Porównawcze badanie in vivo przymiotności adiuwantowej gp96 u żaby Xenopus laevis

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zbadanie ewolucyjnej konserwacji zdolności białka szoku cieplnego GP96 do promowania swoistych dla antygenu odpowiedzi limfocytów T CD8 u żaby Xenopus laevis. Jest to realizowane poprzez wstępne pobranie leukocytów otrzewnowych za pomocą płukania otrzewnej. Drugim krokiem procedury jest pulsowanie leukocytów otrzewnowych białkiem GP96 pochodzącym z guza, które pełni rolę chaperonu dla antygenów mniejszościowych i nowotworowych, po inkubacji i przemyciach.

Leukocyty otrzewnowe są transferowane adoptywnie poprzez wstrzyknięcie do jamy otrzewnowej u naiwnych żab w celu uwrażliwienia tych zwierząt na antygeny nowotworowe lub mniejsze antygeny histocompatybilności. Trzecim krokiem procedury jest wykonanie przeszczepu skóry lub wywołanie wyzwania nowotworowego u uwrażliwionych żab oraz monitorowanie momentu odrzucenia przeszczepu skóry lub pojawienia się nowotworu. Ostatnim etapem procedury jest pobranie krwi obwodowej w celu charakterystyki limfocytów T zaangażowanych w odpowiedzi przeciwnowotworową oraz odrzucanie przeszczepu skóry.

Ostatecznie można uzyskać wyniki wykazujące znaczne przyspieszenie odrzucenia przeszczepu skóry, a także opóźnienie w pojawieniu się guza u żab uwrażliwionych za pomocą GP 96 odpowiednio w testach przeszczepiania skóry i testach wywoływania nowotworów. Cześć, jestem Christina Koska z laboratorium dr Jacque Robert w Katedrze Mikrobiologii i Immunologii w University of Rochester Medical Center. Jestem Tanya Cruz, również z laboratorium dr Rivera.

Dzisiaj przedstawimy procedurę przygotowania żab klonalnych poprzez adopcyjny transfer leukocytów otrzewnych, a następnie testy przeszczepiania skóry i transplantacji guzów. Dodatkowo pokażemy, jak pobierać krew obwodową od tych zwierząt. Stosujemy tę procedurę w naszym laboratorium, aby zbadać zdolność białka szoku cieplnego GP 96 do promowania antygenowo swoistych komórek CDAT u Xenopus laevis, a także aby zbadać zaangażowane w ten proces typy komórek.

Zacznijmy zatem. Żaby wykorzystane w naszych eksperymentach to klony izogeniczne z naszej kolonii hodowlanej na Uniwersytecie w Rochester. Aby wywołać migrację leukocytów otrzewnych (pls) w celu ich pobrania, należy użyć igły 25G 5/8 do wstrzyknięcia znieczulonej żabie do jamy otrzewnej preparatu z zabitym termicznie E. coli. Trzy dni po iniekcji leukocyty otrzewne są pobierane za pomocą płukania otrzewnej.

Aby rozpocząć tę procedurę, należy zdezynfekować brzuch znieczulonej żaby niewielką ilością 70% ethanol. Następnie, używając igły o rozmiarze 18 G i długości 1,5, należy wstrzyknąć do jamy otrzewnowej pięć mililitrów sterylnego roztworu soli fosforanowej dla płazów (PBS) podgrzanego do temperatury pokojowej. Po wyjęciu igły należy delikatnie masować żabę przez minutę, aby zapewnić równomierne rozprowadzenie wstrzykniętego buforu w płynie w jamie ciała.

Następnie wprowadź nową igłę 18 G o długości 1,5 bez strzykawki do jamy brzusznej żaby. Unikając naczyń krwionośnych, zbierz płyn otrzewnowy, który będzie ściekał z nasady igły do czystej probówki stożkowej o pojemności 50 mililitrów. Po pobraniu pls należy upewnić się, że odzyskano jak największą część początkowej objętości iniekcji.

Umieść żabę w pojemniku z płytką wodą, aż się obudzi, po czym można ją przenieść z powrotem do klatki. Po zebraniu pls odwiruj je w wirówce przy 1000 RPM przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsius, usuń sup, natant i resus. Resuspenduj pls w zimnym A PBS.

Przenieś ZAWIESINĘ plazmy do 1,5 mililitrowej probówki typu mikro. Aby pulsować PLS za pomocą GP 96, dodaj odpowiednią ilość GP 96 do plazmy i wymieszaj poprzez pipetowanie. Inkubuj na lodzie przez jedną godzinę; po upływie godziny.

Wirować komórki z prędkością 14 000 RPM przez jedną minutę. W celu usunięcia niezwiązanego GP 96 odpirować nadsącz. Dodać zimny A PBS i resuspendować.

Ponownie odwiruj PLS w wirówce. Przemyj S zimnym A-P-B-S-A łącznie trzy razy, aby upewnić się, że po ostatnim przemyciu nie pozostało żadne G 96. Ponownie zawieś pulsacyjne pls w stężeniu 5×10⁵ pls na 300 µL PBS w celu adoptywnego transferu pls do naiwnych biorców LG six.

Wstrzyknij do jam ciała 300 µL pulsacyjnego pls na każde zwierzę. Żaby muszą zostać przygotowane co najmniej trzy dni przed eksperymentami z przeszczepem skóry lub wyzwaniem nowotworowym, które zostaną przedstawione w dalszej części. Skórę do przeszczepu pobiera się od znieczulonej żaby dawcy LG 15.

Za pomocą nożyczek wyciąć i usunąć mały fragment skóry brzusznej, która ma srebrzysty wygląd. Ze względu na obecność ARI należy uważać na cztery pigmentowe komórki podczas manipulowania przeszczepem. Kluczowe jest ograniczenie manipulacji tkanką do minimum, ponieważ może to spowodować uszkodzenie przeszczepu.

Bardzo delikatnie chwyć skórę pęsetą i umieść ją w szalce Petriego zawierającej zimny A PBS. Utrzymuj szalkę Petriego w odpowiednich warunkach. Umieść skórę na nowym szkiełku przedmiotowym i za pomocą żyletki wytnij pojedyncze przeszczepy w kawałki o wymiarach 5 mm na 5 mm.

Przechowywać fragmenty w PBS w lodzie do czasu przeszczepienia skóry na żabę biorcę LG six. Najpierw wykonać niewielkie nacięcie na skórze grzbietowej znieczulonego biorcy. Następnie wprowadzić przeszczep o wymiarach 5 mm na 5 mm pod skórę, stroną srebrzystą do góry.

Należy odnotować ślady po nożyczkach i pincetach na przeszczepach, ponieważ nie są one uznawane za odrzucenie przeszczepu. Gdy ocena rozpocznie się 24 godziny później, z miejsca przeszczepu należy usunąć fragment nakładającej się skóry biorcy. Za pomocą nożyczek należy wyciąć otwór wokół przeszczepu, aby umożliwić jego swobodną wizualizację.

Należy uważać, aby nie dotykać skóry dawcy i nie doprowadzić do krwawienia. Natychmiast rozpocząć dokumentowanie przeszczepu, wykonując szkic. Przeszczep skóry.

Odrzucenie określa się na podstawie procentowego stopnia zniszczenia aridolu na przeszczepionej skórze. Przeszczep należy sprawdzać co dwa do trzech dni pod mikroskopem stereoskopowym. Komórki nowotworowe przygotowuje się do transplantacji poprzez resuspensję, zawieszając je w pożywce do hodowli nowotworu w zagęszczeniu 5 × 10⁵ komórek na 300 µL.

Przeszczep komórki poprzez wstrzyknięcie podskórne po jednej stronie grzbietu zwierzęcia. Każdej żabie wstrzykuje się 5 × 10⁵ komórek w objętości 300 µL. Wzrost guza rozpocznie się w ciągu dwóch do trzech tygodni po indukowaniu nowotworu.

Należy odnotować początkowy wygląd guza. Za pomocą suwmiarki należy zmierzyć wymiary guza i co dwa do trzech dni zapisywać jego objętość przed pobraniem leukocytów z krwi żaby. Igły szklane należy przygotować poprzez wyciąganie rurek kapilarnych nad płomieniem.

Po zaostrzeniu końcówki pipety pod mikroskopem stereo, należy połączyć pipetę z plastikową rurką do aspiracji. Aby rozpocząć pobieranie krwi, należy naciąć skórę nad tylną stopą znieczulonej żaby, aby odsłonić grzbietową żyłę kostki. Szklaną igłę należy napełnić od 1 do 2 ml lodowatego roztworu PBS z dodatkiem heparyny.

Następnie należy wprowadzić szklaną igłę do żyły i rozpocząć pobieranie krwi, powoli aspirując ją ustami. Od jednej żaby o przeciętnej wielkości można uzyskać od 1 do 2 ml krwi. Małego nacięcia na nodze żaby nie trzeba zszywać.

Rana zagoi się w ciągu tygodnia. Przedstawiono tutaj wyniki analizy stereomikroskopowej odrzucenia przeszczepu skóry 12 dni po transplantacji. U żaby LG six z klonu, która otrzymała przeszczep skóry od donora LG six o identycznym MHC, nie stwierdzono odrzutu.

Gwiazdka oznacza pęsetę markerową, a nie odrzucenie przeszczepu. W przeciwieństwie do tego, u klonowanej żaby LG six, która otrzymała przeszczep skóry od niedopasowanego pod względem MHC dawcy z linii outbred, obserwuje się 80% odrzucenia. Na obu zdjęciach strzałki wskazują srebrzyste, irydoforyczne komórki pigmentowe, które oznaczają zdrowe, nieodrzucone tkanki przeszczepione.

W kolejnym eksperymencie komórki LG 15 zostały poddane impulsom elektrycznym z użyciem albo PBS jako kontroli negatywnej, rekombinowanego białka GP 96 oczyszczonego z hodowli e coli, albo białka GP 96 oczyszczonego z komórek tkanki guza 15 zero. Następnie zostały one adoptywnie przeniesione do dorosłych biorców LG 15, a trzy dni później żywe komórki guza 15 zero wszczepiono drogą podskórną. Monitorowano guzy, które pojawiły się po określonej liczbie dni od wyzwania, a wielkość guza mierzono okresowo. Na tych wykresach każda krzywa przedstawia kinetykę wzrostu guza u jednej żaby. Wyniki pokazują, że zwierzęta poddane primingowi z użyciem 0,5 lub 1 µg GP 96 wykazały znaczące opóźnienie w pojawieniu się guza w porównaniu z grupami kontrolnymi. Zatem GP 96 ułatwia prezentację krzyżową antygenów nowotworowych u Xenopus.

Właśnie zaprezentowaliśmy sposób badania zdolności GP 96 do prezentowania zarówno antygenów mniejszościowych, jak i nowotworowych u żaby xap lavis za pomocą testów przeszczepu skóry i transplantacji guza. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby nie pobierać płynu z płukania otrzewnej w przypadku uszkodzenia naczynia krwionośnego, ponieważ większość komórek stanowiłyby wówczas erytrocyty, a nie makrofagi. Ważne jest również, aby podczas manipulowania przeszczepem skóry nie ściskać tkanki pęsetą, aby uniknąć jej uszkodzenia.

To wszystko. Dziękujemy za umycie sprzętu i życzymy powodzenia w eksperymentach.