Różnicowanie embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów

Ogólnym celem poniższego eksperymentu jest wygenerowanie prekursorów oligodendrocytów z embrionalnych komórek macierzystych poprzez serię etapów hodowli trwających 30 dni. Osiąga się to najpierw poprzez wytworzenie ciał embrionalnych z mysich komórek ES w celu zainicjowania różnicowania komórek. W drugim kroku ciała embrionalne są traktowane małymi cząsteczkami – kwasem retinowym i czystą morfiną – które indukują ukierunkowane różnicowanie komórek w ligand.

Prekursory cyte. W trzecim kroku, po dodatkowych 22 dniach, ciała zarodkowe są dysaggregowane do pojedynczych komórek. W hodowli około 80% komórek to OPC.

Następnie OPC pochodzące z MESC są transdukowane wirusami bao niosącymi podjednostkę NAV 1.2 w celu wygenerowania OPC zdolnych do generowania potencjałów czynnościowych; uzyskane wyniki, oparte na mikroskopii immunofluorescencyjnej i rejestracjach elektrofizjologicznych, wykazują ekspresję markera OPC oraz właściwości generowania potencjałów czynnościowych przez te OPC pochodzące z MESC. Cześć, jestem Pong Chiang z laboratorium dr. Ing w Katedrze Biologii Komórki i Anatomii Człowieka na University of California Davis. Jesteśmy również powiązani ze Shriners Hospital for Children of Northern California.

Cześć, jestem vial Raj, również z laboratorium Deng. Dzisiaj przedstawimy procedurę różnicowania mysich embrionalnych komórek macierzystych w prekursory oligodendrocytów. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby badać właściwości prekursorów oligodendrocytów pochodzących z embrionalnych komórek macierzystych w celu generowania komórek o lepszym potencjale terapeutycznym.

Zacznijmy. Dzisiaj z linii komórek macierzystych zarodkowych myszy OG2-GFP zostaną wygenerowane prekursorowe komórki oligodendrocytów, czyli OPC. Te embrionalne komórki macierzyste muszą być pasażowane co trzy dni, aby zachować ich żywotność przy optymalnej gęstości oraz zapobiec spontanicznej różnicowaniu. Pasażowanie.

Komórki ESS, gdy osiągną 70% konfluencji, w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Usunąć medium z hodowli. Przepłukać PBS i potraktować trypsyną za pomocą 2 mL podgrzanego roztworu.

Inkubować przez pięć minut w temperaturze 37 °C. Zatrzymać reakcję i resuspenderować komórki w czterech mililitrach pożywki MES. Przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 1000 rpm przez pięć minut.

Ponownie zawiesić w płytce z medium MESL, przenosząc 1/10 komórek na konfluentną warstwę napromieniowanych komórek karmicielek meth w medium komórkowym MES. Po trzech dniach komórki ES osiągają około 70% konfluencji i są gotowe do pasażowania lub zawieszenia w celu utworzenia ciał embrionalnych w celu indukcji ciał embrionalnych i rozpoczęcia różnicowania. Potraktować kolonie mysich komórek ES trypsyną jak poprzednio, a następnie ponownie zawiesić komórki w medium z zamiennikiem surowicy knockout lub medium KSR. Policzyć komórki w komorze Hemocytometru, a następnie rozcieńczyć zawiesinę w KSR.

Poziom medium dostosowany do stężenia 15 000 komórek na mililitr należy nanieść w ilości 3 ml do każdego dołka sześciodołkowej płytki hodowlanej o ultraniskiej adhezji. Komórki w zawiesinie należy inkubować w temperaturze 37 °C przez cztery dni. Co dwa dni należy całkowicie wymienić medium.

Zaczynając od czwartego dnia, należy codziennie wymieniać pożywkę. W czwartym dniu należy uzupełnić KSR o 0,2 µM kwasu retinowego, a w piątym dniu uzupełnić go zarówno kwasem retinowym, jak i 1 µM primor famine. W szóstym i siódmym dniu należy hodować ciała embrionalne w dwóch pożywkach uzupełnionych o 0,2 µM kwasu retinowego i 1 µM primor famine. Po ośmiu dniach hodowania większość ciał embrionalnych wykazuje ekspresję GFP i jest gotowa do dysagregacji przy użyciu trypsyny; następnie należy policzyć komórki w sposób opisany wcześniej.

Następnie resuspenduj je do stężenia 3,5 × 10⁵ komórek na ml. W medium OPC rozcieńcz trzy mililitry zawiesiny w medium OPC. Przy użyciu 60-milimetrowych naczyń pokrytych poliornityną, mniej więcej co tydzień komórki osiągną pełną konfluencję i będą wyglądać w ten sposób; przeprowadź pasaż komórek jak poprzednio, stosując trzy minutową trypsynizację.

30 dni po pierwotnej zawiesinie reanimacyjnej. W pożywce KSR komórki wykazują cechy prekursorowych komórek oligodendrocytów, aby generować OPCs zdolne do generowania potencjałów czynnościowych. Należy użyć OPCs pochodzących z mysich ESL, które osiągnęły od 50 do 70% konfluencji.

Wymień pożywkę na XPBS w celu wypłukania komórek. Aby wprowadzić podjednostkę alfa kanału sodowego sterowanego napięciem 1.2.

Używamy zestawu do kanałów sodowych back MAM. Mieszamy 1 mL składnika A back MAM z 4 mL 1x PBS. Usuwamy płuczkę PBS i dodajemy rozcieńczony składnik.

Inkubować w temperaturze 37°C przez dwie godziny. Zastąpić czynnik pamięci powrotnej medium OPC wzbogaconym o komponenty B i C, zgodnie z opisem w zestawie. Inkubować przez kolejne dwie godziny w temperaturze 37°C.

Po inkubacji należy zastąpić medium wzbogacone świeżym medium OPC. Po kolejnych 24 godzinach hodowli można przeprowadzić analizę kolców (spiking) w odniesieniu do pochodnych z ESL komórek OPC. EBS nie wykazują fluorescencji GFP.

Embryonalne ciała albuminowe (EBS) wykazują silną ekspresję GFP i są gotowe do hodowli po dysagregacji przez około 30 dni po pierwotnej resuspensji. W pożywce KSR większość komórek jest immunopozytywna w barwieniu na NG2, co jest zgodne z ekspresją GFP. Jednak w przeciwieństwie do OPC pochodzących z mózgu, te OPC pochodzące z komórek MES nie generują potencjałów czynnościowych, nawet gdy komórki zostaną zdepolaryzowane do 0 mV.

Po wprowadzeniu podjednostki NAV 1.2 za pomocą transdukcji wirusowej, te pochodzące z komórek MES OPC ulegają pobudzeniu i generują potencjały czynnościowe. Przedstawiliśmy właśnie sposób różnicowania embrionalnych komórek macierzystych myszy w OPC oraz generowania wykazujących aktywność elektryczną (spiking) OPC poprzez transdukcję wirusową. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o właściwym przechowywaniu kwasu retinowego, morfiny i FGF two oraz zawsze używać świeżych alikwotów; wszelkie pozostałości kwasu retinowego po użyciu należy zutylizować.

To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w eksperymentach.