Analiza profilu polirybosomów eukariotycznych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie i porównanie frakcji monosomów oraz polirybosomów z lizatów komórkowych. W tym celu w pierwszej kolejności należy przeprowadzić hodowlę odpowiednich komórek. Drugim krokiem procedury jest przygotowanie lizatu komórkowego.

Trzecim krokiem procedury jest centryfugowanie lizatu w gradiencie sacharozy. Ostatnim etapem procedury jest frakcjonowanie gradientu i wizualizacja różnych populacji rybosomów za pomocą śladu UV. W rezultacie można uzyskać dane wykazujące zmiany w translacji w różnych warunkach eksperymentalnych poprzez analizę profilu polirybosomów.

Witajcie, jestem Anthony Esposito z laboratorium dr Terry Goss Kinsey w katedrze genetyki molekularnej, mikrobiologii i immunologii na UMD oraz w J Robert Wood Johnson Medical School. A ja jestem Marcus Lewis, również z laboratorium dr Kinsey tutaj w R-W-J-M-S.

Dzisiaj zaprezentujemy procedurę analizy poliribosomów. W naszym laboratorium stosujemy tę metodę do badania zmian w syntezie białek wynikających z mutacji lub czynników środowiskowych. Zacznijmy zatem. Sacharoza.

Gradienty należy przygotować dzień przed użyciem, aby stały się ciągłe. Wymieszać odpowiednie objętości roztworów stokowych sacharozy 7% i 47%, aby otrzymać 48 ml każdego z następujących stężeń sacharozy: 7%, 17%, 27%, 37% oraz 47%. Do każdego roztworu sacharozy dodać 1 M DTT do stężenia końcowego 1 mM. Aby wylać gradienty, należy przymocować pipetę Pasteura do strzykawki 20 ml, zabezpieczając i uszczelniając połączenie folią Parafilm.

Do dna probówki do ultrawirówki z poliameru o wymiarach 1 cal na 3,5 cala dodaj siedem mililitrów 7% sacharozy. Następnie, pod warstwę 7% roztworu dodaj siedem mililitrów 17% roztworu sacharozy, umieszczając końcówkę pipety w pobliżu dna probówki i pipetując powoli. Wlewanie każdej warstwy powinno zająć nie mniej niż 20 sekund.

Powtórz procedurę, używając po siedmiu mililitrów roztworów sacharozy o stężeniach 27%, 37% oraz 47%, gdy gradient zostanie utworzony. Powinny być widoczne wyraźne linie między warstwami, co wskazuje na minimalne mieszanie. Przechowuj wszystkie gradienty w temperaturze czterech stopni Celsius overnight, wraz z rotorami, butelkami i probówkami, które zostaną wykorzystane do pobierania próbek.

Aby przygotować ekstrakty z komórek drożdży, należy rozpocząć od wyhodowania 100 25 ml kultury drożdży do OD 600 wynoszącej od 0,8 do 1. Do kultury należy dodać cykloheksymid do stężenia końcowego 100 µg/ml i kontynuować inkubację z wytrząsaniem w temperaturze 30 °C przez 15 minut. Po 15 minutach kulturę należy przelać do butelki wirówkowej o pojemności 250 ml i otoczyć lodem.

Od tego momentu wszystkie próbki należy utrzymywać w lodzie; odwiruj z prędkością 8 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Resuspenduj osad w 10 ml schłodzonego w lodzie buforu lizującego i przenieś do polipropylenowych probówek o pojemności 15 ml. Odwiruj z prędkością 5 900 ×g przez trzy minuty w temperaturze 4 °C; resuspenduj.

Resuspend osad w 0,5 ml buforu do lizy. Przenieś zawiesinę do probówki do wirówki o pojemności 1,5 ml, a następnie dodaj 0,5 ml schłodzonych, wypalanych i przemytych kwasem szklanych kulek. Homogenizuj komórki za pomocą wstrząsarki vortex w czterech 32-sekundowych interwałach, chłodząc probówkę na lodzie przez 30 sekund pomiędzy każdym z nich.

Następnie do probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml należy dodać kolejne 0,5 ml buforu lizującego i wirować z prędkością 5 000 ×g przez pięć minut w temperaturze 4 °C. Należy przenieść nadsącz do nowej probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i wirować z maksymalną prędkością przez 10 minut w temperaturze 4 °C.

Na koniec przenieś nadsącz do nowej probówki mikrocentryfużowej o pojemności 1.5 ml. Ekstrakt można przechowywać w temperaturze -80 °C do czasu przeniesienia lizatu na gradient sacharozy. Przystaw końcówkę pipety do ścianki probówki w pobliżu powierzchni gradientu i delikatnie nanieś lizat na wierzch gradientu.

W przypadku gradientu o objętości 35 ml zazwyczaj nakłada się 500 µl lizatu. Używając pęsety, ostrożnie umieść gradient w koszyku rotora z koszyczkami wahadłowymi. Wiruj gradienty przy 100 000 ×g przez cztery godziny w temperaturze 4 °C.

Około 30 minut przed zakończeniem czterogodzinnego wirowania należy przymocować igłę do nakłuwacza probówek, a piórko do monitora absorbancji i fluorescencji online. Włączyć zasilanie monitora absorbancji, aby umożliwić osiągnięcie stabilnej linii bazowej przed analizą próbek.

Elektroniczny zapis profilu PolyZone można łatwo uzyskać w czasie rzeczywistym, podłączając jednostkę akwizycji danych DI 1 48 U. W przypadku rejestratoru wykresów, należy napełnić pompę strzykawkową 50 mililitrów florin nuts, korzystając z ustawienia szybkiego przepływu wstecznego. Należy upewnić się, że w układzie nie ma pęcherzyków powietrza.

Podłącz wąż z analitycznej strzykawki do nakłuwacza rurek. Następnie krótko uruchom przepływ Floinert z prędkością 6 ml/min w kierunku w przód. Aby usunąć pęcherzyki powietrza z węża, umieść serię probówek pod wężem na wylocie celi przepływowej, aby zebrać odpływ próbki.

Przygotować wiaderko z lodem z wcześniej uformowanym wgłębieniem do umieszczenia probówki wirówkowej zawierającej gradient sacharozy. Po zakończeniu czterogodzinnego wirowania ostrożnie wyjąć probówki wirówkowe z rotora wirówki i umieścić je w lodzie, dbając o to, aby nie zakłócić gradientów.

Aby przeanalizować ekstrakty komórkowe, należy umieścić probówkę z gradientem na nakłuwaczu do probówek, podłączyć górną część probówki do wylotu i zabezpieczyć połączenie. Podnieść dolną platformę do probówki wirówkowej tak, aby igła przebiła dno probówki. Rozpocząć przepływ Florin alert w kierunku w przód z prędkością 6 ml/min.

Gdy eluat zacznie wpływać do probówki, należy monitorować ruch wskazówki na monitorze absorbancji UV w trybie online. W momencie, gdy wskazówka zacznie się poruszać, należy włączyć przesuw zapisu, ustawiając prędkość na 60. Po osiągnięciu końca profilu polirybosomów należy odciąć dopływ Flo inert do probówki wirówki i zatrzymać przesuw zapisu na monitorze fluorescencji i absorbancji.

Wycofaj Flo inert z probówki wirówkowej do strzykawki, uruchamiając przepływ w kierunku odwrotnym z dużą prędkością, dbając o to, aby nie zassać sacharozy z probówki do strzykawki. Odkręć probówkę wirówkową od nakłuwacza, opuść igłę i wyjmij probówkę. Tutaj przedstawiono reprezentatywny zapis ekstraktu rybosomalnego przygotowanego z drożdży w obecności cykloheksymidu.

Wskazano piki absorbancji UV odpowiadające polirybosomom oraz rybosomom 60 s i 40 s. Właśnie przedstawiliśmy sposób przeprowadzania analizy polirybosomów. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pracować szybko, utrzymując próbki w niskiej temperaturze i chroniąc RNA przed degradacją.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.