że model eksperymentalny działa poprawnie. To wszystko.

Dziękujemy za obejrzenie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.