Ładowanie ładunku na molekularne wahadła napędzane kinezyną
3 listopada 2010
Molekularne wahadła składające się z funkcjonalizowanych mikrotubul przesuwających się po przytwierdzonych do powierzchni białkach motorycznych kinezynach mogą służyć jako nanoskala system transportowy. W niniejszej pracy opisano montaż typowego systemu wahadłowego.
Ogólnym celem tej procedury jest załadowanie nanokulek na mikrotubule, które przesuwają się po powierzchni pokrytej motorymi kinazy. Osiąga się to najpierw poprzez pokrycie powierzchni szklanej komory przepływowej roztworem kazeiny. Drugim krokiem procedury jest adsorpcja białek motorycznych kinezyny na powierzchni komory przepływowej.
Trzecim krokiem procedury jest dodanie mikrotubul. Ostatnim etapem procedury jest dodanie cząsteczek streptawidyny, które zwiążą się z mikrotubulami, a następnie dodanie nanosfer. Nanosfery wiążą się z powierzchnią celi przepływowej, gdzie mogą zostać przechwycone przez mikrotubule.
Ostatecznie, za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej można zaobserwować, jak nanosfery są wychwytywane przez mikrotubule i transportowane po powierzchni. Cześć, nazywam się Elaine Jen Smith i reprezentuję laboratorium dr. Henry'ego Hessa oraz Katedrę Inżynierii Materiałowej na Uniwersytecie Florydy. Dzisiaj przedstawimy procedurę odwróconego testu motywności.
W naszym laboratorium stosujemy tę procedurę do badania załadunku ładunku na mikrotubule oraz ruchu czółenek molekularnych. Przejdźmy zatem do pracy. Przed rozpoczęciem tej procedury należy przygotować świeże roztwory zapasowe zgodnie z opisem zawartym w części pisemnej tego filmu.
Po przygotowaniu roztworów zapasowych należy rozpocząć przygotowanie mikrotubul, pipetując 25 µL roztworu wzrostowego do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 0,65 ml. Następnie dodać 6,25 µL roztworu wzrostowego do 20 µg liofilizowanej tubuliny biotynylowanej. Roztwór wymieszać w wirówce typu vortex i umieścić w kąpieli wodnej w temperaturze 37 °C na 30 minut w celu polimeryzacji; po inkubacji rozcieńczyć roztwór 100-krotnie w buforze Taxol i delikatnie wymieszać w wirówce typu vortex.
Roztwór ten służy do stabilizacji mikrotubul. Oznacz roztwór jako MT 100 i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Następnie przygotuj dziesięciokrotne rozcieńczenie MT 100 w buforze antyblaknącym i oznacz ten roztwór jako MT 1000.
Następnie przygotować motory kinezyny, rozcieńczając 20-krotnie roztwór kinezyny w buforze TP. Roztwór oznakować jako kinezyna 20 i przechowywać w lodzie. Na koniec przygotować roztwory streptawidyny oraz nanosfer.
Najpierw należy dodać streptawidynę znakowaną Alexa Fluor 5 6 8 do buforu Antifa, aby uzyskać stężenie 100 nano molars. Roztwór należy oznaczyć jako STV 100, a następnie nanosfery rozcieńczyć 5 000 krotnie w buforze Antifa i oznaczyć tę mieszaninę jako NS 5 000. Oba roztwory należy przechowywać w lodzie.
Po przygotowaniu roztworów do testu ładowania ładunku, należy zbudować komorę przepływową, używając szkiełka podstawowego i szkiełka nakrywki oddzielonych taśmą dwustronną. Najpierw przyklej dwa paski taśmy dwustronnej na krawędziach szkiełka podstawowego, pozostawiając przerwę o szerokości około jednego centymetra między paskami. Następnie połóż szkiełko nakrywkę na taśmie.
Naciśnij szkiełko nakrywkowe płaską krawędzią pęsety, aby stworzyć szczelne połączenie. Zbudowana komora przepływowa ma około dwóch centymetrów długości, jednego centymetra szerokości i 100 mikronów wysokości, a jej objętość wynosi około 20 µL. Aby rozpocząć montaż odwróconego układu analitycznego.
Umieść końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem nakrywnym a podstawką. Następnie wstrzyknij do komory przepływowej roztwór kazeiny o stężeniu 0,5 mg/mL. Powłoka ta na ściankach komory przepływowej pozwoli kinesynie zachować funkcjonalność po absorpcji.
Odczekaj pięć minut, aż roztwór kazeiny pokryje powierzchnię. Następnie zaabsorbuj kinezynę w komorze przepływowej, wprowadzając roztwór kinazy; roztwory wprowadza się do komór przepływowych, umieszczając końcówkę pipety pomiędzy szkiełkiem podstawowym a nakrywek. Następnie roztwór jest wstrzykiwany do komory przepływowej z jednej strony, podczas gdy jednocześnie jest on odciągany z drugiej strony.
Za pomocą papieru filtracyjnego odczekaj pięć minut, aż kinazyna zostanie wchłonięta. Następnie wprowadź mikrotubule do komory przepływowej, pipetując do niej roztwór MT 1000. Odczekaj pięć minut, aby mikrotubule osiadły i przyczepiły się do motorów kinazyny po ich związaniu z motorami kinazyny.
Pokryj mikrotubule fluorescencyjnym strep TTR, wprowadzając roztwór STV 100 do komory przepływowej. Odczekaj pięć minut, aby cząsteczki strep TTR związały się z mikrotubulami. Wypłucz nadmiar strep TTR, wprowadzając do komory przepływowej trzy porcje roztworu Antifa po 30 µL każda.
Na koniec wprowadź biotynilowane nanokulki polistyrenowe z fluoresceiną, pipetując roztwór NS 5 000 do celi przepływowej. Powierzchnia absorbuje je stacjonarnie. Nanokulki będą zderzać się z poruszającymi się mikrotubulami i osadzać się na nich.
W niniejszym doświadczeniu wykorzystano mikroskop fluorescencyjny eclipse TE 2000 U wyposażony w obiektyw imersyjny 100 x, system pozycjonowania X site, lampę one 20 oraz kamerę exon E-M-C-C-D. Najpierw nanieś jedną kroplę oleju imersyjnego na obiektyw. Następnie zamocuj celę przepływową na stoliku mikroskopu, korzystając z kostki filtrów trixy.
Ustaw ostrość na mikrotubule, a następnie przełącz na kostkę filtra fitzy, aby zobrazować nanosfery. Następnie otwórz program and or I exon i ustaw tryb akwizycji na kinetyczny. Użyj czasu ekspozycji 0,5 seconds, długości serii kinetycznej 20 oraz czasu cyklu kinetycznego six seconds.
Przełącz mikroskop z trybu obserwacji przez okular na tryb kamery i rozpocznij akwizycję obrazów. W przypadku pierwszych czterech obrazów użyj kostki trixi, aby zobrazować mikrotubule. W przypadku kolejnych 12 obrazów przełącz na kostkę filtra Fitz, aby uzyskać obrazy nanosfer.
Następnie należy powrócić do kostki filtrów trixi. W przypadku ostatnich czterech obrazów służących do obrazowania mikrotubul, są one obserwowane przy użyciu kostki filtrów Trissy, a następnie kostka filtrów zostaje przełączona na fite. Aby zwizualizować tutaj nanosfery, nanosfery transportowane przez mikrotubule zostały oznaczone strzałkami. Nie wszystkie nanosfery zostały wychwycone przez mikrotubule.
Następnie pokazano położenie nanosfer po 36 sekundach, co ujawnia, że uległy one przesunięciu. Po ponownym zobrazowaniu mikrotubul staje się jasne, że one również przemieściły się w polu widzenia. Obrazy te demonstrują, że nanosfery zostały przesunięte w wyniku transportu mikrotubularnego.
Właśnie pokazaliśmy, jak przeprowadzić odwrócony test motyliczności. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zmianie kostek filtrów podczas pozyskiwania obrazów, tak aby widoczne były zarówno mikrotubule, jak i nanosfery. To wszystko.
Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
Artykuł ten opisuje montaż molekularnego systemu wahadłowego z wykorzystaniem funkcjonalizowanych mikrotubul, które przesuwają się dzięki białkom motorycznym kinezynom. System ten służy jako nanoskalowy mechanizm transportowy, ułatwiający załadunek nanosphere na mikrotubule.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biofizyka
- Nanoskalowe systemy transportu
Wstęp
- Wahadła molekularne są niezbędne dla transportu wewnątrzkomórkowego.
- Mikrotubule i białka kinezyny odgrywają kluczową rolę w ruchach komórkowych.
- Zrozumienie tych układów może prowadzić do postępów w nanotechnologii.
- Funkcjonalizowane mikrotubule mogą zwiększyć wydajność transportu.
Cel badania
- Zaprezentowanie montażu systemu transportowego opartego na mikrotubulach.
- Zbadanie interakcji między nanosferami a mikrotubulami.
- Przedstawienie protokołu umożliwiającego badaczom replikację systemu.
Zastosowane metody
- Powlekanie szklanej celi przepływowej roztworem kazeiny.
- Adsorpcja białek motorycznych kinezyny na powierzchni celi przepływowej.
- Dodanie mikrotubul do układu.
- Wprowadzenie cząsteczek streptawidyny w celu związania ich z mikrotubulami oraz dodanie nanosfer.
Główne wyniki
- Nanosfery skutecznie wiążą się z powierzchnią komory przepływowej.
- Mikrotubule mogą wychwytywać związane nanosfery.
- Proces montażu jest powtarzalny i wydajny.
- System ten może być wykorzystany w różnych zastosowaniach związanych z transportem w skali nano.
Wnioski
- System transportowy oparty na mikrotubulach jest skuteczny w transporcie w nanoskali.
- Metodę tę można dostosować do różnych rodzajów ładunku.
- Dalsze badania mogą rozszerzyć zakres zastosowań tej technologii.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Napędzane kinezyną wahadła molekularne umożliwiają programowalny transport ładunków w skali nanometrycznej, stanowiąc platformę do kontrolowanego dostarczania i manipulowania biomolekułami w środowiskach syntetycznych i analitycznych. System ten wspiera wczesne etapy badań i rozwoju w sektorze biofarmaceutycznym, zapewniając modułowy, powtarzalny test do badania mechanizmów transportu aktywnego oraz oceny oddziaływań molekularnych. Jego przystosowalność do różnych rodzajów ładunków sprawia, że jest on narzędziem wielokrotnego użytku w procesach walidacji celów terapeutycznych oraz opracowywania testów analitycznych.
Zastosowania strategiczne w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia badanie ścieżek transportu molekularnego z wykorzystaniem określonych interakcji między ładunkiem a białkami motorowymi.
- Pozwala na funkcjonalną walidację przyłączania ładunku do mikrotubul za pośrednictwem kompleksu biotyna-streptawidyna.
- Zwiększa wiarygodność przewidywań w badaniach mechanistycznych procesów transportu wewnątrzkomórkowego.
Przesiewanie i opracowywanie testów
- Zapewnia zestandaryzowaną platformę do ładowania i śledzenia różnorodnych biotynilowanych ładunków, w tym DNA, przeciwciał i nanomateriałów.
- Dostarcza powtarzalne, ilościowe wyniki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej w celu analizy ruchu i przyłączania ładunku.
- Umożliwia skalowalność testu oraz ponowne wykorzystanie platformy do przesiewania związków lub biomolekuł.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Umożliwia adaptację dla ładunków istotnych w kontekście chorób, takich jak antygeny lub kwasy nukleinowe, w celu modelowania transportu w systemach syntetycznych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych po rozwój testów przedklinicznych dla zastosowań opartych na transporcie.
- Umożliwia predykcyjne ograniczanie ryzyka w strategiach dostarczania cząsteczek w środowiskach inżynieryjnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ten molekularny system wahadłowy integruje się z kontinuum od etapu odkrycia do badań przedklinicznych jako modułowy test do badań transportu, walidacji celów oraz przesiewania interakcji między ładunkiem a motorem.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących mechanizmów transportu aktywnego oraz specyficzności szlaków.
- Przesiewanie: Oferuje ilościowe i powtarzalne wyniki służące do oceny ładowania i przemieszczania ładunku.
- Analityka: Zapewnia pomiary oparte na fluorescencji w celu porównania stopnia przyłączenia ładunku i wydajności transportu.
- Badania translacyjne: Wspiera adaptację do ładunków istotnych w kontekście chorobowym lub terapeutycznym na potrzeby modelowania przedklinicznego.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Funkcjonuje jako wielokrotnego użytku platforma analityczna dla zróżnicowanych badań nad transportem molekularnym.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w badaniach nad transportem molekularnym i walidacją celów.
- Wartość operacyjna: Zapewnia ustandaryzowane, skalowalne i powtarzalne warunki analizy.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji go/no-go w zakresie rozwoju platform i analiz opartych na transporcie.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację strategii dostarczania i transportu molekularnego z uwzględnieniem ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu biochemii białek, mikroskopii fluorescencyjnej oraz mikrofabrykacji.
- Wymagany jest dostęp do systemów obrazowania fluorescencyjnego oraz narzędzi do montażu mikrofluidycznych cel przepływowych.
- Konieczna jest standaryzacja funkcjonalizacji ładunku oraz warunków analizy pomiędzy zespołami.
- Metoda umożliwia adaptację do różnych biotynylowanych ładunków i systemów modelowych.
- Ograniczono do syntetycznych środowisk in vitro; wyniki nie są bezpośrednio przekładalne na systemy in vivo bez dalszej walidacji.
