Izolacja, hodowla i analiza migracji ludzkich limfocytów T in vitro

Migracja limfocytów T zachodzi podczas homingu do narządów limfatycznych, opuszczania naczyń krwionośnych i wnikania do tkanek obwodowych. Proces ten obejmuje oddziaływania adhezyjne powierzchni limfocytów T z innymi komórkami. Aby zbadać to zjawisko in vitro, limfocyty T człowieka są izolowane, hodowane i nanoszone na płytki do hodowli tkanek pokryte białkiem adhezyjnym.

ICAM-1 oraz chemokina SDF-1. Następnie można pozyskać i przeanalizować obrazy migracji limfocytów T. Cześć, jestem Craig LeFort z laboratorium Minsu Kim w Centrum Biologii i Immunologii Szczepionek na Uniwersytecie w Rochester.

Dzisiaj przedstawimy procedurę izolacji i hodowli ludzkich limfocytów T oraz analizę ich migracji in vitro. W naszym laboratorium wykorzystujemy ten test do badania roli integryn i migracji limfocytów T. Główną integryną w limfocytach T jest antygen LFA-1 (lymphocyte function-associated antigen 1).

Specyficznymi ligandami dla LFA-1 są cząsteczki ICAM, takie jak ICAM-1. Ponadto do migracji limfocytów T wymagany jest sygnał kinazowy, który zapewnia zarówno sygnał kierunkowy, jak i aktywację integryn. W naszym teście jako substraty dla migracji limfocytów T wykorzystujemy ludzkie ICAM-1 oraz CXCL12 lub SDF-1.

Zacznijmy zatem. Po pobraniu krwi ludzkiej od zdrowego dawcy należy odstawić krew do ochłodzenia do temperatury pokojowej. Trwa to około 30 minut.

Po schłodzeniu krwi należy ostrożnie nalać pipetą 3 mL medium do gradientowej separacji gęstości polimorfocytów w temperaturze pokojowej do 8 mL okrągłodennej probówki polistyrenowej. Następnie należy ostrożnie dodać 3 mL krwi pełnej na wierzch. Ważne jest, aby uniknąć wymieszania warstw.

Umieść probówki w wirówce i wiruj z prędkością 500 G przez 45 minut. Po wirowaniu w temperaturze pokojowej mononuklearne komórki krwi obwodowej (PBMC) zostają oddzielone od pozostałych składników krwi. Warstwa PBMC widoczna jest jako pierwszy mętny pas od góry.

W warunkach sterylnych ostrożnie usuń i odrzuć przejrzystą, żółtą fazę górną. Następnie za pomocą mikropipety P 1000 przenieś warstwę PBMC do nowej probówki stożkowej. Przemyj PBMC dwukrotnie w PBS, wirując komórki z prędkością 500 G przez pięć minut.

Po każdym praniu nadsącz będzie w pewnym stopniu mętny. Ponownie zawiesić komórki w 20 milliliters pożywki RPMI 1640 zawierającej 10% FBS, 1% penicyliny i streptomycyny oraz one microgram per milliliter fytohemaglutyniny (PHA). Inkubacja w obecności PHA indukuje aktywację i ekspansję limfocytów T.

Za pomocą pipety przenieś pbmc do kolby hodowlanej T 75. Następnie inkubuj w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide przez okres od 1 do 24 godzin. Krok ten pozwala na oddzielenie monocytów, które przylegają do powierzchni kolby, od limfocytów pozostających w zawiesinie.

Po inkubacji ostrożnie usuń całą pożywkę zawierającą głównie limfocyty i przenieś ją do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Wiruj przy 500 G przez pięć minut. Odwirowany osad komórkowy wypłucz w RPMI 1640 i przenieś komórki do nowej kolby T 75 zawierającej 25 ml RPMI 1640 z FBS, penicyliną, streptomycyną i PHA; inkubuj w 37 °C.

Po 24 godzinach wzrostu może być konieczne dodanie od 15 do 20 mililitrów świeżej pożywki i przeniesienie hodowli do większej kolby T 175. Kontynuuj inkubację przez dwa lub trzy dni. Jeśli wstępna inkubacja PBMC trwała przez noc, to po trzech dniach za pomocą pipety usuń pożywkę zawierającą zawieszone limfocyty i przenieś ją do probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów, a następnie wiruj przy 500 G przez pięć minut.

Reese zebrał osad komórkowy i przeniósł komórki do nowego naczynia T 75 zawierającego 25 mililitrów RPMI 1640 z FBS, penicyliną, streptomycyną oraz ludzkim IL 2 lub IL 15, a następnie umieścił komórki w inkubatorze. W przypadku rozpoczęcia hodowli w kolbie T 75, kultura będzie wymagała namnożenia i przeniesienia do kolby T 175.

Po jednym lub dwóch dniach hodować limfocyty przez łącznie od czterech do siedmiu dni. Na jeden dzień przed testem migracji pokryć szalkę z szklanym dnem o grubości 0,17 mm białkiem A lub G w stężeniu 20 µg/mL w PBS i inkubować przez noc w temperaturze 4 °C. Następnego dnia dokładnie wypłukać szalkę za pomocą PBS, a następnie dodać do niej roztwór ICAM-1 FC oraz ludzkiego SDF-1 w PBS.

Inkubować przez cztery godziny w temperaturze pokojowej w celu unieruchomienia cząsteczek. Określić gęstość hodowlanych komórek za pomocą hematocytometru. Następnie przemyć limfocyty dwukrotnie PBS i resuspender je w jednym mililitrze pożywki L 15 zawierającej D-glukozę. Po inkubacji dokładnie przemyć szalkę pokrytą ICAM-1 FC i SDF-1 za pomocą PBS. Przenieść limfocyty T w jednym mililitrze pożywki na szalkę; w celu uzyskania gęstości komórek odpowiedniej do analizy migracji, na jedną szalkę należy użyć około 2–5 × 10⁵ komórek.

Aby uzyskać obrazy migracji komórek, należy umieścić szalkę na stoliku mikroskopu w środowisku o kontrolowanej temperaturze, np. w komorze grzewczej w 37 °C. W menu ustawień obrazu należy otworzyć oprogramowanie NIS elements. Jako tryb obrazowania na żywo oraz przechwytywania obrazów należy wybrać binning 2x2.

Przejdź do menu aplikacji i wybierz opcję definiowania oraz uruchamiania eksperymentu. Określ odstęp czasu między obrazami oraz całkowity czas trwania. Aby rozpocząć sekwencję przechwytywania obrazów, naciśnij przycisk uruchom, aby rozpocząć akwizycję obrazów zgodnie z ustawieniami.

Parametry migracji, takie jak prędkość, długość ścieżki i przemieszczenie, można określić ilościowo za pomocą pakietów oprogramowania, takich jak Image J Auto Quant lub veloc. Aby wygenerować wykres typu pajęczyna, należy zebrać współrzędne XY dla każdej komórki i punktu czasowego, a następnie nanieść je na wykres, przyjmując dla każdej komórki wspólny punkt startowy w punkcie początku układu współrzędnych. Przedstawione tutaj limfocyty T były hodowane na podłożu z ICAM i SDF-1 oraz obrazowane co 10 sekund przez 30 minut.

Film ten przedstawia losową migrację limfocytów T z prędkością około 15 mikronów na minutę, z wykorzystaniem współrzędnych XYT dla każdej komórki. Wybrano losowo 15 komórek i narysowano ich trajektorie ze wspólnym punktem startowym w początku układu współrzędnych. Porównanie wykresów typu „pajęczyna” (spiderweb plots) pozwala na szybką wizualizację różnic w migracji pomiędzy różnymi warunkami eksperymentalnymi.

Wykresy migracji limfocytów T w warunkach kontrolnych przedstawiono po lewej stronie, natomiast wykresy migracji limfocytów T w obecności blokującego przeciwciała przeciwko ligandowi LFA one przedstawiono po prawej stronie. Dane te dowodzą, że limfocyty T wykorzystują integrynę LFA one do migracji na podłożu ICAM one. W trakcie procedury zaprezentowaliśmy sposób przeprowadzenia testu migracji z wykorzystaniem hodowanych ludzkich limfocytów T.

Należy pamiętać o dodaniu odpowiedniej liczby komórek do naczynia pokrytego ICAM-1, aby ułatwić śledzenie komórek oraz analizę migracji. To wszystko. Dziękujemy za uwagę i życzymy powodzenia w przeprowadzaniu eksperymentów.