Izolowanie komórek macierzystych z miękkich tkanek mięśniowo-szkieletowych

Ogólnym celem niniejszej procedury jest izolacja dorosłych komórek macierzystych z tkanek miękkich układu mięśniowo-szkieletowego, takich jak mięśnie szkieletowe. Cel ten osiąga się poprzez pobranie biopsji tkanki miękkiej, jej oczyszczenie i drobne posiekanie. Drugim etapem procedury jest enzymatyczne trawienie tkanki.

Trzecim krokiem procedury jest izolacja komórek macierzystych poprzez powtarzane etapy wstępnego wysiewu. Ostatnim krokiem procedury jest identyfikacja wyizolowanych komórek macierzystych. Ostatecznie można uzyskać wyniki obrazujące morfologię i zachowanie komórkowe za pomocą immunofluorescencji, mikroskopii oraz/lub cytometrii przepływowej.

Witajcie, jestem y Lee z Laboratorium Patologii Molekularnej w Katedrze Chirurgii Ortopedycznej na Uniwersytecie w Pittsburghu. Dzisiaj pokażę Państwu, jak wyizolować dorosłą komórkę macierzystą z tkanek miękkich układu Mus skeletal, takich jak mięsień szkieletowy. Dzień dobry, jestem dr Johnny Ward.

Jestem profesorem w School of Medicine Uniwersytetu w Pittsburghu w Departamencie Chirurgii Ortopedycznej. Ściśle współpracuję z dr Young Lee nad procedurami izolacji różnych typów komórek macierzystych z mięśni szkieletowych i innych tkanek, takich jak tkanka tłuszczowa. Wykorzystujemy te procedury w naszym laboratorium do izolacji komórek macierzystych, głównie na potrzeby badań nad zastosowaniami w medycynie translacyjnej.

Przejdźmy do części praktycznej. Tkankami, z których można wyizolować komórki macierzyste, mogą być ścięgna oraz mięśnie szkieletowe pobrane z kości piszczelowej lub mięśni płaszczowatych kończyny tylnej myszy typu dzikiego. Po usunięciu resztek skóry i kości, umieść tkanki w naczyniu zawierającym zimny HBSS uzupełniony o 5%FBS.

Następnie umieść tkanki osobno w naczyniach powlekanych kolagenem zawierających zimny HBSS. Do zaprezentowania podstawowych procedur dysocjacji i trawienia tkanek wykorzystamy tkankę mięśnia szkieletowego. Za pomocą mikronozycerzy i/lub ostrzy skalpela posiekaj tkankę szkieletową na grubą papkę przed trawieniem enzymatycznym tkanek.

Zacznij od przeniesienia zawiesin tkankowych MIT do oddzielnych probówek o pojemności 15 mililitrów i wirowania przy prędkości około 3 500 RPM w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Usuń płukanie SANE, resuspendując w HBSS, i powtórz wirowanie. Po usunięciu supernatantu poddaj zawiesiny trawieniu, dodając 10 mililitrów podgrzanej wcześniej 0,2% kolagenazy.

Inkubuj typ 11 przez 60 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając probówkami ręcznie co 10 minut. Po zakończeniu 60-minutowej inkubacji odwiruj próbki, a następnie ponownie zawieś osady w 10 ml roztworu DYS space. Inkubuj przez 45 minut w temperaturze 37 °C, wstrząsając ręcznie co 10 minut. Po zakończeniu 45-minutowej inkubacji odwiruj i ponownie zawieś osady w 10 ml 0,2% roztworu trypsyny w buforze HBSS.

Zazwyczaj inkubujemy przez 15 do 20 minut w temperaturze 37°C, odwracając probówki co 10 minut, aż inkubacja zostanie zakończona. Gdy z tkanek uwolni się odpowiednia liczba pojedynczych komórek, jak pokazano tutaj, odwiruj otrzymane komórki i ponownie zawieś osad komórkowy w 5 mL pożywki do proliferacji PM. Rozbij zawiesinę komórkową, przepuszczając ekstrakt dwukrotnie przez igłę o rozmiarze 18 G, następnie raz przez igłę o rozmiarze 23 G i na koniec raz przez igłę o rozmiarze 27 G.

Na koniec przepuść ekstrakt komórkowy przez sitko komórkowe o oczkach 70 µm, aby rozpocząć technikę prepl. Odwiruj przygotowany właśnie ekstrakt komórkowy i resuspenduj osad w medium proliferacyjnym. Przenieś 5 mL mieszaniny komórek na flask T 25 pokryte kolagenem i oznacz jako PP1; inkubuj w temperaturze 37 °C w inkubatorze z 5% CO2 i nawilżoną atmosferą przez dwie godziny.

Po dwóch godzinach przenieść komórki nieprzylegające do nowej kolby T 25 powlekanej kolagenem i oznaczyć ją jako PP dwa. Do poprzedniej kolby T 25 oznaczonej jako PP jeden dodać 5 mL medium PM.

Obie kolby należy zwrócić do inkubatora na 24 godziny. Po 24 godzinach przenieść komórki nieprzytwierdzalne z kolby PP two do nowej kolby T 25 powleczonej kolagenem ENC i oznaczyć ją jako PP three. Do kolby oznaczonej jako PP two dodać pięć mililitrów pożywki proliferacyjnej.

Przenieś kolby z powrotem do inkubatora. Powtarzaj tę procedurę co 24 godziny aż do populacji PP sześć. Populacja komórek macierzystych zostaje utworzona.

Izolowane komórki PP six występują w bardzo małej liczbie i muszą być utrzymywane w bogatej w FBS pożywce proliferacyjnej. Pożywka ta musi być wymieniana codziennie. Należy jednak pamiętać, że większość komórek w hodowli PP six obumrze w ciągu kolejnych jednego do dwóch tygodni hodowli.

Duża, zdrowa populacja PP six jest zazwyczaj tworzona po dodatkowych jednym do dwóch tygodniach ekspansji. Należy również utrzymywać wszystkie pozostałe grupy komórek w zawiesinie, umożliwiając im proliferację i regularnie badając je za pomocą mikroskopu odwróconego. Wczesne komórki przylegające, które przytwierdzają się do kolb PP one oraz PP two, to głównie komórki włókniste.

Komórki, które przylegają do kolagenowanych kolb po dłuższym czasie, od 48 do 96 godzin. Pasaże PP3 i PP4 to głównie mioblasty. Podczas gdy komórki satelitarne mięśni są często obserwowane głównie w PP5, późniejsze komórki prepl po 96 godzinach lub później (PP6) są uznawane za dorosłe komórki macierzyste i wydają się małe, okrągłe i półprzezroczyste.

Na początku procesu izolacji można je dodatkowo scharakteryzować za pomocą immunohistochemii w celu oceny ekspresji markerów komórek macierzystych, takich jak antygen komórek macierzystych 1 oraz CDC 34. Właśnie zaprezentowaliśmy sposób izolacji komórek macierzystych z szpiku kostnego myszy. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby przez cały czas zachowywać sterylność.

Po wyizolowaniu komórek macierzystych należy pamiętać o ich hodowli przy niskiej gęstości, aby zachować ich charakter charakterystyczny dla komórek macierzystych. To wszystko. Dziękujemy za oglądanie i życzymy powodzenia w pracy oraz sukcesów w zastosowaniu tej metody w Państwa eksperymentach.

Dziękujemy.